Name: Établir les exigences de pollinisation dans la prune japonaise par surveillance phénologique, pollinisation manuelle, microscopie à fluorescence et génotypage moléculaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Découvrez comment déterminer les exigences de pollinisation chez les prunes japonaises par pollinisation manuelle, microscopie à fluorescence et génotypage PCR. Cette méthode aide à identifier les pollinisateurs adaptés.

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Cette recherche a été financée par l’Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 et RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón —Fonds social européen, Union européenne (Grupo Consolidado A12-17R), et Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero a été soutenu par une bourse du Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología du Mexique (CONACYT, 471839).

1. Pollinisation manuelle sur le terrain
<ol><li>
Extraction du pollen
	<ol>
<li>Pour obtenir du pollen, collectez les boutons floraux au stade D24, selon le stade 57 sur l’échelle BBCH25,26. REMARQUE: Plus de boutons floraux sont nécessaires dans la prune japonaise que dans les autres espèces de Prunus parce que leurs anthères produisent moins de pollen.</li>
		<li>Retirez les anthères à l’aide d’un maillage en plastique (taille des pores de 2 mm x 2 mm) et placez-les sur du papier à température ambiante pendant 24 h jusqu’à la déhiscence de l’anthère.</li>
		<li>Tamiser les grains de pollen à travers une maille fine (taille des pores de 0,26 mm x 0,26 mm) et les conserver dans un tube en verre de 10 mL avec un bouchon à 4 °C jusqu’à utilisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pollinisation des fleurs émasculées
	<ol>
<li>Lorsqu’entre 10% et 20% des fleurs sont ouvertes, sélectionnez et étiquetez plusieurs branches. Enlevez les fleurs ouvertes et les jeunes bourgeons, ne laissant que les boutons floraux au stade D24, selon le stade 57 sur l’échelle BBCH25,26.</li>
		<li>Enlevez les pétales, les sépales et les étamines de 800 à 1 000 boutons floraux par traitement avec des ongles ou une pince à épier.</li>
		<li>Polliniser les pistils à la main à l’aide d’un pinceau fin 24 h après l’émasculation. Certaines branches contiennent la moitié des pistils avec du pollen du même cultivar, et l’autre moitié avec du pollen compatible d’un autre cultivar comme témoin. Veillez à ne pas contaminer le bout du doigt ou le pinceau avec des grains de pollen provenant d’autres cultivars.</li>
		<li>Enregistrez le nombre hebdomadaire de fleurs et de fruits en développement pour caractériser le modèle de chute de fruits et quantifier la fructification finale dans chaque traitement de pollinisation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pollinisation supplémentaire sur le terrain
	<ol>
<li>Quelques jours avant l’ouverture des premières fleurs, enfermez les arbres sélectionnés dans une cage maillée de 0,8 mm pour éviter l’arrivée d’insectes pollinisateurs.</li>
		<li>Lorsque 10 % à 20 % des fleurs sont ouvertes, sélectionnez et étiquetez plusieurs branches par traitement de pollinisation, ce qui laisse 1 000 à 1 500 fleurs par traitement.</li>
		<li>Le lendemain, lorsque les fleurs sont ouvertes, polliniser chaque fleur à l’aide d’un pinceau avec le pollen correspondant (pollen du même cultivar pour l’autopollinisation et d’autres cultivars compatibles comme contrôle de pollinisation croisée).</li>
		<li>Polliniser tous les deux jours jusqu’à ce que toutes les fleurs s’ouvrent.</li>
		<li>Enregistrez le nombre hebdomadaire de fleurs et de fruits en développement depuis l’anthèse jusqu’à la récolte pour caractériser le schéma de chute des fruits et quantifier la fructification finale dans chaque traitement de pollinisation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Pollinisations manuelles en laboratoire
