Procédures de transplantation de moelle osseuse chez la souris pour étudier l’hématopoïèse clonale
26 mai 2021
Nous décrivons trois méthodes de transplantation de moelle (BMT) : BMT avec l’irradiation de tout-corps, BMT avec l’irradiation blindée, et méthode de BMT sans le pré-conditionnement (BMT adoptif) pour l’étude de l’hématopoïèse clonale dans des modèles murins.
Notre protocole aidera les chercheurs à comprendre les effets physiologiques de trois méthodes différentes de transplantation de moelle osseuse et comment elles affectent les résultats expérimentaux dans l’hématopoïèse clonale. La transplantation de moelle osseuse par rayonnement corporel total peut avoir un impact négatif sur les organes cardiovasculaires et modifier la pathogenèse de la maladie. Ainsi, notre laboratoire a développé deux méthodes alternatives pour minimiser ou éviter les effets secondaires possibles.
La démonstration des procédures sera Eunbee Park, une étudiante diplômée, et Megan Evans, une boursière postdoctorale, toutes deux de mon laboratoire Pour le blindage du thorax et de l’abdomen, placez le plateau réglable et l’irradiateur à rayons X à la bonne distance pour obtenir une irradiation uniforme. Et placez les souris anesthésiées sur une plaque à led plate inversée les unes aux autres en décubitus dorsal. Fixez les pattes à la plaque avec du ruban adhésif et placez le blindage led de sorte que l’extrémité inférieure s’aligne avec l’os du xiphisternum et que l’extrémité supérieure du bouclier en plomb se trouve près du thymus.
Après le blindage, placez les souris dans l’irradiateur et exposez les animaux à deux fractions grises d’irradiation de 5,5 secondes séparées par un intervalle de quatre à 24 heures. Pour le blindage de la tête, collez soigneusement les quatre pattes de la souris sur l’abdomen. Placez la souris dans un dispositif de retenue conique et faites glisser le dispositif de retenue dans la fente à l’intérieur du bouclier de plomb afin que la tête et les oreilles de la souris soient complètement couvertes, laissant le reste du corps de la souris exposé à un rayonnement.
Après le blindage, placez les souris dans l’irradiateur et exposez les animaux à 5,5 fractions grises d’un rayonnement séparées par un intervalle de quatre à 24 heures. Après chaque radiothérapie, placez les souris anesthésiées dans une cage sur un tapis chauffé avec surveillance jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies. Pour isoler les os, désinfectez la peau de la souris donneuse avec de l’éthanol à 70% et faites une petite incision transversale de la peau sous la cage thoracique.
Tenir la peau fermement de chaque côté de l’incision, déchirer dans des directions opposées vers la tête et les pieds et peler la peau de tous les membres. Couper sur les épaules et les articulations du coude, et utiliser une lingette de laboratoire pour enlever les muscles attachés et les tissus conjonctifs de l’huméri. Disloquer soigneusement les articulations entre le fémur et les os de la hanche.
Et utilisez des ciseaux émoussés pour couper le long des têtes fémorales pour détacher les jambes. Couper sur l’articulation du genou, pour séparer le fémur et le tibia. Et utilisez des lingettes de laboratoire pour enlever soigneusement les muscles attachés et les tissus conjonctifs des os.
Ensuite, tirez les os de souris du même génotype dans des tubes coniques individuels de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS stérile glacé sur de la glace. Pour isoler les cellules de la moelle osseuse dans une armoire de classe de biosécurité deux, utilisez une aiguille de calibre 18 pour faire un petit trou dans le fond d’un microtube stérile de 500 microlitres. Et placez le tube dans un tube micro-centrifugeur stérile individuel de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de PBS stérile glacé.
Lorsque tous les tubes ont été préparés, retirez le PBS du tube contenant les os isolés et transférez les os sur une boîte de culture cellulaire stérile de 100 millimètres. Utilisez une pince fine et de petits ciseaux pour retirer soigneusement l’épiphyse des extrémités de chaque os, et placez jusqu’à six os dans chaque tube de microlitre 500. Lorsque tous les os ont été coupés, extrayez les cellules de la moelle osseuse par centrifugation.
Si tout le contenu de la moelle osseuse a été enlevé, les os doivent apparaître blancs et translucides avec une pastille rouge relativement grande au fond du tube micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre. Pour la greffe de cellules de moelle osseuse, diluer les cellules de moelle osseuse isolées dans des milieux RPMI sans sérum et charger 200 microlitres de la suspension cellulaire dans une seringue à insuline de 0,5 millilitre par souris à injecter. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, injectez lentement le volume entier de cellules dans la veine rétro orbitale de chaque animal récepteur anesthésié.
