Name: Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Découvrez la mesure optique du potentiel d'action dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines. Cette méthode simplifie l'électrophysiologie cellulaire pour le dépistage de toxicité à grande échelle.

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Les auteurs tiennent à remercier Cairn Research Ltd. pour leur aimable contribution financière qui a couvert les coûts de production de cette publication. De plus, nous remercions Mme Ines Mueller et Mme Stefanie Kestel pour leur excellent soutien technique.
Les recherches des auteurs sont soutenues par le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 et dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne - EXC 2067/1- 390729940) et la Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).

1. Préparations cellulaires
REMARQUE: Les CS IPS humains utilisés dans ce protocole ont été dérivés de donneurs sains et différenciés en monocouches en utilisant une modulation de petites molécules entièrement définie des techniques de signalisation WNT et de purification du lactate comme décrit précédemment12,13,14. Les iPSC-CM ont été maintenus tous les 2-3 jours avec un milieu de culture décrit ci-dessous.
<ol><li>Préparer un milieu de culture de milieu basal (RPMI 1640) et un supplément à 2% (B27). Conserver à 4 °C. Utilisation à température ambiante (RT).</li>
	<li>Préparer un milieu de placage de milieu basal (RPMI 1640), de supplément à 2% (B27) et d’inhibiteur de ROCK 1:2000. Conserver à 4 °C. Utilisation à RT.</li>
	<li>Recouvrir les couvercles en verre rond #0 de 10 mm stérilisés avec 150 μL de matrice de membrane basale sans facteur 1:60 et incuber à 4 °C pendant 4 h. REMARQUE: L’optimisation du volume de glissement des couvercles est nécessaire pour s’assurer que tout le verre est recouvert tout en maintenant une tension superficielle adéquate pour éviter les déversements. 150 μL est recommandé pour les couvercles ronds de 10 mm. La taille du lot, le type de couvercle, le volume du couvercle et le type de plaque de culture peuvent être adaptés aux besoins des expérimentateurs.</li>
	<li>Commencez la dissociation iPSC-CM avec un réactif de dissociation cellulaire à base d’EDTA. Assurez-vous que la monocouche est complètement détachée en rinçant doucement avec une pipette de 1 000 μL.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et ajouter un milieu de placage à double volume. Centrifuger pendant 10 min à 100 x g.</li>
	<li>Resuspendez la pastille avec le volume souhaité (volume de remise en service) du milieu de placage. Compter les cellules manuellement ou électroniquement.</li>
	<li>Sélectionnez la densité optimale par couvercle (15 000) qui permettra l’analyse cellulaire isolée plus tard.</li>
	<li>Calculez le volume de suspension cellulaire « active » (A) nécessaire pour plaquer tous les couvercles à cette densité souhaitée. Appliquez la formule suivante et retirez dans un tube séparé: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ01v2.jpg">
</li>
	<li>Calculez le volume de milieu de placage supplémentaire (B) nécessaire pour accueillir chaque couvercle à un volume souhaité. Appliquez la formule suivante et ajoutez le volume obtenu au tube de suspension active: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ02v2.jpg">
</li>
	<li>Retirez la matrice des couvercles et appliquez le « volume du couvercle » de la suspension cellulaire (A + B) sur chaque couvercle. Ressuspendez régulièrement dans le tube pour assurer une distribution cellulaire uniforme.</li>
	<li>Incuber à 37 °C pendant 1 h. Remplissez doucement le puits avec du milieu de placage.</li>
	<li>Après 24 h, échangez les médias avec le milieu de culture normal et maintenez tous les 2-3 jours.</li>
</ol>2. Configuration expérimentale
<ol><li>Équipez un microscope à épifluorescence inversée d’une lentille à haute ouverture numérique à grossissement de 40x (N.A: &gt; 0,75) pour mener des expériences.</li>
