Name: Préparation du drosophile adulte melanogaster pour l’imagerie cérébrale entière pendant les réponses au comportement et aux stimuli (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie du cerveau entier chez Drosophila melanogaster pendant le comportement. Cette technique permet d'observer l'activité neuronale en temps réel lors de réponses sensorielles.

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Nous remercions Heidi Miller-Mommerskamp pour son aide technique et Iveth Melissa Guatibonza Arevalo pour les commentaires utiles sur le manuscrit. Les premières versions du protocole ont été développées dans le laboratoire de Ralph Greenspan. Ces travaux ont été soutenus par la Fondation allemande de recherche (DFG), notamment par le biais d’une subvention FOR2705 (TP3) à IGK, et par la fondation Simons (Aimon – 414701) et l’Institut Kavli pour le cerveau et l’esprit (numéro de subvention #2017-954) reçu par SA.

Toutes les étapes sont effectuées sous un stéréomicroscope.
1. Préparation du titulaire
<ol><li>Imprimez le support 'FlyholderVJove.stl' (voir Matériel supplémentaire)avec une imprimante 3D ou laissez-le imprimer à l’aide de services en ligne (Figure 1A). La fusion SLS (Nylon PA12) et multijet (PA12) convient.</li>
	<li>Créez la fente de tête.<ol>
<li>Placez un morceau de ruban adhésif rectangulairement sur une surface plane. Couper une tranche d’environ 5 mm x 1 cm. Couper la fente cervicale (~400 x 400 μm) au milieu du côté plus long du ruban à l’aide de lames parallèles fixes (deux lames de scalpel collées ensemble) pour assurer la même largeur dans chaque support (figure 1B).</li>
		<li>Placez la bande sur le côté plus plat du trou dans le support sur le côté inférieur (voir la figure 1C et la figure 1D). Le ruban peut être déformé en le poussant vers le bas avec des forceps ~500 μm autour du trou ; cela permettra de minimiser davantage les entraves aux mouvements ultérieurs de la mouche.</li>
		<li>Couvrez la bande et le support du haut avec du vernis à ongles noir pour empêcher le tampon de s’échapper. Le vernis à ongles noir protégera également les yeux de la mouche de la lumière d’excitation du microscope. Laisser sécher le vernis à ongles au moins une heure avant d’utiliser le support.</li>
		<li>Une fois que le vernis à ongles est sec, ajouter ~ 1 μL de graisse dans la fente de la tête à l’aide d’un tissu roulé pour s’assurer que la colle ne sera pas mouiller l’arrière de la tête de la mouche (Figure 2A). Assurez-vous de ne pas mettre de graisse à l’extérieur de la fente qui empêcherait la colle de coller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Créez la fente du corps (Figure 2B).<ol>
<li>En option, préparez la bande qui sera utilisée pour positionner le corps de la mouche (voir ci-dessous) à l’avance. Utilisez la conception indiquée dans la figure 2B (en haut) pour couper un morceau de ruban adhésif d’environ 2 cm de large en deux et couper des tranches de 1,5 mm de large. Découpez des épaules profondes de 0,3 mm et une fente corporelle. Assurez-vous qu’il s’adapte au support. REMARQUE : La variabilité entre les tailles de mouches (en particulier avec le sexe, l’âge, le génotype ou les espèces) peut rendre nécessaire l’ajustement de la conception du ruban adhésif. Si la tête a tendance à être mal centrée, il peut être utile d’ajouter temporairement un morceau de ruban adhésif en forme de V au-dessus de la fente cervicale (figure 3). Appliquez également quelques microlitres de graisse à l’intérieur de la fente du cou et sur le ruban en forme de V.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Placer la mouche
REMARQUE : Les mouches femelles d’un à quatre jours sont idéales parce que la tête femelle est plus grosse et donc plus facile à disséquer que la tête masculine, et les mouches plus jeunes ont la cuticule plus douce. Pour les expériences de marche, l’activité de la mouche peut être augmentée en faisant correspondre les expériences avec des périodes d’activité circadienne plus élevée (ZT0 ou ZT11), en utilisant de la solution saline contenant du glucose (comme 103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM TES, 8 mM trehalose 2 H2O, 10 mM de glucose, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 2,5 mM CaCl2·2 H2O, 4 mM MgCl2·6 H2O), en affamant la mouche jusqu’à 24 h avec un environnement d’eau seulement, et en chauffant l’environnement à ~28 °C pendant l’expérience. Couper les ailes au moins un jour à l’avance contribue également à diminuer les tentatives de vol et ainsi augmenter la fréquence des combats demarche 7,29,30.