<ol><li>Collectez 50 à 100 fleurs au stade D24,selon le stade 57 de l’échelle BBCH25,26.</li>
	<li>En laboratoire, émasculer 30 fleurs par traitement (auto-pollinisation et pollinisation croisée). REMARQUE: L’émasculation doit être effectuée avec précaution pour éviter tout dommage sur les pistils.</li>
	<li>Faites une coupe fraîche sur la base de chaque pédicelle de fleur sous l’eau avant de la placer sur un morceau de mousse de fleuriste humide (un morceau de mousse pour chaque traitement de pollinisation).</li>
	<li>Polliniser à la main chaque pistil 24 heures plus tard à l’aide d’un pinceau fin avec du pollen collecté précédemment (voir rubrique 1.1). Polliniser un ensemble de pistils avec du pollen du même cultivar, et l’autre ensemble avec du pollen d’un cultivar compatible comme témoin.</li>
	<li>Laisser les pistils pollinisés 72 h après la pollinisation à température ambiante. La mousse florale doit être continuellement mouillée avec de l’eau.</li>
	<li>Fixer les pistils dans une solution fixatrice d’éthanol/acide acétique (3:1) pendant au moins 24 h à 4 °C. Remplacez le fixateur par de l’éthanol à 75 %. Les échantillons peuvent être conservés dans cette solution à 4 °C jusqu’à utilisation27. REMARQUE: Assurez-vous que les échantillons sont complètement immergés dans la solution.</li>
</ol>3. Observations microscopiques
<ol><li>
Évaluation de la germination du pollen in vitro
	<ol>
<li>Pour élaborer le milieu de germination du pollen, dissoudre 25 g de saccharose sur 250 mL d’eau distillée, puis ajouter 0,075 g de nitrate de calcium [Ca(NO3)2]et 0,075 g d’acide borique (H3BO3).</li>
		<li>Ajouter 2 g de gélose à la solution et mélanger jusqu’à dissolution complète28.</li>
		<li>Pour stériliser le milieu, autoclavez-le à 120 °C pendant 20 min. Refroidir le milieu et, avant qu’il ne se solidifie, répartir 3 mL par boîte de Petri stérile (55 mm x 12 mm) dans une hotte à écoulement laminaire stérile. Après solidification moyenne, conserver les boîtes de Petri enveloppées dans du papier d’aluminium à 4 °C jusqu’à utilisation.</li>
		<li>Répandre le pollen de chaque cultivar précédemment utilisé comme donneur de pollen dans les pollinisations contrôlées dans deux boîtes de Pétri et les incuber à 25 °C pendant 24 h. REMARQUE: Les milieux de culture inoculés peuvent être observés par microscopie immédiatement après ou stockés à -20 ° C jusqu’à utilisation. À cette fin, les boîtes de Petri doivent être changées du congélateur au réfrigérateur 24 heures avant les observations microscopiques.</li>
		<li>Pour observer les grains de pollen, préparez une solution de bleu d’aniline à 1% (v / v) qui tache le callose. Tout d’abord, préparer une solution tribasique de phosphate de potassium(K3PO4) de0,1 N en dissolvant 7,97 g de K3PO4 dans 1 000 mL d’eau distillée. Pour élaborer la solution de bleu d’aniline à 1 % (v/v), dissoudre 1 mL de bleu d’aniline dans 100 mL de 0,1 NK3PO4.</li>
		<li>Ajouter 2–3 gouttes de solution de bleu d’aniline à chaque plaque de boîte de Petri et observer après 5 min sous un microscope à épifluorescence UV à l’aide du filtre excitateur BP340-390 et du filtre barrière LP425. Compter les grains de pollen viables et non viables dans trois champs par plaque, chaque champ contenant 100 à 200 grains de pollen, dans deux boîtes de Pétri pour chaque cultivar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Croissance du tube pollinique
	<ol>
<li>Rincer les pistils fixes avec de l’eau distillée trois fois (1 h chacun, 3 h au total) et transférer à 5 % (p/v) de sulfite de sodium (Na2SO3)à 4 °C pendant 24 h. Pour préparer cette solution, dissoudre 5 g de sulfite de sodium dans 100 mL d’eau distillée.</li>
		<li>Autoclaver les pistils à 120 °C pendant 8 min dans du sulfite de sodium à 5 % (p/v) pour ramollir les tissus.</li>