	<li>Couplez une LED blanche chaude à commutation rapide sur le port d’éclairage transmis du microscope. Insérez un simple filtre rouge de 660 nm dans le trajet de la lumière transmise. REMARQUE: Cette lumière peut être activée tout au long des expériences de photométrie pour observer l’échantillon sans contaminer le signal fluorescent vert.</li>
	<li>Montez une tête LED à commutation rapide de 470 nm pour l’enregistrement photométique. Insérez un filtre d’excitation 470/40 à l’angle épifluorescent du microscope pour nettoyer la lumière générée par la LED. REMARQUE: Pour une quantification optimale du signal, un système d’éclairage avec contrôle de rétroaction à haute vitesse de la sortie optique est recommandé.</li>
	<li>Insérez un cube de microscope contenant un séparateur de faisceau de passage de 495 nm de long dans le carrousel de l’unité miroir du microscope.</li>
	<li>Ajustez un bras de détection contenant un diaphragme de champ réglable sur le port de monture C du microscope pour permettre la sélection de la région d’intérêt.</li>
	<li>Couplez séparément un détecteur photomultiplicateur (PMT) et une caméra USB au microscope. Cela constituera la base du système de détection des émissions.</li>
	<li>Insérez un cube filtrant contenant un séparateur de faisceau passe-long de 565 nm et un filtre d’émission 535/50 dans le port PMT. Cela divise la lumière d’émission entre les deux détecteurs. REMARQUE: Une caméra fixée au port transmis du système de détection des émissions peut détecter la lumière transmise sous fond clair tout au long de toutes les expériences.</li>
	<li>Couplez le PMT à une alimentation et à un amplificateur PMT. Connectez la sortie de l’amplificateur PMT à une broche d’entrée analogique d’un système d’acquisition de données.</li>
	<li>Filtrez les données analogiques du PMT à 1 kHz ou plus.</li>
	<li>Numérisez les données à une fréquence au moins le double de celle de la fréquence la plus élevée présente dans le signal analogique (2 kHz ou plus) pour répondre aux critères de Nyquist et empêcher l’aliasing.</li>
</ol>3. Chargement cellulaire avec VF2.1Cl
REMARQUE: Toutes les étapes impliquant ce colorant doivent être effectuées dans des conditions de faible luminosité.
<ol><li>Préparer une solution de bain de Tyrode de (en mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glucose, 4 KCl, 1 MgCl2,2 CaCl2,pH = 7,35 et chaud à 37 °C.</li>
	<li>Préparer une aliquote de solution de chargement dans un tube de microcentrifugation en mélangeant 5 μL de 1 000 x VF2.1Cl et 50 μL de solution de poloxamère solubilisante à 20 %.</li>
	<li>Appliquer 5 μL de la solution de chargement sur 5 mL de solution de Tyrode chauffée (concentration totale de colorant de 0,1x) dans une boîte de Petri de 20 mm. REMARQUE: La concentration finale de colorant est de 0,1x. C’est1/10ème de ce qui a été suggéré par le fabricant. Cela permet de préserver les ressources, d’assurer une cytotoxicité négligeable et, surtout, de conserver des signaux optiques clairs provenant de cellules chargées avec des rapports signal/bruit élevés.</li>
	<li>Ajouter un seul couvercle iPSC-CM au plat et incuber à 37 °C pendant 20 min.</li>
	<li>Assemblez une chambre d’imagerie à cellules vivantes chauffée. Montez sur l’étage du microscope et remplissez avec 500 μL de solution fraîche de Tyrode.</li>
	<li>Laver le couvercle avec la solution fraîche de Tyrode à 37 °C.</li>
	<li>Appliquez soigneusement le couvercle iPSC-CM sur la chambre de bain préchauffée à l’aide de pinces à pointe fine. REMARQUE: Assurez-vous que la chambre et son contenu sont toujours chauffés à des températures physiologiques. Si vous le souhaitez, commencez par une perfusion continue de la solution de Tyrode réchauffée.</li>
</ol>4. Stimulation du champ électrique
REMARQUE: Le déclenchement externe d’iPSC-CM est facultatif mais utile pour la normalisation de la dynamique cellulaire et des paramètres expérimentaux. Il augmente la facilité d’analyse et permet d’enquêter sur les effets dépendant de la fréquence.
<ol><li>Fixez un insert de stimulation avec deux électrodes en platine espacées de 5 mm dans la chambre d’enregistrement.</li>
	<li>Connectez un stimulateur externe à l’insert de stimulation. Réglez sur des impulsions de champ bipolaire de 5 ms à 0,5 Hz.</li>