<ol><li>Remplissez un couvercle de boîte à pointes de boîte de Pétri ou de pipette avec de la glace, placez un tissu de laboratoire sur la glace et placez le support à l’envers.</li>
	<li>Transférez une mouche sur la glace pour la paralyser en la suçant de son flacon dans un tube et en la soufflant sur la glace (assurez-vous que la glace n’est pas fondue, ce qui noierait la mouche).</li>
	<li>Lorsque la mouche cesse de bouger, utilisez des forceps ternes pour le glisser dans le support avec le cou à l’intérieur de la fente (la mouche peut être tenue à la base de l’aile) comme dans la figure 4 (àgauche). Les yeux doivent être à des positions égales par rapport aux côtés de la fente (figure 4, milieu). Si nécessaire, ajouter 1 μL de graisse sur le dessus de la tête pour empêcher la colle (voir l’étape suivante) d’atteindre l’arrière de la tête et retirer plus tard.</li>
	<li>Couvrez le corps d’un tissu et d’un peu de glace pour vous assurer que la mouche ne bouge pas pendant cette étape et la suivante (figure 4, à droite). Une autre option pour empêcher les jambes d’atteindre la tête est d’utiliser un morceau de ruban juste en dessous de la tête (voir la figure 6).</li>
</ol>3. Sécurisation de la tête
<ol><li>Placez la tête à un angle ~20° à partir d’une vue entièrement postérieure (autour de l’axe latéral, voir figure 5A). Il s’agit d’un compromis entre la diminution de la profondeur à l’image et de l’autre côté de maintenir la jambe avant libre de se déplacer et de minimiser l’étirement du cou.</li>
	<li>Avec un tissu enroulé (figure 5B), mettre de la colle UV autour de la tête tout en évitant de salir la zone sensorielle d’intérêt (antennes, trompes et / ou les yeux). Pour les expériences gustatives, retirez la trompe et ajoutez de la colle à sa base pour empêcher le mouvement. Si aucune expérience gustative n’est prévue, la trompe est mieux poussée dans la tête et fixée avec de la colle pour minimiser le mouvement (Figure 6).</li>
	<li>Guérir la colle avec de la lumière UV pendant 5 s. Nettoyez soigneusement l’environnement de la tête à l’aide d’un tissu enroulé pour enlever le reste de la colle liquide qui pourrait coller aux jambes et/ou aux zones sensorielles du sol. REMARQUE : Le ruban peut être rugueux avec du papier de verre pour augmenter l’adhérence de la colle si nécessaire.</li>
	<li>Utilisez une fine bande de ruban adhésif ou un tissu enroulé pour déplacer les jambes vers l’avant (si elles ne sont pas déjà), de sorte qu’ils ne seront pas endommagés par l’étape suivante.</li>
</ol>4. Positionnement du corps
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée rapidement; avant que la mouche ne se remette de l’anesthésie.
<ol><li>Retirez le contenant de glace et retournez le support. Retirer l’eau autour de la mouche avec un mouchoir.</li>
	<li>Placez la bande de fente de corps (créée dans l’étape 1) au-dessus du trou et poussez doucement le corps de la mouche vers le bas (figure 7). Veillez à ne pas trop étirer le cou.</li>
</ol>5. Sceller le trou
<ol><li>Couvrir les grands trous restants de ruban adhésif.</li>
	<li>Ajouter ~1 μL de graisse à l’arrière de la tête et dans la région du cou pour s’assurer qu’aucune colle ne s’y mouillera.</li>
	<li>Avec un tissu enroulé, peindre la colle UV autour et sur le dessus du ruban adhésif et sur le thorax (partie dorsale supérieure du mésonotum) pour le fixer. Guérir la colle avec de la lumière UV pour ~5 s. REMARQUE : Il est important de minimiser l’utilisation de la lumière UV car elle peut fortement affecter la santé de la mouche.</li>
	<li>Nettoyez soigneusement la graisse et la colle non durcie à l’aide d’un tissu de laboratoire.</li>
	<li>Mettez ~1 mL de solution saline sur le dessus de la tête. Repoussez les bulles d’air avec des forceps. Recherchez les fuites en plaçant un coverslip sur la solution saline et en retournant le support pour vérifier la solution saline sur le côté avant. S’il y a des fuites, retirez la solution saline et fixez le trou (soit en ajoutant plus de colle ou plus de graisse). REMARQUE : C’est peut-être le bon moment pour faire une pause si nécessaire. La mouche peut être offert un petit morceau de tissu ou de boule de polystyrène à marcher sur pour empêcher les flailing et calmer la mouche vers le bas.</li>
</ol>6. Disséquer la tête
REMARQUE : Utilisez des forceps aiguisés pour les étapes suivantes. Les forceps très fins sont critiques car les forceps ternes ront le rendre plus difficile d’ouvrir la cuticule de tête et peuvent mener aux dommages additionnels sur la tête ou le cerveau de la mouche. Un grossissement fort peut aider à ce stade. À cet effet, on peut remplacer les oculaires du microscope binoculaire par des oculaires 30x.