		<li>La courge ramollit les pistils dans une goutte de 1% (v / v) de solution de bleu d’aniline sous un verre de couverture sur une lame pour tacher callose.</li>
		<li>Observez la croissance des tubes polliniques le long du style au microscope avec épifluorescence UV à l’aide du filtre excitateur BP340-390 et du filtre barrière LP425.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Détermination des relations d’incompatibilité
<ol><li>Extraction de l’ADN des feuilles<ol>
<li>Pour extraire l’ADN, prélever 3 à 4 jeunes feuilles de chaque cultivar dans le champ, de préférence au printemps. REMARQUE: L’ADN peut également être extrait de feuilles matures, mais l’ADN de jeunes feuilles contient moins de composés phénoliques.</li>
		<li>Isolez l’ADN à l’aide d’un kit commercial et suivez le kit de protocole fourni (voir table des matériaux).</li>
		<li>Quantifier la concentration d’ADN et évaluer la qualité de l’ADN de chaque échantillon à 260 nm dans un spectrophotomètre à microvolume UV-Vis. Ajuster la concentration d’ADN à 10 ng/μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conditions de PCR pour l’amplification de fragments<ol>
<li>Étiquetez les tubes et les bouchons PCR de 0,2 mL.</li>
		<li>Préparez les réactifs PCR conformément au tableau 1 et laissez-les décongeler sur la glace.</li>
		<li>Mettre en place un volume de mélange maître de chaque paire d’amorces dans un microtube de 1,5 mL en fonction du nombre de réactions plus 10% de l’excès, en tenant compte d’un volume de 16 μL par réaction. Ajouter les réactifs en suivant l’ordre du tableau 1 et bien mélanger.</li>
		<li>Aliquote 16 μL de mélange maître dans chaque tube PCR de 0,2 mL contenant 4 μL de gabarit d’ADN ou 4 μL d’eau distillée stérilisée comme témoin négatif (C-). Utiliser l’ADN de cultivars dont le génotype est connu comme témoin positif. Mélanger doucement, fermer les tubes de réaction avec les bouchons et centrifuger à 2 000 x g pendant 30 s pour recueillir tout le volume au fond du tube de réaction.</li>
		<li>Placez les tubes de réaction dans le thermocycleur et configurez le programme pcR en utilisant le profil de température suivant: une étape initiale de 3 min à 94 °C, 35 cycles de 1 min à 94 °C, 1 min à 56 °C et 3 min à 72 °C, et une dernière étape de 7 min à 72 °C20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Électrophorèse et estimation de la taille des fragments<ol>
<li>Pour préparer un mini gel d’agarose à 1,7 % (p/v), dissoudre 0,68 g d’agarose et 40 mL de tampon 1x TBE dans une fiole d’Erlenmeyer de 100 mL. Faire fondre la solution en la chauffant au micro-ondes à 600 W à 30 s d’intervalle pour éviter l’ébullition.</li>
		<li>Laissez la solution rester sur le banc pour refroidir, puis ajoutez 3,5 μL de solution de coloration aux acides nucléiques.</li>
		<li>Placez le plateau de gel dans le support de coulée et placez le peigne sélectionné dans le moule à gel. Assurez-vous d’avoir suffisamment de puits pour chaque produit pcR et échelle d’ADN.</li>
		<li>Versez la solution d’agarose dans le moule en gel et laissez-la refroidir jusqu’à la polymérisation. Retirer le peigne du gel polymérisé. Placez le gel dans le système d’électrophorèse horizontale contenant suffisamment de tampon TBE 1x pour couvrir la surface du gel.</li>
		<li>Chargez le premier et le dernier puits avec 2 μL de l’échelle de poids moléculaire de l’ADN (échelle d’ADN de 1 kb). Chargez 3 μL de chaque produit de la PCR dans les autres puits. Fermez la chambre, allumez l’alimentation et mettez le gel à 100 V pendant 30 min.</li>
		<li>Observez le gel sous la lumière UV à l’aide d’un système de documentation sur le gel. Utilisez l’échelle de poids moléculaire de l’ADN pour déterminer la taille du fragment amplifié et comparez-le avec les témoins positifs afin d’identifier les allèles correspondants.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Surveillance des dattes florales