	<li>Déterminez la tension de stimulation optimale en augmentant le stimulus de 1 V vers le haut. Le stimulus de seuil est défini comme la tension la plus basse à laquelle les cellules commencent à se contracter. Appliquez des tensions d’environ 25 % au-dessus de ce seuil. La plage normale est comprise entre 1 V et 30 V.</li>
	<li>Fixez la fréquence de stimulation avec le stimulateur externe ou déclenchez-la avec un logiciel d’acquisition.</li>
</ol>5. Acquisition de potentiel d’action optique
REMARQUE: Ce protocole utilise un logiciel commercial pour l’acquisition et l’analyse.
<ol><li>Visualisez les myocytes en mode champ clair à l’aide du chemin de lumière transmis et de la caméra USB.</li>
	<li>Sélectionnez une cellule isolée et recadrez étroitement son chemin optique avec le diaphragme de champ en veillant à ce que seule la lumière de la cellule d’intérêt soit surveillée.</li>
	<li>Activez l’amplificateur PMT et réglez l’alimentation PMT sur 750 V.</li>
	<li>Exécutez le protocole de stimulation (voir étape 4) avec le logiciel d’acquisition et activez simultanément la lumière d’excitation de 470 nm. Ce dernier peut se faire via un panneau distant ou automatisé à une intensité fixe (signal TTL).</li>
	<li>Ajustez le gain et le décalage de l’amplificateur PMT pour vous assurer que le signal ne sature pas et est optimisé pour la plage de détection du système d’enregistrement.</li>
	<li>Enregistrez 10 balayages en veillant à ce que des potentiels d’action stables soient détectés.</li>
	<li>Continuez l’enregistrement et déplacez immédiatement l’étage du microscope pour acquérir brièvement le signal de fond d’une région dépourvue de cellules. Éteignez le voyant d’excitation. REMARQUE: Cette valeur de fond(décalage F) sera utilisée pour tenir compte de toute fluorescence de fond.</li>
	<li>Si vous le souhaitez, perfuser localement des médicaments de référence tels que la nifédipine de 1 μM pour identifier les réponses cellulaires à la manipulation pharmacologique.</li>
	<li>De manière séquentielle, répétez les étapes 5.2 à 5.7, en sélectionnant chaque fois une nouvelle cellule. Remplacez les couvercles si vous le souhaitez pour assurer un roulement expérimental élevé en une seule séance. REMARQUE : Les protocoles de chargement et d’acquisition d’images sont décrits à la figure 2.</li>
</ol>6. Analyse des données
<ol><li>Ouvrez un enregistrement enregistré avec le logiciel d’analyse et en moyenne 10 balayages contenant des potentiels d’action stimulés à partir d’une seule cellule.</li>
	<li>Prenez une moyenne du signal de base représentant ledécalage F et soustrayez-la de la trace moyenne.</li>
	<li>Calculer ∆F/F0 avec la formule suivante (où F est mesuré fluorescence et F0 est fluorescence diastolique) : <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ03v2.jpg">
</li>
	<li>Identifier la trace de référence (diastolique) et la zone d’intérêt (PA) et mesurer les paramètres de potentiel d’action cardiaque souhaités. Cela inclut, mais sans s’y limiter, le temps de désintégration pour la repolarisation à50%(APD 50) età 90%(APD 90).</li>
	<li>Exportez les données de cette cellule unique vers un tableur.</li>
	<li>Répétez les étapes 6.1 à 6.5 pour tous les enregistrements. Évaluer les résultats à l’auprès de tests non appaire appropriés ou d’une analyse de la variance.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2.jpg"> Figure 2 : Protocoles de chargement et d’acquisition d’images. (A) Organigramme du protocole complet de chargement VF2.1Cl pour les iPSC-CM et les cardiomyocytes natifs. (B) Schéma simplifié des configurations de séparateur de faisceau (BS) et de filtre utilisées dans ce protocole pour l’excitation et la détection de l’émission de VF2.1Cl en réponse aux changements de tension transmembranaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
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<li>Képiró, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((para-Nitroblebbistatin%2C+the+non-cytotoxic+and+photostable+Myosin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li>
</ol>