<ol><li>Faire deux coupes à la base du triangle cuticulaire central foncé de chaque côté du cou (voir croix dans la figure 8A).</li>
	<li>Couper autour du triangle sombre et enlever cette partie de la cuticule.</li>
	<li>Le trou dans le cerveau à travers lequel vont le muscle 16 et l’œsophage doit maintenant être visible et se déplacer rythmiquement(la vidéo 1 présente ce mouvement rythmique dans une mouche avec des muscles fluorescents). Pincez soigneusement le dessus de cette zone pour couper le muscle 16 sans percer l’œsophage. Si le mouvement rythmique du cerveau s’est arrêté, le muscle 16 a probablement été enlevé, cependant, le mouvement s’arrête parfois et redémarre plus tard. Il est donc important de prêter attention aux mouvements rythmiques et d’effectuer cette étape à nouveau si nécessaire.</li>
	<li>Couper le reste de la cuticule en petits morceaux et les enlever soigneusement. Essayez de ne pas trop tirer sur la cuticule. Utilisez plutôt les forceps comme une paire de ciseaux, pour couper des morceaux de tissu. On peut commencer sur les bords médiaux, où le triangle sombre a été enlevé avant et travailler son chemin vers les côtés. REMARQUE : Des morceaux de cuticule peuvent être utilisés pour gratter doucement les gros corps s’ils sont présents.</li>
	<li>Retirez les sacs d’air une pièce après l’autre en les saisissant avec les forceps et en tirant lentement et régulièrement.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La drosophile est l’un des rares animaux adultes où tout le cerveau peut être photographié lors de comportements complexes. Ici, nous présentons une méthode pour préparer la mouche et exposer tout son cerveau à l’image en cours toute l’activité cérébrale. Plusieurs points importants doivent être notés.
Disséquer un petit animal comme D. melanogaster est un défi. La méthode demande donc beaucoup de pratique et de patience pour la maîtriser. Cependant, après l’entraînement, la procédure prend moins de 30 minutes et produit des résultats reproductibles.
La méthode que nous avons présentée a des limites supplémentaires. Tout d’abord, incliner la tête de mouche de sa position naturelle conduit à étirer le cou qui pourrait être dommageable pour le tissu conjonctif, les nerfs ou les muscles. Deuxièmement, bien que la zone subesophagale ventrale (ZES) soit optiquement accessible, elle se trouve en dessous de l’œsophage semi-transparent, ce qui diminue l’intensité et la résolution dans ce domaine. Enfin, bien que le titulaire soit hors de portée dans la plupart des directions, la mouche réalise encore parfois sa présence et pousse sur elle pour essayer de s’échapper.
Malgré ces limitations, les données complètes obtenues à partir de l’imagerie cérébrale entière pendant le comportement et les réponses aux stimuli permettra de déchiffrer la fonction cérébrale au niveau de l’ensemble du réseau lorsque l’animal interagit avec des environnements complexes et naturalistes et y navigue.