<ol><li>Surveiller la phénologie des différents arbres de chaque cultivar à la floraison sur différentes années. Établissez la durée de la période de floraison de la première (environ 5%) à la dernière fleur ouverte (environ 95%). La pleine floraison est considérée lorsqu’au moins 50% des fleurs sont au stade F24, selon le stade 65 sur l’échelle BBCH25,26.</li>
	<li>Pour comparer les dates de floraison des cultivars intercompatibles et déterminer celles qui coïncident au moment de la floraison chaque année, élaborez un calendrier des périodes de floraison avec des données de plusieurs années.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthodologie décrite ici pour les besoins de pollinisation des cultivars de prunes japonais nécessite de déterminer l’auto-(in)compatibilité de chaque cultivar par des pollinisations contrôlées sur le terrain ou en laboratoire, et l’observation ultérieure de la croissance des tubes polliniques par microscopie à fluorescence. Les relations d’incompatibilité sont établies par la caractérisation des S-allèles par génotypage moléculaire. Enfin, la sélection des pollinisateurs est effectuée par la phénologie de s...

La prune japonaise(Prunus salicina Lindl.) est originaire de Chine1. Au 19e siècle,cette culture a été introduite du Japon aux États-Unis, où elle a été croisée avec d’autres prunes diploïdes nord-américaines2. Au20ème siècle, certains de ces hybrides ont été répandus dans les régions tempérées du monde entier. De nos jours, le terme « prune japonaise » fait référence à une large gamme d’hybrides interspécifiques dérivés de croisements entre le P. salicina original avec jusqu’à 15 autres diploïdes Prunus spp.3,4,5.
La prune japonaise, comme d’autres espèces de la famille des Rosaceae, présente une auto-incompatibilité gamétophyte (GSI), qui est contrôlée par un S-locusunique et hautement polymorphe contenant plusieurs allèles6. Le S-locus contient deux gènes qui codent une ribonucléase(S-RNase)exprimée dans le pistil, et une protéine F-box (SFB) exprimée dans le grain de pollen7. Dans la réaction d’auto-incompatibilité, lorsque l’allèle Sexprimé dans le grain de pollen (haploïde) est le même que l’un des deux exprimés dans le pistil (diploïde), la croissance du tube pollinique à travers le style est arrêtée en raison de la dégradation de l’ARN du tube pollinique par l’action de la S-RNase8. Étant donné que ce processus empêche la fécondation du gamétophyte femelle dans l’ovule, GSI favorise le croisement entre les cultivars.
Bien que certains cultivars de prunes japonais soient autocompatibles, la plupart des cultivars actuellement cultivés sont auto-incompatibles et ont besoin du pollen de donneurs intercompatibles pour fertiliser leurs fleurs3. Dans les espèces de fruits à noyau du genre Prunus telles que l’amande9,l’abricot10,11,12 et la cerise douce13,les besoins en pollinisation des cultivars peuvent être établis par différentes approches. L’auto-(in)compatibilité peut être déterminée par l’autopollinisation des fleurs sur le terrain et la surveillance ultérieure de la fructification, ou par des autopollinisations semi-in vivo dans des conditions contrôlées en laboratoire et l’observation de tubes polliniques au microscope14,15,16,17,18 . Les relations d’incompatibilité entre cultivars peuvent être déterminées par des pollinisations croisées sur le terrain ou en laboratoire à l’aide du pollen du cultivar polliniseur potentiel, et par l’identification des allèles Sde chaque cultivar par analyse PCR14,15,16 , 19,20,21,22 . Chez des espèces telles que la cerise douce ou l’amande, l’auto-(in)compatibilité peut également être évaluée par l’identification d’allèles S particuliers associés à l’autocompatibilité, comme S4' dans la cerise douce13 ou Sf dans l’amande23.