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Nous décrivons ici un protocole de base permettant d’acquérir facilement des profils AP détaillés à partir d’iPSC-CM isolés adaptés à la modélisation électrophysiologique et au dépistage de médicaments cardiaques. Nous détectons des points d’accès réguliers et robustes à partir de nos iPSC-MC peu ensemencés, ce qui suggère à la fois la fonctionnalité des indicateurs et la fidélité méthodologique.
En raison du large éventail de méthodologies commerciales pour la reprogrammation iPSC et du manqu...

La modélisation électrophysiologique des cardiomyocytes et la construction de plateformes efficaces pour le dépistage des médicaments cardiaques sont essentielles pour le développement de stratégies thérapeutiques pour une variété de troubles arythmiques. L’expansion rapide de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (IPSC) a produit des percées prometteuses dans la modélisation des maladies humaines et l’investigation pharmacologique à l’aide de cardiomyocytes dérivés de patients isolés (iPSC-CM). Les techniques de « référence » pour la caractérisation électrophysiologique de ces cellules par patch-clamp (current-clamp) peuvent quantifier la morphologie et la durée du potentiel d’action (AP), cependant, cette méthode est incroyablement complexe et lente, et mal adaptée à l’acquisition de données à haut débit1. On rapporte régulièrement que les iPSC-CM ont un potentiel de membrane diastolique accru et un courant de fuite accru par rapport aux cardiomyocytes natifs adultes2. Il est suggéré que la plus petite taille des cellules et la capacité membranaire réduite observée dans les iPSC-CM peuvent produire une erreur systématique lors de l’utilisation de la technique de serrage de courant, expliquant peut-être ces écarts3. Afin de maximiser l’utilité d’une plate-forme iPSC-CM, une méthode supplémentaire est précieuse pour augmenter le débit et assurer la précision des données lors de la caractérisation des changements de tension transmembranaire au niveau d’une seule cellule dans les iPSC-CM.
Les colorants sensibles à la tension (VSD) sont depuis longtemps une méthode proposée pour fournir une analyse plus rapide, non invasive et équivalente de la cinétique des AP cardiaques par rapport à celles des techniques traditionnelles4. Une étude récente a démontré l’adéquation de la photométrie de sonde sensible à la tension ratiométrique pour quantifier avec précision l’APcardiaque 5. De plus, la capacité d’étendre facilement les approches de photométrie optique prête cette technique aux écrans de cardiotoxicité à grande échelle essentiels au développement de médicaments thérapeutiques (par exemple, CiPA). Le développement de protocoles de cardiotoxicité standardisés dans le cas d’une étude multi-sites en aveugle utilisant des techniques optiques de réseau de microélectrodes et de détection de tension a démontré la valeur clé de cette approche6.
De nombreux colorants potentiométriques sont disponibles dans le commerce, et le développement synthétique en cours de nouvelles sondes montre un potentiel passionnant pour rationaliser leur efficacité dans une variété de constructions cardiaques et neuronales. Le VSD idéal aura une cinétique et une sensibilité accrues, tout en affichant une diminution de la charge capacitive, du photobleaching et de la cytotoxicité. Le VF2.1Cl (FluoVolt) récemment synthétisé exprime bon nombre de ces propriétés bénéfiques en grande partie en raison de sa nouvelle structure moléculaire filaire, partagée par d’autres membres de la nouvelle famille VoltageFluor (VF)7. Contrairement aux VSD électrochromes courants dans lesquels de simples sondes se conjuguent moléculairement et électriquement à la membrane plasmique, ce colorant consiste en un fil synthétique inséré passivement et couvrant la membrane qui associe un donneur riche en électrons à un fluorophore de fluorescéine modifié (FITC). Les détails mécanistes sont fournis à la figure 1. Ce colorant démontre une excellente sensibilité aux fluctuations de tension de la membrane, affichant un changement de 27% de l’intensité d’émission par 100 mV contre environ 10% observé dans d’autres sondes courantes à des vitesses comparables7. En outre, les systèmes PeT à base de fil n’interagissent pas directement avec le champ électrique cellulaire, ce qui produit des interférences électriques minimales et des changements négligeables de la charge capacitive cellulaire.