L’activité cérébrale d’imagerie utilisant diverses techniques ont approfondi la compréhension de la fonction cérébrale. Chez l’homme, les techniques d’imagerie cérébrale ont des limitations importantes : alors que l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) offre une résolution spatio-temporelle bien en deçà de la résolution d’un seul neurone, les techniques rapides telles que l’électroencéphalographie (EEG) ne permettent qu’un accès indirect et partielau cerveau 1. Dans des modèles animaux suffisamment grands comme les rongeurs, l’enregistrement de capteurs d’activité fluorescente (p. ex., GCaMP) à l’aide de microscopes montés sur la tête permet d’observer l’activité cérébrale pendant que l’animal se déplace dansson environnement 2. Néanmoins, ces techniques ne donnent actuellement accès qu’à une petite partie du cerveau. Les animaux fixés à la tête peuvent être photographiés de façon plus complète, mais la couverture est encore partielle (p. ex., la surface du cortex3). Ce n’est que chez les petits animaux, comme les larves de poisson zèbre, C. elegans et Drosophila, que tout le cerveau peut être photographié avec une résolution temporelle et spatiale au niveau ou à proximité de neuronesindividuels 4.
D. melanogaster est particulièrement prometteur parce qu’il a longtemps été utilisé comme un organisme modèlegénétique 5 et de puissants outils génétiques ont été développés6. Complétée par le nouveau réseau anatomique à grande échelle dérivé de la microscopieélectronique 7,la mouche pourrait offrir des possibilités uniques d’étudier la dynamique cérébrale complexe générée sur un réseau à grande échelle8. Bien que la cuticule ne soit pas transparente, et doit donc être enlevée pour imager le cerveau, l’imagerie fonctionnelle in vivo est devenue de plus en plus courante depuis la première étude en 20029 et plusieurs protocoles ont déjà été publiés. Toutefois, ces méthodes impliquent soit de séparer la tête de mouchedu corps 10,de restreindre sévèrement les mouvements de la mouche et/ou les réponses aux stimuli11,12,13,14,15, ou seulement de permettre une petite partie de le cerveau à être photographié9,16,25,26,27,17,18,19,20,21,22,23,24. Pour compléter ces approches néanmoins puissantes, nous avons récemment développé une préparation à l’image de l’ensemble du cerveau lors du comportement et des réponses à divers stimuli28.
Ici, nous nous construisons sur cette étude pour présenter une méthode spécifiquement développée pour imager l’ensemble du cerveau tandis que la mouche effectue un comportement semi-naturaliste (c’est-à-dire la marche et le toilettage) et répond aux stimuli sensoriels. Ceci est réalisé en utilisant un support d’observation conçu pour donner accès à l’ensemble du cerveau à partir du côté dorsale-postérieur, tout en laissant les antennes et la trompe intactes, et en permettant à la mouche de déplacer ses jambes pour marcher (par exemple, sur une boule coussinée par air). Les étapes de dissécation de l’arrière de la tête ont été affinées pour la vitesse, la reproductibilité et pour minimiser leur effet sur la viabilité et la mobilité de la mouche.

<table><tbody><tr><td>Pince #5</td><td>FST de DUMONT</td><td>11252-30</td><td>pointe droite 0,05 x 0,02 mm, Dumoxel, 11 cm de longPince</td></tr> <tr><td>#55</td><td>FST de DUMONT</td><td>11255-20</td><td>pointe droite 0,05 x 0,02 mm, Inox, 11 cm de long</td></tr><tr><td>30x oculaires</td><td>yegren</td><td>WF30-9-30-H</td><td>WF30X/9 Oculaire à point oculaire haut champ Vue à grand champ Lentille optique oculaire pour stéréomicroscope ou microscope biologique 30X, 30mm sans réticule</td></tr><tr><td>AHOME/UV lampe de poche</td><td>Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd</td><td>B07V2W9543 (ASIN)</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>Fotoplast Gel/UV Glue</td><td>Dreve Otoplastik GmbH</td><td>44791</td><td>GHS07, GHS08</td></tr><tr><td>Gloss Finish Ruban transparent</td><td>3M Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIMTECH Science/Precision</td><td>wipes Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td>11 x 21 cm</td></tr><tr><td>KL 1500 LCD/Microscope</td><td>light Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Leica MS5</td><td>Leica</td><td></td><td>WF30X/9</td></tr><tr><td>Nail Lacqueur</td><td>Opi Products Inc., N. Hollywood</td><td>6306585338</td><td>noir</td></tr><tr><td>Saline : Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl saccharose threalose</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Werner Dorsch GmbH</td><td>78 621 ; B07SXCXWFS (ASIN)</td><td>poignée souple</td></tr><tr><td>Graisse</td><td>sous vide Dow corning</td><td>0020080 /100 gr</td><td>Moly Kote 111 Graisse composée Graisse Valve Stamp 100 g</td></tr></tbody></table>

