Production acellulaire de protéoliposomes pour l’analyse fonctionnelle et le développement d’anticorps ciblant les protéines membranaires

Toutes les protéines membranaires sont des cibles importantes dans la découverte de médicaments. La production à grande échelle de protéines membranaires reste un goulot d’étranglement pour la réalisation d’études biochimiques, biophysiques et structurelles sur les protéines membranaires. Cette méthode peut être utilisée pour synthétiser efficacement des protéines membranaires in vitro et pour préparer des protéoliposomes purifiés en peu de temps avec un taux de réussite élevé.

Après avoir ajouté les réactifs appropriés, y compris le plasmide d’expression acellulaire pour générer un mélange de réaction de transcription, mélangez le contenu du tube par inversion douce ou en tapotant et effectuez un essorage rapide dans une microcentrifugeuse. Après le spin, incubez le mélange de réaction de transcription pendant six heures à 37 degrés Celsius, suivi d’un mélange et d’une étape de spin down. Pour préparer le tampon de traduction, diluez la solution mère dans de l’eau fraîche ultrapure.

Pour une traduction à petite échelle, utilisez des gobelets de dialyse de 100 microlitres lavés avec de l’eau ultra-pure pour éliminer le glycérol de la membrane de dialyse. Ajoutez un millilitre d’eau ultrapure dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et insérez une tasse de dialyse à petite échelle dans le tube. Ajoutez ensuite 500 microlitres d’eau ultra-pure dans la tasse pour une incubation de 30 minutes à température ambiante.

Pour préparer les liposomes, transférez une solution lipidique contenant 50 milligrammes de lipides dans une fiole d’évaporation. Placez le ballon dans un évaporateur rotatif pour évaporer le solvant. Lorsqu’une couche mince et uniformément répartie de lipides a été générée à la surface du fond du flacon, transférez le ballon dans un dessiccateur sous vide sous pression négative pendant la nuit pour éliminer complètement le solvant.

Le lendemain matin, retirez les flacons du dessiccateur et vérifiez la fine pellicule de lipides. Ajoutez un millilitre de tampon de traduction dans le ballon et tournez le ballon pour étaler le tampon sur la fine pellicule lipidique. Après cinq minutes, sonisez le ballon en changeant l’angle de temps en temps pour permettre à la solution d’entrer en contact avec toute la surface du film lipidique.

Arrêtez la sonication lorsque le lipide est complètement retiré du ballon et que la suspension des liposomes devient uniforme. Transférez ensuite la suspension de liposomes dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Avant d’effectuer une traduction in-vitro des protéines, faites flotter un tube d’extrait de germe de blé stocké à moins 80 degrés sur de l’eau à température ambiante pendant quelques minutes pour décongeler rapidement le matériau.

Lors de la décongélation de l’extrait, mélangez immédiatement le contenu du tube par inversion douce. Ensuite, tournez vers le bas et placez le tube sur de la glace. Ajoutez l’extrait de germe de blé, l’ARNm et les liposomes pour générer un mélange de réaction de traduction.

Mélangez le contenu du tube par inversion douce ou en tapotant et effectuez une rotation rapide dans une microcentrifugeuse. Pour effectuer une traduction in-vitro des protéines à petite échelle, retirez l’eau de la tasse et du tube de dialyse à petite échelle et ajoutez un millilitre de tampon de traduction dans le tube et 300 microlitres dans la tasse. Prenez 60 microlitres de mélange de réaction de traduction.

Insérez l’embout de la pipette dans le tampon de traduction de la coupelle de dialyse. Injectez ensuite le mélange lentement et doucement. Le mélange réactionnel de densité plus élevée coule spontanément au fond de la tasse et forme une couche.

Couvrez la tasse avec un couvercle pour éviter l’évaporation. Pour effectuer une traduction à grande échelle, ajoutez 22 millilitres de tampon de traduction dans un tube de 25 millilitres et placez une coupelle de dialyse de deux millilitres dans le tube. Ajoutez deux millilitres de tampon de traduction dans la coupelle de dialyse.

Prenez 500 microlitres du mélange de réaction de traduction, injectez lentement et doucement le mélange dans le tampon de traduction dans la tasse. Incuber les réactions pendant 24 heures à 15 degrés Celsius. Le lendemain, mélangez soigneusement la réaction dans la coupelle de dialyse par pipetage et transférez les suspensions de protéoliposomes bruts dans de nouveaux tubes.

Pour purifier les protéoliposomes, sédimentez les protéoliposomes dans les suspensions brutes par centrification. Ensuite, lavez le protéoliposome en le remettant en suspension trois fois dans le volume approprié de tampon PBS glacé. Après le lavage, remettez soigneusement en suspension les pastilles de protéoliposomes dans un petit volume de PBS et mesurez le volume de suspension à l’aide d’une micropipette.

Ajoutez ensuite du PBS pour régler le volume de suspension. Transférez chaque suspension dans un nouveau micro-tube. Pour mettre en place une analyse de page SDS, ajoutez 70 microlitres d’eau et 40 microlitres de tampon d’échantillon de page SDS concentré en trois temps à 10 microlitres de chaque suspension de protéoliposomes.

Installez un gel de page SDS de 5 à 20 % de gradient dans une chambre d’électrophorèse. Chargez le gel avec deux microlitres du marqueur de taille de protéine trois, six et 12 microlitres de chaque échantillon de protéoliposome et 10 microlitres d’étalons d’albumine sérique bovine. Après avoir chargé les échantillons, exécutez l’électrophorèse suivie d’une coloration du gel avec le colorant Coomassie Brilliant Blue.

Enfin, décolorez le gel à l’eau chaude en le secouant doucement et scannez l’image du gel. En utilisant ce protocole comme démontré, une variété de protéines membranaires avec trois hélices transmembranaires ou plus peut être facilement produite sous forme de protéoliposomes en peu de temps. Dans cette méthode de dialyse bicouche, un approvisionnement continu en substrats et l’élimination du sous-produit peuvent être effectués efficacement en haut et en bas du mélange réactionnel sur une longue période de temps, ce qui conduit à une excellente efficacité de traduction.

La méthode de dialyse bicouche permet d’augmenter de quatre à 10 fois la productivité par rapport à l’utilisation de la méthode bicouche ou de la dialyse seule. La collecte des protéoliposomes synthétisés par centrification et leur purification partielle avec un tampon de lavage raccourcit considérablement le processus de purification des protéines membranaires. Ce système acellulaire est facile à manipuler et hautement évolutif.

Il peut également être utilisé pour produire des protéines mémoires qui sont difficiles à exprimer par d’autres méthodes. Cette méthode est extrêmement utile pour les investigations et les expériences qui utilisent ou ciblent des protéines membranaires telles que la protéine antimembranaire, la production d’anticorps, SPR, Elisa et AlphaScreen.