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig01.jpg"> Figure 1 : Paramètres chimiques, spectraux et mécanistes du colorant VF2.1Cl. (A) Structure chimique de VF2.1Cl. Les caractéristiques moléculaires à noter comprennent de multiples groupes alkyles dans le fil moléculaire phénylène vinylène qui facilitent l’insertion dans la membrane plasmique. Un groupe d’acide sulfonique chargé négativement conjugué à la sonde FITC assure la stabilisation du fluorophore sur la surface extracellulaire et facilite l’insertion près perpendiculaire par rapport au champ électrique de la bicouche lipidique. (B) Schéma simplifié de VF2.1Cl perpendiculaire s’intégrant dans la membrane plasmique d’une cellule cible. (C) Spectres d’absorption et d’émission du colorant VF2.1Cl. Spectra est identique à celui des sondes FITC et GFP standard. (D) Représentation du mode d’action mécaniste de VF2.1Cl. Dans des conditions de repos (hyperpolarisées), des tensions intracellulaires négatives entraînent les électrons libres vers le fluorophore rostral. L’abondance d’électrons garantit que le transfert d’électrons photo-induit (PeT) est privilégié comme une voie hors de l’état excité après l’excitation optique, éteignant efficacement la fluorescence. En revanche, un potentiel membranaire dépolarisé influence le mouvement descendant des électrons favorisant la fluorescence lors de l’excitation optique. La réponse fluorescente qui en résulte est linéairement liée à la tension de la membrane et peut être utilisée avec précision pour recueillir des informations temporelles détaillées sur la cinétique électrophysiologique cellulaire. (E) Images représentatives en champ lumineux (supérieur) et fluorescence à 470 nm (inférieur) de cardiomyocytes de léporine chargés de VF2.1Cl. (F) Z pile d’un seul cardiomyocyte chargé. Les flèches indiquent les zones de localisation claire de VF2.1Cl à la membrane cellulaire. Les images ont été acquises avec un système confocal à disque rotatif composé d’une tête confocale à disque rotatif X-lightv3 avec un motif sténopé de 50 μm; Illuminateur LDI-7; Caméra Prime95B et objectif PlanApo Lambda 100x. Barre d’échelle : 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La sonde FITC conjuguée à VF2.1Cl garantit qu’elle peut être utilisée efficacement dans des configurations de filtre standard et GFP, et qu’elle ne nécessite qu’un système d’acquisition à canal unique, qui sont toutes deux des caractéristiques communes des plates-formes d’imagerie fluorescente. L’analyse de monocouches iPSC-CM humaines denses avec ce colorant a été récemment rapportée8,9,10,11. Notre protocole diffère de ces études en raison de notre étude des iPSC-CC uniques et isolés, non perturbés par les influences électriques et paracrines des monocouches syncytaires denses, et de notre utilisation d’un système de photométrie abordable et personnalisable par opposition à des arrangements complexes d’imagerie confocale ou à grand champ.
Nous décrivons ici notre protocole pour l’acquisition et l’analyse rapides de points d’accès optiques robustes à partir de cardiomyocytes humains isolés dérivés de l’iPSC et de cardiomyocytes natifs (voir Dossier supplémentaire). Nous utilisons VF2.1Cl couplé à une plate-forme de pointe personnalisable pour les mesures de photométrie à cellule unique. Ces protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité d’éthique du Centre médical universitaire de Göttingen (n° 10/9/15).

