Fabrication de réseaux de microtissus cardiaques 3D à l’aide de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales dérivés de l’iPSC humain

Le protocole combine la puissance de génération de types de cellules cardiovasculaires humaines à l’aide de cellules souches pluripotentes induites et une technique polyvalente pour générer des sphéroïdes cardiaques battants en moins de 72 heures. Ces sphéroïdes cardiaques peuvent être utilisés pour la modélisation des maladies et les tests de dépistage de médicaments. L’un des principaux avantages de cette technique facile est que l’on peut générer près de 1000 sphéroïdes cardiaques battants dans une plaque standard de 12 puits.

Et surtout, chaque sphéroïde cardiaque peut être testé pour sa fonction contractile en utilisant une technique basée sur l’imagerie. Après avoir fait fondre l’agarose au micro-ondes, placez-la dans l’armoire de biosécurité et laissez-la refroidir pendant trois minutes. Pipette 700 microlitres de l’agarose fondue et l’ajouter au micromoulage de silicone d’un réseau neuf par neuf, en prenant soin d’éviter de générer des bulles.

Placez soigneusement le moule sur le bloc de glace pré-froid pour accélérer la durée de l’agarose. Une fois que l’agarose devient translucide, pliez soigneusement les bords du micromoulage pour perdre la réplique d’agarose et pelez doucement la réplique de tous les côtés pour la détacher du micromoulage en silicone. Transférer le plateau de microtissu d’agarose contenant 81 renfoncements circulaires dans une plaque stérile de 12 puits, puis ajouter deux millilitres de PBS au plateau de microtissu d’agarose et l’inspecter au microscope à la recherche de bulles piégées ou de puits de forme irrégulière.

Immergez le plateau d’agarose dans deux millilitres d’éthanol à 70% pendant la nuit, puis le traitement UV dans l’armoire de biosécurité pendant une heure. Retirez l’éthanol à 70 % et lavez deux fois avec de l’eau distillée et une fois avec deux millilitres de PBS. Une fois que les cardiomyocytes, les fibroblastes cardiaques et les cellules endothéliales dérivés de cellules souches pluripotentes induites sont comptés après la trypsinisation et la neutralisation, placez les suspensions cellulaires sur la glace.

Dans un nouveau tube, mélangez les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites, les fibroblastes cardiaques et les cellules endothéliales. Ensuite, retirez le PBS du puits et de la chambre d’ensemencement des cellules sans toucher les renfoncements et ajoutez 200 microlitres de la suspension cellulaire goutte à goutte. Laissez les cellules se déposer à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone pendant deux heures.

Ajouter un milieu de fabrication de micro-tissus entourant le moule d’agarose pour couvrir la surface de la chambre interne. Après 24 heures, observez les sphéroïdes auto-assemblés et compacts dans les renfoncements circulaires. Changez le milieu tous les deux jours pour maintenir les sphéroïdes.

Typiquement, après 48 heures, des battements spontanés des sphéroïdes peuvent être observés. Cultivez les différents types de cellules séparément sur un milieu de matrice de membrane basale ou des lames de chambre revêtues de gélatine. Rincez doucement les microtissus cardiaques hors des renfoncements circulaires et rassemblez-les dans un tube chronique de 15 millilitres.

Aspirer le milieu et rincer les cellules ou les microtissus, avec un millilitre de PBS. Ensuite, fixez les cellules ou les microtissus avec un tampon de fixation contenant 4,2% de PFA et incubez à température ambiante. Aspirer le PFA et incuber les cellules ou les microtissus avec un millilitre de solution perméabilisante.

Ensuite, aspirez la solution et rincez avec deux à trois millilitres de PBS. Ajouter 500 à 1000 microlitres de solution bloquante aux cellules et incuber pendant au moins une heure pour les lames de la chambre, et pendant trois à quatre heures pour les microtissus. Incuber les échantillons avec des anticorps conjugués dans la solution bloquante pendant une heure pour les lames de la chambre et pendant la nuit à quatre degrés Celsius pour les microtissus cardiaques.