Ensuite, placez une goutte de proparacaine sur l’œil pour soulager la douleur. Et permettre à la souris de reprendre conscience tout en étant surveillée. Comparer l’effet de trois méthodes de préconditionnement BMT sur l’engraftment de cellules de distributeur.
Les fractions des cellules de distributeur dans le sang périphérique et le tissu de coeur ont été analysées par l’écoulement cytometry à un mois de poteau BMT. Dans cette analyse représentative, dans le sang périphérique des souris réceptrices qui ont reçu l’irradiation totale de corps, les monocytes, les neutrophiles et les cellules de B ont été en grande partie ablated et remplacés par la progéniture des cellules dérivées de moelle de distributeur. En outre, les populations cardiaques résidentes de monocyte et de neutrophiles de destinataire ont été presque complètement remplacées par les cellules dérivées de distributeur.
Dans le groupe partiellement blindé d’irradiation, le remplacement dérivé de cellules immunitaires cardiaques de distributeur était modeste. Les cellules réceptrices de moelle osseuse de souris dans les régions blindées ont probablement contribué au niveau inférieur de reconstitution de sang périphérique comparée aux souris qui ont reçu l’irradiation totale de corps. Dans le groupe sans préconditionnement de BMT, les cellules dérivées de donateur étaient discernables dans le sang périphérique et les coeurs des souris réceptrices à quatre semaines de poteau BMT.
En outre, les cellules donneuses déficientes en Tet2 se sont progressivement développées au fil du temps. En comparaison, les souris réceptrices greffées avec le type sauvage cellules de donneur ont montré l’expansion clonale minimale des cellules de distributeur. L’optimisation de ces modèles expérimentaux permettra des études plus rigoureuses des gènes moteurs de l’hématopoïèse clonale qui contribuent à toutes les causes de mortalité telles que les maladies cardio-métaboliques et le cancer.
Nous espérons que nos protocoles permettront aux chercheurs d’étudier l’hématopoïèse clonale pour étudier comment elle contribue aux maladies cardiovasculaires et à d’autres états pathologiques.
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Aperçu
Cet article décrit trois méthodes de transplantation de moelle osseuse (BMT) utilisées pour étudier l'hématopoïèse clonale chez la souris. Ces méthodes comprennent la BMT avec irradiation corporelle totale, l'irradiation protégée et la BMT adoptive sans conditionnement préalable.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Greffe de moelle osseuse
- Hématopoïèse clonale
- Modèles murins
Contexte
- La greffe de moelle osseuse est essentielle pour l'étude de l'hématopoïèse.
- L'irradiation corporelle totale peut nuire à la santé cardiovasculaire.
- Les méthodes alternatives visent à réduire les effets secondaires associés à la greffe de moelle osseuse traditionnelle.
- Comprendre ces méthodes est essentiel pour améliorer les résultats expérimentaux.
Objectif de l'étude
- Évaluer les effets physiologiques de différentes méthodes de greffe de moelle osseuse (BMT).
- Évaluer l'influence de ces méthodes sur l'hématopoïèse clonale.
- Fournir des protocoles permettant de minimiser les effets indésirables pendant la greffe de moelle osseuse (BMT).
Méthodes utilisées
- Greffe de moelle osseuse avec irradiation corporelle totale
- Greffe de moelle osseuse avec irradiation protégée
- Greffe adoptive de moelle osseuse sans conditionnement préalable
- Démonstrations détaillées des procédures par les membres du laboratoire
Résultats principaux
- Démontré l'impact des radiations corporelles totales sur les organes cardiovasculaires.
- Présenté les procédures pour des méthodes alternatives de greffe de moelle osseuse (BMT).
- Fourni des informations sur les effets sur la pathogenèse des maladies.
- Mis en évidence l'importance du blindage pendant l'irradiation.
Conclusions
- Les méthodes alternatives de greffe de moelle osseuse peuvent atténuer les effets secondaires de l'irradiation corporelle totale.
- Comprendre ces méthodes est essentiel pour les recherches futures sur l'hématopoïèse clonale.