<table><tbody><tr><td><Réactifs>fort</Trypsine EDTA></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 forte&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>supplément B27</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth&nbsp ;</td><td>HN04.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose anhydre&nbsp ; BioChemica</td><td>ITW Reagents</td><td>A1422</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Kit de potentiel de membrane FluoVolt&nbsp ;</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth&nbsp ;</td><td>HN77.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Lamanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp ;</td><td>BD</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Nifédipine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21829-25-4</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de ROCK Y27632</td><td>Stemolecule</td><td>04-0012-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td></td><td></td>61870010</tr><tr><td>Versene EDTA&nbsp ;</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>15040033</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>495LP Séparateur de faisceau dichroïque&nbsp ;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplificateur&nbsp ;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Couvercles circulaires, épaisseur 0</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual OptoLED Alimentation&nbsp ;</td><td>Recherche sur Cairn&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’excitation ET470/40x&nbsp ;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET535/50m</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gravé Neubauer Hémacytomètre</td><td>Hausser Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter Cubes&nbsp ;</td><td>Recherche sur Cairn&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX73 Microscope inversé&nbsp ;</td><td>Olympe&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recherche sur</td><td>les cairns MonoLED&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adaptateurs multiports&nbsp ;</td><td>Recherche sur Cairn&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimulateur de cellules Myopacer&nbsp ;</td><td>Obturateur IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optomask&nbsp ;</td><td>Recherche sur Cairn&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de système Optoscan</td><td>Cairn Research&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate-forme à température contrôlée PH-1&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Warner Instruments&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Détecteur de photomultiplicateurs&nbsp ;</td><td>Recherche sur Cairn&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT Amplificateur Insert</td><td>Cairn Research&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT Supply Insert</td><td>Cairn Research&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RC-26G Chambre de bain ouverte&nbsp ;</td><td>Warner Instruments&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SA-OLY/2AL Adaptateur de platine&nbsp ;</td><td>Olympe&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T565lpxr Séparateur de faisceau dichroïque&nbsp ;</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T660LPXR Séparateur de faisceau dichroïque</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-20 Régulateur de température à deux canaux&nbsp ;</td><td>Objectif électronique</td><td></td><td></td>npi</tr><tr><td>UPLFLN 40X Olympus</td><td>&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caméra couleur USB 3.0</td>Source <td></td><td></td><td>d’imagerie</td></tr><tr><td><Logiciel>fort</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex 11.1</td><td>Dispositifs moléculaires&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositifs moléculaires Clampfit 11.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capture IC 2.4&nbsp ;</td><td>Source d’imagerie&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prisme 8</td><td>Bloc-notes</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Les techniques conventionnelles de microélectrode intracellulaire pour quantifier l’électrophysiologie des cardiomyocytes sont extrêmement complexes, nécessitent beaucoup de main-d’œuvre et sont généralement réalisées à faible débit. L’expansion rapide et continue de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSI) constitue une nouvelle norme dans la recherche cardiovasculaire et d’autres méthodes sont maintenant nécessaires pour augmenter le débit de données électrophysiologiques au niveau d’une seule cellule. VF2.1Cl est un colorant sensible à la tension récemment dérivé qui fournit une réponse rapide à canal unique et de grande magnitude aux fluctuations du potentiel membranaire. Il possède une cinétique supérieure à celle des autres indicateurs de tension existants et met à disposition des données fonctionnelles équivalentes à celles des techniques traditionnelles de microélectrode. Ici, nous démontrons une caractérisation simplifiée et non invasive du potentiel d’action dans des cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC à rythme externe à l’aide d’un système de photométrie modulaire et très abordable.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig03.jpg"> Figure 3 : Profils de potentiel d’action optique (PA) de cardiomyocytes natifs isolés et de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC-CM). (A) AP optique représentatif d’un seul cardiomyocyte murin (au centre) avec un SEM moyen ± d’APD50 et aPD90 (n = 7, à droite). (B) AP optique représentati...