préparation du drosophile adulte melanogaster pour l’imagerie cérébrale entière pendant les réponses au comportement et aux stimuli

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Nous présentons une méthode développée spécifiquement pour l’image de l’ensemble du cerveau drosophile lors de comportements continus tels que la marche. La fixation et la dissection de la tête sont optimisées pour minimiser leur impact sur le comportement. Ceci est d’abord réalisé en utilisant un support qui minimise les entraves de mouvement. L’arrière de la tête de la mouche est collé à ce support à un angle qui permet un accès optique à l’ensemble du cerveau tout en conservant la capacité de la mouche à marcher, toiletter, sentir, goûter et voir. L’arrière de la tête est disséqué pour enlever les tissus dans le chemin optique et les muscles responsables des artefacts de mouvement de la tête. Le cerveau volant peut ensuite être photographié pour enregistrer l’activité cérébrale, par exemple à l’aide d’indicateurs de calcium ou de tension, lors de comportements spécifiques tels que la marche ou le toilettage, et en réponse à différents stimuli. Une fois que la dissection difficile, qui nécessite une pratique considérable, a été maîtrisée, cette technique permet d’enregistrer de riches ensembles de données relatant l’activité cérébrale entière aux réactions de comportement et de stimulus.

La préparation décrite ci-dessus permet l’observation de l’ensemble du cerveau au microscope pour l’imagerie 3D à grande échelle comme les photons classiques 2 ou la microscopie confocale, mais aussi des techniques plus rapides telles que lafeuille de lumière 31 et d’autres techniques structurées de microscopie d’éclairage(examinées en 32), ou la microscopiede champ lumineux 28.
L’accès à l’ensemble du cerveau tout en observant le comportement et en maintenant les organes sensoriels fonctionnels permet de répondre à plusieurs questions.
Tout d’abord, quelle est l’activité cérébrale globale lorsque la mouche est au repos, pendant le comportement, et quand elle répond aux stimuli? À titre d’exemple, nous incluons des données obtenues au microscope à champ lumineux montrant l’activation du cerveau lors des réponses aux stimuli et au comportement. Par exemple, dans la vidéo 2, une sonde de calcium a été exprimée dans tous les neurones (nsyb-GAL4 et UAS-syt-GCaMP6s (gauche) ou UAS-GCaMP6M (droite)) et une bouffée d’odeur a été présentée. Remarquez comment la préparation permet d’obtenir un aperçu de l’activité cérébrale pendant la réponse au stimulus. Les puissants outils génétiques de Drosophila peuvent être utilisés pour limiter l’expression de ces capteurs à des sous-types neuronaux spécifiques. Dans la vidéo 3, nous avons limité l’expression d’un capteur de calcium aux neurones dopaminergiques et sérotoninergiques (TH-GAL4, DDC-GAL4 et UAS-GCaMP6M). Remarquez la forte activité synchrone au-dessus du cerveau étroitement corrélée avec la marche à la mouche, permise en observant tout le cerveau pendant le comportement. En plus de l’activité calcique, d’autres signaux physiques ou chimiques peuvent être photographiés (en utilisant par exemple des capteurspour la tension 28,33, produitsdu métabolisme 34,35 ou neuromodulateursspécifiques 36).
Pour mieux comprendre le rôle de l’activité cérébrale, nous pouvons nous demander quelles régions sont impliquées dans quel comportement, réponse aux stimuli ou modèles spontanés d’activité. Les données peuvent en effet être utilisées comme un écran impartial pour extraire les régions fonctionnelles à l’aide de techniques telles que l’analyse des composants principaux et l’analyse indépendante des composants. La figure 9A montre différentes régions fonctionnelles dans différentes couleurs. La forme et la localisation des régions fonctionnelles permettent de les cartographier en modèles anatomiques pour identifier les régions du cerveau et, dans certains cas, le type de neurone. De plus, une fois alignées sur le modèle anatomique, les valeurs de fluorescence peuvent être moyennes dans les régions anatomiques du cerveau pour une analyse quantitative (voir la figure 9B). Par exemple, un modèle gaussien hiérarchique appliqué aux données de la figure 9B montre que les régions sont plus actives pendant la marche (avec une médiane ΔF/F de 0,029, Intervalle crédible de 95% =[0,017 0,041]) mais pas pendant le toilettage (médiane ΔF/F = -0,0049 avec intervalle crédible de 95%=[-0,016 0,0059]).