Plusieurs programmes de sélection de prunes des principaux pays producteurs libèrent un certain nombre de nouveaux cultivars2,14, dont beaucoup ont des besoins de pollinisation inconnus. Dans ce travail, une méthodologie pour la détermination des besoins de pollinisation chez les hybrides japonais de type prune est décrite. L’autocompatibilité est déterminée par des autopollinisations sur le terrain et en laboratoire, suivies d’observations de tubes polliniques sous microscopie à fluorescence. La sélection des cultivars polliniseurs combine l’identification des génotypes Spar analyse PCR avec le suivi du temps de floraison sur le terrain.

<table><tbody><tr><td>Acide acétique Glacial</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>Bleu aniline</td><td>Difco</td><td>8504-88</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique (H3BO4)</td><td>Panreac</td><td>131015.1210</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate de calcium 4-hydraté (Ca(NO3)2 &point moyen ; 4H2O)</td><td>Panreac</td><td>131231.1211</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Caméra numérique</td><td>Imagerie Developmet Systems</td><td>UI-1490SE</td><td></td></tr><tr><td>Suite logicielle de caméra numérique</td><td>Imagerie Developmet Systems</td><td>4.93.0.</td><td></td></tr><tr><td>Oligos d’ADN</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix, 10 mM chacun</td><td>ThermoSischer Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green DNA polymérase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96&deg ;</td><td>VWR-Chemicals</td><td>83804.360</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN 1Kb (brevet américain n° 4.403.036) (500pb-12Kb)</td><td>Invitrogen</td><td>15615-016</td><td>Taille : 250&micro ; g; Conc : 1.0 et micro ; g/&micro ; l</td></tr><tr><td>Système de documentation sur gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>compteur de main</td><td>Tamaco</td><td>TM-4</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de laboratoire d’images</td> Système <td>d’analyse d’images</td><td>Bio-Rad</td><td></td> pour système de documentation sur gel</tr><tr><td>MetaPhor Agarose</td><td>Lonza</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse 5415 R</td><td>Eppendorf</td><td></td> Z605212 <td></td></tr><tr><td>microscope avec UV épiflurescence</td><td>Leica</td><td>DM2500</td><td>Filtre excitateur BP340-390, Filtre barrière LP425</td></tr><tr><td>Microlames</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Mini système d’électrophorèse</td><td>Fisherbrand</td><td>14955170</td><td></td></tr><tr><td>Minicentrifugeuse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15334204</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop 1000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Deltalab</td><td>200201</td><td>55 mm x 14 mm</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium tribasique (K3PO4&middot ; 1.5H2O)</td><td>Panreac</td><td>141513</td><td></td></tr><tr><td>Primer forward 'Pru C2'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer forward Pru T2'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer reverse 'PCER’ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RedSafe Nucleic Acid Staining Solution</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Panreac</td><td>131621.1211</td><td></td></tr><tr><td>Sulfite de sodium anhydre (Na2SO3)</td><td>Panreac</td><td>131717.1211</td><td></td></tr><tr><td>Speedtools Kit d’extraction d’ADN végétal</td><td>Biotools</td><td>21272</td><td></td></tr><tr><td>Tampon TBE (10X)</td><td>Panreac</td><td>A0972,5000PE</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur T100</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>Thermomixeur confort</td><td>Eppendorf</td><td>T1317</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave vertical Présoclave II</td><td>JP Selecta</td><td>4001725</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>11746744</td><td></td></tr></tbody></table>

Établir les exigences de pollinisation dans la prune japonaise par surveillance phénologique, pollinisation manuelle, microscopie à fluorescence et génotypage moléculaire

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

Les cultivars de prunes japonais couramment cultivés sont des hybrides interspécifiques dérivés de croisements entre le Prunus salicina original et d’autres espèces de Prunus. La plupart des hybrides présentent une auto-incompatibilité gamétophytique, qui est contrôlée par un S-locusunique et hautement polymorphe qui contient plusieurs allèles. La plupart des hybrides cultivés sont auto-incompatibles et ont besoin du pollen d’un donneur compatible pour fertiliser leurs fleurs. L’établissement des besoins de pollinisation dans la prune japonaise devient de plus en plus important en raison du nombre élevé de nouveaux cultivars dont les besoins en pollinisation sont inconnus. Dans ce travail, une méthodologie pour la détermination des besoins de pollinisation chez les hybrides japonais de type prune est décrite. L’autocompatibilité est déterminée par des pollinisations manuelles sur le terrain et en laboratoire, suivies de la surveillance de l’allongement du tube pollinique par microscopie à fluorescence et de la surveillance de la maturation des fruits sur le terrain. La sélection des cultivars polliniseurs est évaluée en combinant l’identification des génotypes Spar analyse PCR avec la surveillance du temps de floraison sur le terrain. Connaître les besoins de pollinisation des cultivars facilite la sélection des cultivars pour la conception de nouveaux vergers et permet la détection précoce des problèmes de productivité liés au déficit de pollinisation dans les vergers établis.