Nous décrivons ici l’acquisition optique et la caractérisation des potentiels d’action à partir de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites à l’aide d’un système de photométrie modulaire à grande vitesse.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Ce protocole peut fournir des mesures à haut débit de l’électrophysiologie cellulaire d’une manière qui convient à la technologie en développement rapide des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est moins complexe et moins laborieuse que la technique traditionnelle du patch clamp, mais qu’elle est capable de produire des résultats équivalents. Ainsi, ce protocole peut être étendu à des programmes de dépistage de la toxicité à grande échelle utilisant des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines.Par exemple, le test complet de proarythmie in vitro. Pour préparer des cultures de cardiomyocytes dérivées de cellules souches pluripotentes induites pour l’expérience, appliquez d’abord des lamelles individuelles en verre rond de 10 millimètres avec 150 microlitres de matrice de membrane basale 1:60 dans chaque puits d’une plaque de 24 puits, puis incubez les lamelles à quatre degrés Celsius pendant quatre heures. À la fin de l’incubation, retirer l’excédent de matrice des lamelles et appliquer le volume approprié de cellules sur chaque lamelle.Après une heure à 37 degrés Celsius, remplissez soigneusement chaque puits de milieu de placage et remettez l’assiette dans l’incubateur. Pour vous préparer à l’imagerie à colorant sensible à la tension, équipez un microscope à épifluorescence inversée d’un objectif à grande ouverture numérique à grossissement 40x et couplez une LED blanc chaud à commutation rapide au port d’éclairage transmis. Insérez un simple filtre rouge de 660 nanomètres dans le chemin de la lumière transmise et montez une tête LED de 470 nanomètres à commutation rapide pour l’enregistrement photométrique.Insérez un filtre d’excitation 470/40 au niveau de l’orifice d’épifluorescence pour nettoyer la lumière générée par la LED, et insérez un cube de microscope contenant un séparateur de faisceau passe-long de 495 nanomètres dans le carrousel de l’unité de miroir à l’intérieur du microscope. Installez un bras de détection contenant un diaphragme de champ réglable sur le port de la monture C pour permettre la sélection de la région d’intérêt, et couplez un détecteur PMT et une caméra USB au microscope. Insérez un cube de filtre contenant un séparateur de faisceau passe-long de 565 nanomètres et un filtre d’émission 535/50 dans le port PMT pour répartir la lumière d’émission entre les deux détecteurs.Couplez le PMT à une alimentation et à un amplificateur PMT, et connectez la sortie de l’amplificateur PMT à une broche d’entrée analogique d’un système d’acquisition de données. Pour répondre aux critères de Nyquist et pour éviter le repliement, filtrez les données analogiques du PMT à un kilohertz ou plus, et numérisez les données à une fréquence qui est au moins le double de celle de la fréquence la plus élevée présente dans le signal analogique. Pour charger les cellules avec un colorant sensible à la tension, mélangez cinq microlitres de 1000x FluoVolt et 50 microlitres de solution de charge électrique, et ajoutez trois microlitres de la solution de charge résultante à trois millilitres de solution de Tyrode réchauffée dans une boîte de Pétri.Ajoutez une seule lamelle recouverte de cardiomyocytes dérivé de cellules souches pluripotentes induites dans la boîte et placez la boîte à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Montez une chambre d’imagerie de cellules vivantes chauffée sur la platine du microscope et remplissez la chambre de 500 microlitres de solution fraîche de Tyrode. Ensuite, lavez la lamelle avec une solution fraîche de Tyrode à 37 degrés Celsius et à l’aide d’une pince à pointe fine, transférez soigneusement la lamelle dans la chambre de bain préchauffée.Pour normaliser la dynamique cellulaire et les paramètres expérimentaux, insérez deux électrodes de platine dans la chambre, espacées de cinq millimètres, et connectez les électrodes à un stimulateur externe. Réglez le stimulateur sur des impulsions de champ bipolaire de cinq millisecondes à 0,5 hertz et augmentez le stimulus d’un volt jusqu’à ce que les cellules commencent à se contracter. Réglez ensuite la tension à environ 25 % au-dessus de ce seuil.Pour l’acquisition du potentiel d’action optique, utilisez le chemin de la lumière transmise et la caméra USB pour visualiser les myocytes dans des conditions de fond clair. Sélectionnez une cellule isolée et utilisez le diaphragme de champ pour recadrer étroitement son chemin optique, en veillant à ce que seule la lumière de la cellule d’intérêt soit surveillée. Activez l’amplificateur PMT et réglez l’alimentation PMT sur 750 volts.Exécutez le protocole de stimulation avec le logiciel d’acquisition tout en activant simultanément la lumière d’excitation de 470 nanomètres. Enregistrez 10 balayages, en veillant à ce que des potentiels d’action stables soient détectés. Après le dernier balayage, déplacez immédiatement la platine du microscope tout en continuant à enregistrer pour acquérir brièvement le signal de fond d’une région dépourvue de cellules et éteindre la lumière d’excitation.Pour analyser les données de potentiel d’action, ouvrez un enregistrement enregistré dans le logiciel d’analyse approprié et faites la moyenne de 10 balayages contenant des potentiels d’action stimulés à partir d’une seule cellule. Soustrayez la moyenne du signal de base représentant le décalage de fluorescence de la trace moyenne, puis utilisez la formule pour calculer la variation de fluorescence en utilisant la fluorescence diastolique comme F0. Identifier les zones d’intérêt diastolique et le potentiel d’action et mesurer les paramètres de potentiel d’action cardiaque souhaités, y compris, mais sans s’y limiter, la durée à 50 % et 90 % de repolarisation. Exportez ensuite les données de cette cellule unique vers un tableur.Cette méthode permet une quantification rapide et précise de la mécanique de repolarisation, ce qui peut fournir des informations précieuses sur les anomalies ioniques cellulaires. Des caractéristiques prononcées de la première phase peuvent être observées dans les signaux optiques des cardiomyocytes murins, qui sont morphologiquement distincts de ceux des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. De plus, les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme répondent à la manipulation pharmacologique avec la nifédipine, un antagoniste connu des canaux calciques de type L.Lors de l’application continue du médicament, une diminution de 41,5 % de la durée du potentiel d’action à 90 % de repolarisation a été observée, ce qui suggère la fonctionnalité de l’imagerie basée sur un indicateur de tension fluorescente comme plate-forme pour des études prospectives de dépistage de médicaments cardiaques à haut débit. Il est important de garder à l’esprit que bien que le colorant sensible à la tension utilisé dans cette étude soit moins cytotoxique que les autres, la lumière d’excitation doit toujours être utilisée avec parcimonie pour conserver la viabilité cellulaire. L’équipement de photométrie modulatoire utilisé dans ce protocole est incroyablement polyvalent.Par exemple, il peut être utilisé pour des mesures simultanées d’autres paramètres électrophysiologiques, tels que le calcium intracellulaire.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