En ajoutant à la profondeur de compréhension, les enregistrements simultanés des différentes régions fonctionnelles autorisés par la préparation peuvent être utilisés pour étudier les propriétés dynamiques du réseau fonctionnel. Ceci est important parce que les régions du cerveau dans tous les cerveaux étudiés jusqu’à présent sont fortement interconnectées de façon récurrente et de plus en plus d’études montrent que même les zones sensorielles répondent à l’état comportemental de l’animal. Plusieurs aspects peuvent être pris en compte, tels que les propriétés fonctionnelles des graphiques (p. ex., les modules) et les modèles spatio-temporels qui peuvent être adaptés aux systèmes dynamiques(voir 8 par exemple).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig01.jpg"> Figure 1 : Préparation du titulaire (étape 1). A) Conception du support (vue du haut). B) Préparation de fente de cou. haut : conception de bande, fond : lames parallèles utilisées pour couper la fente de cou. C) Vue du support d’en bas. D) Vue du bas indiquant où ajouter le ruban à sous du cou. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig02.jpg"> Figure 2 : Autres préparatifs (étape 1). R)Ajouter de la graisse dans la fente du cou pour empêcher la colle de couvrir l’arrière de la tête et pour éviter les fuites salines. Barres d’échelle, 1 mm. B) Haut : forme du morceau de ruban adhésif qui sera utilisé pour pousser le corps vers le bas. En bas : assurez-vous que la bande s’adapte au support. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig03.jpg"> Figure 3 : Placement d’un morceau de ruban en forme de V pour faciliter le centrage. (A) Vue du bas. (B) Vue supérieure. Barre d’échelle, 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig04.jpg"> Figure 4 : Placez la mouche (étape 2). À gauche, utilisez deux forceps ternes pour placer le corps de sorte que le cou est dans la fente du cou. Au milieu, alignez la tête. Les yeux se trouvent des deux côtés sur les bords de la fente. La tête de la mouche est droite. À droite, rentrez la mouche avec un tissu recouvert de glace pour l’empêcher de bouger. Barre d’échelle, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig05.jpg"> Figure 5 : Fixer la tête (étape 3). A) Angle idéal de la tête. B) Ajouter de la colle UV autour de la tête, en évitant les zones sensorielles d’intérêt. Barre d’échelle, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig06.jpg"> Figure 6 : La pointe de la trompe et les antennes peuvent être gardées exemptes de colle (étape 3). Le cercle blanc indique la zone où la colle UV a été appliquée. La flèche montre quelles parties sont laissées exemptes de colle pour des expériences olfactives et gustatives. Notez le ruban en option qui empêche les jambes de toucher la zone de colle. Barre d’échelle, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig07.jpg"> Figure 7 : Placez la bande arrière (étape 4.2). La bande créée à l’étape 1 (voir figure 2, à gauche) est utilisée pour placer le corps et couvrir le grand trou dans le support. Barre d’échelle, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig08v2.jpg"> Figure 8 : Étapes de dissection (étape 6). A-B) Couper de chaque côté à la base du triangle sombre (croix) et enlever cette partie de la cuticule C). D) et E) enlever le muscle 16. Puis retirez doucement le reste de la cuticule F),les sacs d’air G),et les muscles. H) Tête disséquée. Barre d’échelle, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig08v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig09.jpg"> Figure 9 : Résultats représentatifs. A)Régions fonctionnelles (extraites à l’aide de PCA et ICAcomme dans 28) pour une mouche exprimant GCaMP6 pan-neuronally image avec un microscope à champ lumineux (25x, NA =0,95 avec un tableau correspondant f/12 micro lentille). Barre d’échelle, 100 μm. B) Activité moyenne de calcium dans les grandes régions du cerveau pendant les réponses aux stimuli et au comportement (reproduiteà partir de 28). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig09large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Vidéo 1: Muscle 16 mouvements (étape 6.3). GFP a été exprimé dans les muscles. Notez le mouvement de pompage qui vient du trou juste au-dessus de la trachée. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/Muscle16_Movie.avi" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Vidéo 2: Activité pan-neuronale de calcium pendant la réponse à l’odeur pour deux préparations différentes. Le vinaigre balsamique a été soufflé à la volée. L’activité pan-neuronale de calcium (conducteur de nsyb-GAL4, UAS-syt-GCaMP6s gauche et UAS-GCaMP6M droit) a été image avec un microscope de champ léger (25x, NA=0.95 avec un tableau assorti de f/12 microlens). Des images de champ de lumière ont ensuite été reconstruites telles que décrites dansl’arbitre 28,37. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/B9_B10CombinedStacks.avi" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Vidéo 3 : Activité calcique dans un sous-ensemble de type neurone pendant le comportement. GCaMP6 a été exprimé dans les neurones dopaminergiques et sérotoninergiques (avec TH-GAL4 et DDC-GAL4). En combinaison avec les outils génétiques de mouche, la préparation permet d’observer une forte augmentation de l’activité dans de nombreuses régions pendant la marche. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/Video3.avi" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Matériel supplémentaire. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/FlyHolderVJove.stl" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous présentons une méthode spécifiquement adaptée à l’image de l’ensemble du cerveau de la drosophile adulte pendant le comportement et en réponse aux stimuli. La tête est positionnée pour permettre un accès optique à l’ensemble du cerveau, tandis que la mouche peut déplacer ses jambes et les antennes, le bout de la trompe, et les yeux peuvent recevoir des stimuli sensoriels.

Préparation du drosophile adulte melanogaster pour l’imagerie cérébrale entière pendant les réponses au comportement et aux stimuli

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

Notre protocole permet l’imagerie de l’ensemble du cerveau de la mouche pendant le comportement, ce qui est important pour comprendre comment les neurones dans différentes régions du cerveau interagissent pour façonner le comportement. Contrairement à d’autres protocoles publiés, cela a été développé spécifiquement pour accéder à l’ensemble du cerveau pendant que la mouche se comporte et se sent par une odeur, le goût ou la stimulation visuelle. Pour créer une fente de tête.Après avoir imprimé le support avec une imprimante 3D, placez un morceau de ruban adhésif rectangulairement sur une surface plane sous un microscope stéréo. Et couper un morceau d’environ cinq millimètres par un centimètre. Utilisez deux scalpels fixés ensemble en parallèle pour couper un 400 par 400 micromètres fente suivante au milieu du côté plus long de la bande, et placer la bande sur le côté plus plat du trou sur le fond du support.Utilisez des forceps pour pousser le ruban environ 500 micromètres autour du trou. Et utilisez du vernis à ongles noir pour couvrir le haut de la bande et le support. Après avoir laissé sécher le vernis à ongles pendant au moins une heure, utilisez un tissu roulé pour ajouter environ un microlitre de graisse à la fente de la tête.Pour préparer la fente du corps, couper un morceau d’environ deux centimètres de ruban large en deux morceaux et couper 1,5 millimètre de large tranches. Ensuite, découpez une fente d’épaule et de corps de 0,3 millimètre de profondeur et assurez-vous que la bande s’adapte au support. Pour fixer une mouche dans le support, placez d’abord un récipient peu profond avec de la glace sous le microscope disséquant, et placez le support à l’envers sur un morceau de tissu de laboratoire placé au-dessus de la glace.Aspirez une femelle d’un à quatre jours voler de sa vile, et souffler la mouche sur la glace non fondue. Lorsque la mouche cesse de bouger, utilisez les forceps Dell pour saisir la mouche à la base des ailes et faites glisser la mouche dans le support avec le cou à l’intérieur de la fente. Les yeux doivent être également positionnés de chaque côté de la fente.Si nécessaire, ajouter un microlitre de graisse sur le dessus de la tête pour empêcher la colle d’atteindre l’arrière de la tête. Couvrez ensuite le corps d’un tissu et d’un peu de glace pour vous assurer que la mouche ne bouge pas. Pour fixer la tête, placez-la à un angle d’environ 20 degrés à partir d’une vue entièrement postérieure.Et utilisez un tissu enroulé pour appliquer de la colle UV autour de la tête tout en évitant de salir la zone sensorielle d’intérêt. Pour les expériences