Lavez les glissières de chambre trois fois avec 500 microlitres de 0,1% Tween 20, avec des durées de cinq minutes entre chaque lavage, puis effectuez un lavage final avec PBS. Lavez les microchoirs cardiaques cinq fois avec deux millilitres de 0,1% Tween 20, avec une durée de 20 minutes entre chaque lavage. Ensuite, effectuez un lavage final pendant 20 minutes supplémentaires.

Incuber les cellules ou les microtissus avec du DAPI avant la microscopie confocale, puis transférez soigneusement les microtissus cardiaques dans une boîte à fond en verre de 35 millimètres et ajoutez du PBS pour immerger le microtissu. Rincez les microtissus hors des renfoncements circulaires avec un moyen à l’aide d’une pointe de pipette large ou d’un millilitre dans un tube chronique de 15 millilitres et laissez-les se déposer. Ensuite, aspirez le milieu et rincez avec un millilitre de PBS.

Ajouter 200 à 300 microlitres du tampon de digestion enzymatique et incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, mélangez doucement les microtissus pendant une minute et répétez l’incubation. Après l’incubation, mélanger vigoureusement les microtissus avec une pointe de pipette ordinaire d’un millilitre pour les digérer en cellules individuelles.

Obtenez une suspension cellulaire trouble et neutralisez immédiatement la suspension cellulaire avec cinq millilitres de milieu contenant 5% de FBS. Filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’une passoire cellulaire de 40 micromètres et compter le nombre total de cellules. Centrifuger la suspension monocellulaire à 300 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Aspirer le surnageant et remettre les cellules dans un tampon de liaison annexine avec l’annexine annexine V et l’iodure de propidium, ou colorant d’exclusion des cellules mortes TO-PRO-3, et incuber pendant 10 minutes sur de la glace. Après l’incubation, ajouter 300 microlitres du tampon de liaison à l’annexine à la suspension cellulaire et le transférer dans un tube FACS à fond rond pour l’analyse de cytométrie en flux. Des cardiomyocytes, des cellules endothéliales et des fibroblastes cardiaques induits par des cellules souches pluripotentes purifiées ont été visualisés à l’aide de la microscopie à contraste de phase.

La pureté des différents types de cellules a été déterminée à l’aide de la coloration immunologique et de la cytométrie en flux. La troponine T a été utilisée comme marqueur pour les cardiomyocytes, et plus de 90% de pureté a été atteinte. La molécule d’adhésion des cellules endothéliales plaquettaires CD31 et la vimentine ont été utilisées comme marqueurs pour les cellules endothéliales et les fibroblastes cardiaques, et ont indiqué une pureté supérieure à 98 et 96% respectivement.

La coloration par immunofluorescence a révélé que les cardiomyocytes étaient les plus lourds et occupaient le centre des microtissus, tandis que les cellules endothéliales étaient intercalées dans les microtissus et que les fibroblastes cardiaques occupaient principalement la périphérie. La digestion des microtissus à l’aide de ce rythme un et de Liberase TL a entraîné des proportions cellulaires très viables avec moins de cellules apoptotiques après deux semaines de culture. L’exposition d’une heure des microtissus cardiaques à une concentration élevée de doxorubicine induit une cardiotoxicité dose-dépendante.

La contractilité des microchotéristes et le mouvement des vecteurs ont généré une pseudo carte thermique qui illustrait le profil de contraction moyen à travers le microtissu. Le mouvement contractile des microtissus cardiaques a généré des pics positifs qui ont été mesurés comme la vitesse de contraction, la vitesse de relaxation et le taux de battement, qui a été calculé comme le temps entre deux cycles de contraction. La contractilité des microtissus cardiaques était constante pendant quatre semaines en culture.

Le chauffage des cellules est l’une des étapes les plus importantes de ce protocole particulier, où il faut prendre soin de distribuer soigneusement la suspension cellulaire goutte à goutte dans le réseau d’agarose pour une distribution uniforme dans les micropuits et pour éviter les débordements. En utilisant le protocole de rayonnement optimisé de ces microtissus, on pourrait les soumettre à des technologies de séquençage à haut débit, telles que l’ARN-seq unicellulaire ou l’ATAC-seq à cellule unique pour comprendre les modèles d’expression génique spécifiques aux cellules résultant de différentes conditions de traitement.