La caractérisation électrophysiologique des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (CMH-CM) est cruciale pour la modélisation de la maladie cardiaque et pour la détermination des réponses aux médicaments. Ce protocole fournit les informations nécessaires pour dissocier et plaquer les CMH-CM sur les réseaux multi-électrodes, mesurer leur potentiel de terrain et une méthode pour analyser les intervalles QT et RR.

Analyse électrophysiologique des cardiomyocytes à base de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC-CM) utilisant des matrices multi-électrodes (MEA)

Nous présentons une méthode pour image optiquement les potentiels d’action, plus précisément dans les cardiomyocytes de cellules souches dérivées ventriculaire comme pluripotentes induites. La méthode est basée sur l’expression pilotée par le promoteur d’une protéine fluorescente sensibles au voltage.

Enregistrements de potentiel d’Action optique sous-type spécifique dans l’homme induit pluripotentes cellules souches dérivées des Cardiomyocytes ventriculaires

Cet article contient un ensemble de protocoles pour le développement des réseaux de cardiomyocytes pluripotents induits par l'homme (hiPSC-CM) cultivés sur des plaques MEA multiwell pour électroporater réversiblement la membrane cellulaire pour des mesures potentielles d'action. Les enregistrements à haut débit sont obtenus à partir des mêmes sites cellulaires à plusieurs reprises au cours des jours.

Réseaux de cardiomyocytes dérivés de l'iPSC sur des réseaux de micro-électrodes multipuits pour des enregistrements potentiels d'action récurrents

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) sont apparus comme un modèle in vitro prometteur pour le dépistage de la cardiotoxicité induite par les médicaments et la modélisation de la maladie. Ici, nous détaillons un protocole pour mesurer la contractilité et l’électrophysiologie des hiPSC-CMs.

Applications techniques des enregistrements de microélectrodes et de patch clamp sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

La combinaison de poration laser et de réseaux de microélectrodes (MEA) permet des enregistrements de type potentiel d’action de cardiomyocytes cultivés primaires et dérivés de cellules souches. La forme d’onde fournit un meilleur aperçu du mode d’action des composés de test que les enregistrements standard. Il relie patch-clamp et lecture MEA pour optimiser davantage la recherche sur la sécurité cardio à l’avenir.

Mesures de type potentiel d’action induite par laser de cardiomyocytes sur des réseaux de microélectrodes pour une prédictivité accrue de la pharmacologie de sécurité

Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM) offrent une alternative à l’utilisation d’animaux pour le dépistage cardiotoxique préclinique. Une limite à l’adoption généralisée des CSPhi-CM dans le dépistage de la toxicité préclinique est le phénotype immature, semblable au fœtus des cellules. Les protocoles pour une maturation robuste et rapide des CM-HIPSC sont présentés ici.

Criblage de cardiotoxicité à haut débit utilisant des monocouches de cardiomyocytes de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme mature

Ici, nous démontrons une méthode non invasive d’évaluation de la contractilité des dispositifs médicaux cardiaques utilisant des monocouches 2D de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC-CM), plaquées sur un substrat flexible, couplées à une microscopie vidéo. Cet outil sera utile pour l’évaluation in vitro des propriétés contractiles des appareils d’électrophysiologie cardiaque.

Évaluation de la thérapie de modulation de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes 2D dérivés de cellules souches humaines

Ici, une méthode établie est décrite pour effectuer des mesures de contractilité et de calcium dans des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme à l’aide d’une plate-forme optique. Cette plateforme permet aux chercheurs d’étudier l’effet des mutations et la réponse à divers stimuli de manière rapide et reproductible.

Mesures en temps réel des paramètres de calcium et de contractilité dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

L’utilisation de la lumière pour contrôler les cellules et les tissus cardiaques permet une stimulation sans contact, préservant ainsi l’état et la fonction naturels des cellules, ce qui en fait une approche précieuse pour la recherche fondamentale et les applications thérapeutiques.

Système microphysiologique cardiaque pour l’étude de la propagation du Ca2+ par stimulation optique non génétique

Optique résolution microscopie photoacoustique (OR-PAM) est une technologie émergente capable d'imagerie d'absorption optique des...

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Découvrez la mesure optique du potentiel d'action dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines. Cette méthode simplifie l'électrophysiologie cellulaire pour le dépistage de toxicité à grande échelle.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (Vidéo) | JoVE Journal

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

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