Chaque bouton floral de prune japonaise contient une inflorescence avec 1–3 fleurs. Comme chez les autres espèces de fruits à noyau, chaque fleur est composée de quatre verticilles: carpelle, étamines, pétales et sépales, qui sont fusionnés formant une tasse à la base de la fleur. Les structures florales sont plus petites que les autres fruits à noyau, avec un pistil court et fragile entouré d’étamines qui contiennent une petite quantité de grains de pollen. À pleine floraison, les fleurs de chaque inflorescence apparais...

Une méthodologie pour la détermination des besoins de pollinisation dans les hybrides japonais de type prune est décrite, qui combine les pollinisations sur le terrain et en laboratoire et les observations de tubes polliniques sous la microscopie à fluorescence avec l’identification des génotypes Spar PCR et la surveillance de la floraison pour la sélection des pollinisateurs.

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

Ce protocole devient de plus en plus important en raison du nombre élevé de nouveaux cultivars de prunes japonais auto-incompatibles avec des exigences de pollinisation inconnues. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de déterminer les besoins en pollinisation des cultivars en combinant deux approches complémentaires en conditions de terrain et de laboratoire. Cette approche peut également être appliquée pour déterminer les besoins en matière de pollinisation et d’autres espèces d’arbres fruitiers auto-incompatibles comme l’abricotier ou le cerisier doux.Pour l’extraction du pollen, prélever les boutons floraux au stade du ballon selon le stade 57 sur l’échelle BBCH. Retirez les anthères à l’aide d’un filet en plastique et placez-les sur du papier à température ambiante pendant 24 heures jusqu’à la déhiscence des anthères. Tamisez les grains de pollen à travers un maillage fin et conservez-les dans un tube en verre de 10 millimètres avec un capuchon à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation.Lorsque 10 à 20 % des fleurs sont ouvertes, sélectionnez et étiquetez plusieurs branches, en laissant 1 000 à 1 500 fleurs par traitement de pollinisation. Le lendemain, lorsque d’autres fleurs sont ouvertes, pollinisez chaque fleur à l’aide d’un pinceau avec du pollen du même cultivar pour l’autopollinisation et du pollen d’autres cultivars comme contrôle de la pollinisation croisée. Pollinisez tous les jours jusqu’à ce que toutes les fleurs soient ouvertes.Enregistrez le nombre hebdomadaire de fleurs et de fruits en développement, de l’anthèse à la récolte, afin de caractériser le modèle de chute des fruits et de quantifier la nouaison finale dans chaque traitement de pollinisation. Récoltez 50 à 100 fleurs au stade du ballon selon le stade 57 sur l’échelle BBCH. Émasculer 30 fleurs par traitement en laboratoire pour l’autopollinisation et la pollinisation croisée.Faites une coupe fraîche à la base de chaque pédicule de fleur sous l’eau et placez-la sur un morceau de mousse de fleuriste humide. Utilisez un morceau de mousse pour chaque traitement de pollinisation. Après 24 heures, pollinisez à la main chaque pistil avec le pollen collecté précédemment à l’aide d’un pinceau fin.Pollinisez un ensemble de pistils avec du pollen du même cultivar et l’autre ensemble avec du pollen d’un autre cultivar compatible comme témoin. Fixez ces pistils pollinisés dans une solution fixatrice d’éthanol et d’acide acétique pendant au moins 24 heures à quatre degrés Celsius. Épandez le pollen de chaque cultivar précédemment utilisé comme donneur de pollen