- Les protocoles établis peuvent guider les chercheurs dans la mise en place d'expériences.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'hématopoïèse clonale est un facteur de risque associé au vieillissement, lié aux maladies cardiovasculaires et à la mortalité, ce qui nécessite des modèles expérimentaux permettant d'isoler les effets hématopoïétiques sans toxicité organique concomitante. La transplantation classique de moelle osseuse associée à une irradiation corporelle totale endommage les tissus cardiovasculaires et nerveux, compliquant ainsi les études mécanistiques des mutations somatiques dans les cellules souches hématopoïétiques. Les méthodes décrites de protection par blindage et de transfert adoptif non conditionné permettent aux chercheurs d'étudier des gènes conducteurs de l'hématopoïèse clonale, tels que Tet2, dans des contextes cardiovasculaires tout en préservant la fonction des organes, soutenant ainsi la validation des cibles et la réduction des incertitudes mécanistiques dans les voies de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des mutations somatiques dans les cellules souches hématopoïétiques en préservant les microenvironnements cardiaque et cérébral pendant l'irradiation.
- Valeur opérationnelle : Réduit les lésions des organes hors cible, améliorant la spécificité des lectures de l'expansion clonale dans le sang périphérique et le tissu cardiaque.
- Valeur prédictive : Facilite l'évaluation des avantages de fitness clonal conférés par des mutations conductrices dans des conditions physiologiques pertinentes pour les maladies cardio-métaboliques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des modèles de souris chimériques reproductibles avec un engraftement quantifiable des cellules donneuses dans le sang et les organes par cytométrie en flux.
- Valeur opérationnelle : Standardise la reconstitution hématopoïétique indépendamment des méthodes de préconditionnement, facilitant le criblage comparatif de cellules souches hématopoïétiques mutantes par rapport à des cellules sauvages.
- Préparation au test fonctionnel : Fournit des systèmes biologiques validés pour des tests de composés ciblant les voies modulant l'hématopoïèse clonale.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve la niche hématopoïétique et l'intégrité organique, permettant le suivi longitudinal de l'expansion clonale et de sa contribution à la pathogenèse cardiovasculaire.
- Valeur opérationnelle : Permet une comparaison directe de stratégies de conditionnement afin de réduire les risques liés à la sélection de cibles fondées sur l'efficacité d'engraftement et la dynamique clonale.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre la modélisation hématopoïétique en phase de découverte et l'évaluation préclinique de l'hématopoïèse clonale dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique en permettant la vérification d'hypothèses sur les mécanismes de l'hématopoïèse clonale avant l'identification de candidats dans les programmes de maladies cardiovasculaires et inflammatoires.
- Biologie de la découverte : Permet la validation fonctionnelle des mutations somatiques dans les cellules souches hématopoïétiques grâce à une réconstitution contrôlée et un suivi des cellules immunitaires spécifique aux organes.
- Écrantage : Fournit des métriques d'engraftement standardisées et quantifiables, essentielles pour comparer la compétitivité clonale entre différents fonds génétiques.
- Analytique : Produit des lectures basées sur la cytométrie en flux du chimérisme donneur dans le sang et le tissu cardiaque, permettant des comparaisons statistiques des effets des traitements préparatifs.
- Recherche translationnelle : Préserve la fonction des tissus cardiaque et nerveux, permettant d'évaluer l'impact de l'hématopoïèse clonale sur les phénotypes cardiovasculaires sans les facteurs de confusion induits par l'irradiation.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme réutilisable pour modéliser l'hématopoïèse clonale dans divers gènes conducteurs et contextes pathologiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en isolant les effets hématopoïétiques de la toxicité systémique.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité des modèles d'hématopoïèse clonale grâce à des protocoles définis de protection et de transfert cellulaire.
- Valeur stratégique : Affine les décisions de poursuite ou d'abandon en réduisant le bruit biologique dans les modèles précliniques d'expansion clonale.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des cibles ajustée au risque, fondée sur des données de fitness clonal obtenues dans des systèmes physiologiquement pertinents.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en manipulation des souris, en sécurité liée à l'irradiation et en techniques d'isolement de la moelle osseuse.
- Dépend de l'accès à des irradiateurs dotés de capacités de blindage et à une infrastructure stérile pour la culture cellulaire.
- Exige une standardisation des procédures d'anesthésie, de surveillance de la récupération et d'injection rétro-orbitaire entre les différents sites.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application de la greffe de moelle osseuse (BMT) avec ou sans conditionnement à différentes souches ou génotypes de souris.
- Est limitée par la nécessité d'une validation rigoureuse de l'efficacité du blindage afin d'assurer une protection spécifique aux organes sans compromettre l'ablation hématopoïétique.
