Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Ce protocole peut fournir des mesures à haut débit de l’électrophysiologie cellulaire d’une manière qui convient à la technologie en développement rapide des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est moins complexe et moins laborieuse que la technique traditionnelle du patch clamp, mais qu’elle est capable de produire des résultats équivalents. Ainsi, ce protocole peut être étendu à des programmes de dépistage de la toxicité à grande échelle utilisant des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines.

Par exemple, le test complet de proarythmie in vitro. Pour préparer des cultures de cardiomyocytes dérivées de cellules souches pluripotentes induites pour l’expérience, appliquez d’abord des lamelles individuelles en verre rond de 10 millimètres avec 150 microlitres de matrice de membrane basale 1:60 dans chaque puits d’une plaque de 24 puits, puis incubez les lamelles à quatre degrés Celsius pendant quatre heures. À la fin de l’incubation, retirer l’excédent de matrice des lamelles et appliquer le volume approprié de cellules sur chaque lamelle.

Après une heure à 37 degrés Celsius, remplissez soigneusement chaque puits de milieu de placage et remettez l’assiette dans l’incubateur. Pour vous préparer à l’imagerie à colorant sensible à la tension, équipez un microscope à épifluorescence inversée d’un objectif à grande ouverture numérique à grossissement 40x et couplez une LED blanc chaud à commutation rapide au port d’éclairage transmis. Insérez un simple filtre rouge de 660 nanomètres dans le chemin de la lumière transmise et montez une tête LED de 470 nanomètres à commutation rapide pour l’enregistrement photométrique.

Insérez un filtre d’excitation 470/40 au niveau de l’orifice d’épifluorescence pour nettoyer la lumière générée par la LED, et insérez un cube de microscope contenant un séparateur de faisceau passe-long de 495 nanomètres dans le carrousel de l’unité de miroir à l’intérieur du microscope. Installez un bras de détection contenant un diaphragme de champ réglable sur le port de la monture C pour permettre la sélection de la région d’intérêt, et couplez un détecteur PMT et une caméra USB au microscope. Insérez un cube de filtre contenant un séparateur de faisceau passe-long de 565 nanomètres et un filtre d’émission 535/50 dans le port PMT pour répartir la lumière d’émission entre les deux détecteurs.

Couplez le PMT à une alimentation et à un amplificateur PMT, et connectez la sortie de l’amplificateur PMT à une broche d’entrée analogique d’un système d’acquisition de données. Pour répondre aux critères de Nyquist et pour éviter le repliement, filtrez les données analogiques du PMT à un kilohertz ou plus, et numérisez les données à une fréquence qui est au moins le double de celle de la fréquence la plus élevée présente dans le signal analogique. Pour charger les cellules avec un colorant sensible à la tension, mélangez cinq microlitres de 1000x FluoVolt et 50 microlitres de solution de charge électrique, et ajoutez trois microlitres de la solution de charge résultante à trois millilitres de solution de Tyrode réchauffée dans une boîte de Pétri.

Ajoutez une seule lamelle recouverte de cardiomyocytes dérivé de cellules souches pluripotentes induites dans la boîte et placez la boîte à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Montez une chambre d’imagerie de cellules vivantes chauffée sur la platine du microscope et remplissez la chambre de 500 microlitres de solution fraîche de Tyrode. Ensuite, lavez la lamelle avec une solution fraîche de Tyrode à 37 degrés Celsius et à l’aide d’une pince à pointe fine, transférez soigneusement la lamelle dans la chambre de bain préchauffée.

Pour normaliser la dynamique cellulaire et les paramètres expérimentaux, insérez deux électrodes de platine dans la chambre, espacées de cinq millimètres, et connectez les électrodes à un stimulateur externe. Réglez le stimulateur sur des impulsions de champ bipolaire de cinq millisecondes à 0,5 hertz et augmentez le stimulus d’un volt jusqu’à ce que les cellules commencent à se contracter. Réglez ensuite la tension à environ 25 % au-dessus de ce seuil.

Pour l’acquisition du potentiel d’action optique, utilisez le chemin de la lumière transmise et la caméra USB pour visualiser les myocytes dans des conditions de fond clair. Sélectionnez une cellule isolée et utilisez le diaphragme de champ pour recadrer étroitement son chemin optique, en veillant à ce que seule la lumière de la cellule d’intérêt soit surveillée. Activez l’amplificateur PMT et réglez l’alimentation PMT sur 750 volts.

Exécutez le protocole de stimulation avec le logiciel d’acquisition tout en activant simultanément la lumière d’excitation de 470 nanomètres. Enregistrez 10 balayages, en veillant à ce que des potentiels d’action stables soient détectés. Après le dernier balayage, déplacez immédiatement la platine du microscope tout en continuant à enregistrer pour acquérir brièvement le signal de fond d’une région dépourvue de cellules et éteindre la lumière d’excitation.

Pour analyser les données de potentiel d’action, ouvrez un enregistrement enregistré dans le logiciel d’analyse approprié et faites la moyenne de 10 balayages contenant des potentiels d’action stimulés à partir d’une seule cellule. Soustrayez la moyenne du signal de base représentant le décalage de fluorescence de la trace moyenne, puis utilisez la formule pour calculer la variation de fluorescence en utilisant la fluorescence diastolique comme F0. Identifier les zones d’intérêt diastolique et le potentiel d’action et mesurer les paramètres de potentiel d’action cardiaque souhaités, y compris, mais sans s’y limiter, la durée à 50 % et 90 % de repolarisation. Exportez ensuite les données de cette cellule unique vers un tableur.

Cette méthode permet une quantification rapide et précise de la mécanique de repolarisation, ce qui peut fournir des informations précieuses sur les anomalies ioniques cellulaires. Des caractéristiques prononcées de la première phase peuvent être observées dans les signaux optiques des cardiomyocytes murins, qui sont morphologiquement distincts de ceux des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. De plus, les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme répondent à la manipulation pharmacologique avec la nifédipine, un antagoniste connu des canaux calciques de type L.

Lors de l’application continue du médicament, une diminution de 41,5 % de la durée du potentiel d’action à 90 % de repolarisation a été observée, ce qui suggère la fonctionnalité de l’imagerie basée sur un indicateur de tension fluorescente comme plate-forme pour des études prospectives de dépistage de médicaments cardiaques à haut débit. Il est important de garder à l’esprit que bien que le colorant sensible à la tension utilisé dans cette étude soit moins cytotoxique que les autres, la lumière d’excitation doit toujours être utilisée avec parcimonie pour conserver la viabilité cellulaire. L’équipement de photométrie modulatoire utilisé dans ce protocole est incroyablement polyvalent.

Par exemple, il peut être utilisé pour des mesures simultanées d’autres paramètres électrophysiologiques, tels que le calcium intracellulaire.