Microinjection d’oeufs et accouplement efficace pour l’édition du génome dans le Firebrat Thermobia domestica

Parce que Thermobia domestica est un insecte basal, les études génétiques sur cette espèce mettront en lumière les mécanismes sous-jacents à l’évolution des innovations clés chez les insectes, telles que le vol motorisé et les métamorphoses. Ce protocole couvre les techniques de base allant de l’entretien de la culture à la micro-injection d’œufs pour mettre en œuvre Thermobia en tant qu’espèce modèle de laboratoire. Cette méthode peut également être utilisée pour l’application d’autres outils génétiques tels que l’inactivation de gènes médiée par RNI et la transgenèse dans la thermobie.

Maintenez les populations de type sauvage et mutants dans un grand récipient en plastique avec de la nourriture artificielle pour poissons régulière, de l’eau dans des gobelets en plastique avec un trou de ventilation sur le dessus, un papier plié pour cacher les insectes et du coton stratifié pour pondre des œufs. Conservez toutes les cultures de T. domestica à l’intérieur d’incubateurs à 37 degrés Celsius et réglez l’humidité relative à l’intérieur de chaque récipient à 60 à 80 %Pour préparer la collecte d’œufs, transférez environ 20 adultes mâles et 20 femelles adultes dans un récipient de taille moyenne avec de la nourriture, une réserve d’eau, un papier plié et un petit morceau de coton stratifié pour la ponte. Mettez en place plusieurs colonies pour obtenir un grand nombre d’embryons stadifiés dans un court laps de temps.

Le jour de l’injection, remplacez le coton à l’intérieur des contenants par du coton neuf. Huit heures plus tard, récupérez les œufs du coton superposé en séparant les couches à l’aide d’une pince. Alignez les œufs sur le ruban adhésif double face à l’aide d’un pinceau humide en gardant une distance de deux millimètres entre les œufs.

Tous les œufs doivent être orientés de manière à ce que l’axe longitudinal d’un œuf fasse face au côté de l’injection. Appuyez doucement sur les œufs avec un pinceau pour les maintenir fermement pendant l’injection. Chargez deux microlitres de la solution d’ARNg CAS9 dans un capillaire d’injection de verre à l’aide d’un microchargeur.

Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la solution avant l’injection. Si nécessaire, tapotez l’aiguille pour enlever les bulles. Optimisez la forme de la pointe de l’aiguille en la cassant légèrement à l’aide d’une pince pour éviter le colmatage et obtenir une meilleure durabilité tout au long d’une série d’injections.

Insérez l’aiguille au milieu de l’axe longitudinal d’un œuf et injectez une petite quantité de solution. Ajustez la configuration du micro-injecteur électronique pendant l’injection, en fonction de la forme de la pointe de l’aiguille. Conservez les œufs injectés dans un récipient de taille appropriée avec 60 à 80 % d’humidité relative à 37 degrés Celsius.

Vérifiez périodiquement les œufs injectés et jetez les œufs endommagés pour éviter la croissance fongique. Si trop de champignons se développent sur un œuf, nettoyez la surface de l’œuf avec de l’éthanol à 70 %. Avant l’éclosion, trempez la lame de verre avec les œufs injectés dans du talc pour enrober la surface du ruban adhésif double face.

Cela évitera l’empilement des nymphes écloses. Transférez les lames de verre enduites de poudre dans un récipient de taille moyenne avec de la nourriture, de l’eau et du papier plié. Isolez les nymphes G1 dans des plaques de 24 puits à l’aide d’un aspirateur ou d’un pinceau.

Maintenez l’approvisionnement en nourriture artificielle régulière pour poissons. Placez les plaques de 24 puits dans un récipient plus grand avec une alimentation en eau pour une humidité de 60 à 80 %Pincez et tirez un cerque d’une nymphe ou d’un adulte à l’aide d’une pince et recueillez-les dans un tube de 0,2 millilitre contenant 50 microlitres d’éthanol. Conservez les échantillons prélevés à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à long terme.

Placez les tubes d’échantillon avec les couvercles ouverts sur un bloc thermique pendant 15 minutes à 70 degrés Celsius pour évaporer l’éthanol. L’injection du complexe ribonucléoprotéique ARNg CAS9 dans les embryons dans les huit premières heures suivant la ponte entraîne la formation d’indels au site ciblé de l’ARNg. Cela provoque des mutations bialléliques dans certaines cellules de la génération injectée et des phénotypes de mosaïque mutante sont généralement obtenus.

Lorsque ce protocole a été utilisé pour injecter un ARNg conçu pour cibler le gène blanc, 32,6 % des nymphes G0 ont présenté une perte partielle de pigmentation dans leurs yeux composés et leurs régions dorsales. L’évaluation de la transformation germinale des adultes G0 et des individus G1 mutés a été effectuée par PCR génomique suivie d’un test de mobilité hétéro duplex. Dans les échantillons G1, les modèles de bandes différentielles entre les échantillons de type sauvage et les échantillons mutés sont clairement distinguables.

L’édition du génome dans Thermobia fournit une approche solide pour analyser les mécanismes génétiques sous-jacents aux traits prématurés des insectes. Il est utile d’explorer les secrets de leur succès exceptionnel et du nôtre.