gustatives, utilisez des forceps pour retirer la trompe et ajouter de la colle à la base de proboscis pour empêcher le mouvement. Si aucune expérience gustative n’est prévue pousser et coller la trompe dans la tête.Guérir la colle avec de la lumière UV pendant cinq secondes, et utiliser un tissu enroulé pour nettoyer soigneusement les zones entourant la tête, pour enlever toute colle liquide restante qui pourrait coller aux jambes et les portes du sol, les zones sensorielles. Ensuite, utilisez une fine bande de ruban adhésif ou un tissu pour déplacer les jambes vers l’avant si nécessaire. Pour positionner le corps, retirez le récipient de glace et retournez le support.Retirez l’eau autour de la mouche et agissez rapidement avant que la mouche ne se rétablisse de l’anesthésie placez la bande de fente corporelle au-dessus du trou et poussez doucement le corps de la mouche vers le bas, en prenant soin de ne pas trop étirer le cou. Couvrir les gros trous restants de ruban adhésif et ajouter environ un microlitre de graisse à l’arrière de la tête, afin d’empêcher la colle de coller à cet endroit. Utilisez un tissu enroulé pour peindre la colle UV autour du thorax et sur le dessus du ruban adhésif et du thorax, et guérir la colle avec de la lumière UV pendant environ cinq secondes.Retirez soigneusement la graisse et la colle non durcie à l’aide d’un tissu de laboratoire et ajoutez environ un millilitre de solution saline au sommet de la tête. Utilisez des forceps pour repousser les bulles d’air et vérifier les fuites en plaçant un glissement de couverture sur la solution saline et en retournant le support pour vérifier la solution saline sur le côté avant. Si la solution saline est observée, retirer la solution saline et fixer le trou avec plus de colle ou plus de graisse.Pour disséquer la tête choisir le grossissement le plus élevé et utiliser aiguisé forceps très fine pour faire deux coupes à la base du triangle central cuticule foncé de chaque côté du cou. Couper autour du triangle sombre, et enlever cette partie de la cuticule. Muscle 16 et l’œsophage doit être visible à travers ce trou et se déplaçant rythmiquement.Utilisez les forceps très fins pour pincer soigneusement le dessus de cette zone pour couper le muscle 16 sans percer l’œsophage. Si le mouvement rythmique s’arrête le muscle 16 a probablement été enlevé. Lorsque le muscle a été excisé à partir du bord médial de la région du triangle sombre, utilisez les forceps comme une paire de ciseaux pour couper soigneusement et enlever le reste de la cuticule en petits morceaux.Ensuite, utilisez les forceps pour saisir et lentement et régulièrement retirer un sac gonflable à la fois. Dans cette vidéo, une sonde de calcium a été exprimée dans tous les neurones de ces deux cerveaux de mouche de fruit. Et une bouffée d’odeur a été présentée.Dans cette expérience, l’expression de capteur de calcium a été limitée aux neurones dopaminergiques et sérotonergiques. Remarquez la corrélation étroite entre la forte activité synchrone sur le cerveau et le comportement de marche des mouches illustrant comment tout le cerveau peut être observé au cours d’un comportement spécifique. À l’aide de l’analyse des composants principaux et de l’analyse indépendante des composants, différentes régions fonctionnelles mises en évidence dans différentes couleurs peuvent être extraites.La forme et la localisation des régions fonctionnelles permettent aux régions d’être cartographiées en modèles anatomiques. Identifier les régions du cerveau et, dans certains cas, les types de neurones. Une fois alignés sur le modèle anatomique approprié, les valeurs de fluorescence peuvent être moyennes dans des régions cérébrales anatomiques spécifiques pour une analyse quantitative.Par exemple, dans cette analyse, nous pouvons observer que toutes les régions sont plus actives pendant la marche que pendant le toilettage. patienter. Apprendre cette technique de dissection cardiaque est difficile.Dans mon laboratoire, les gens ont besoin en moyenne de trois à quatre mois avant de le maîtriser et d’obtenir leurs premières préparations utiles. En suivant ce protocole, nous pouvons enregistrer l’activité cérébrale à grande échelle à l’aide d’un microscope à fluorescence. Des méthodes rapides telles que la microscopie de champ lumineux sont particulièrement indiquées.

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