dans les pollinisations dans deux boîtes de Pétri et incuberez-les à 25 degrés Celsius pendant 24 heures.Pour observer les grains de pollen, ajoutez deux à trois gouttes de solution de bleu d’aniline dans chaque boîte de Pétri et observez-les sous un microscope à épifluorescence UV après cinq minutes. Compter les grains de pollen viables et non viables dans les trois champs par boîte de Pétri, chaque champ contenant environ 100 à 200 grains de pollen dans deux boîtes de Pétri pour chaque cultivar. Pour observer les tubes polliniques, écrasez les pistils ramollis dans une goutte de solution de bleu d’aniline à 1 % sous un verre de couverture sur une lame.Observez la croissance du tube pollinique le long du style au microscope avec épifluorescence UV à l’aide du filtre excitateur BP340-390 et du filtre barrière LP425. Prélevez trois à quatre jeunes feuilles de chaque cultivar dans le champ et extrayez l’ADN des feuilles. Mettez en place un mélange maître pour chaque paire d’amorces dans des microtubes de 1,5 millilitre.Ajouter tous les réactifs et bien mélanger. Aliquote 16 microlitres de ce mélange principal dans chaque tube PCR de 200 microlitres contenant quatre microlitres de matrice ou de contrôle d’ADN. Mélangez-les délicatement, fermez les bouchons et centrifugez à 2 000 fois G pendant 30 secondes.Placez le tube dans le thermocycleur et exécutez le programme PCR comme mentionné dans le manuscrit du texte. Pour estimer la taille du fragment par électrophorèse sur gel, chargez le premier et le dernier puits avec deux microlitres de l’échelle d’ADN et trois microlitres du produit PCR dans les autres puits. Fermez la chambre et faites fonctionner le gel à 100 volts pendant 30 minutes.Observez le gel sous la lumière UV à l’aide d’un système d’imagerie sur gel. Utilisez l’échelle de l’ADN pour estimer la taille des fragments amplifiés et comparez-la avec les témoins positifs et négatifs. Surveiller la phénologie des différents arbres de chaque cultivar au cours des différentes années de floraison.Établissez la durée de la période de floraison de la première à la dernière fleur ouverte. La pleine floraison est considérée lorsqu’au moins 50 % des fleurs sont au stade F selon le stade 65 sur le BBCH. Le modèle de chute des fruits des fleurs pollinisées à la main après l’émasculation ou la pollinisation supplémentaire a montré que la plupart des fleurs tombaient deux à trois semaines après la pollinisation, mais que 4 % des fleurs autogames restaient dans l’arbre, ce qui indique que ce cultivar est autocompatible.Les grains de pollen viables ont montré un tube pollinique plus long que sa longueur après 24 heures dans le milieu de culture et les grains de pollen non viables n’ont pas germé. Pendant la pollinisation, les grains de pollen ont été transférés vers le stigmate. Chaque grain de pollen en germination produisait un tube pollinique, qui se développait à travers les structures du pistil.Chez les cultivars auto-incompatibles, le tube pollinique a cessé de croître dans le tiers supérieur du style. Cependant, chez les cultivars autocompatibles, le tube pollinique pourrait se développer à travers le style, atteindre l’ovaire et féconder un ovule. L’analyse PCR a été réalisée à l’aide d’amorces provenant des régions conservées des ARNs de la cerise douce et de la prune du Japon, ce qui a permis de déterminer la taille des allèles S dans chaque cultivar.La durée de la période de floraison pour un total de quatre ans a été calculée. La floraison dans les conditions du verger a permis de déterminer quels cultivars coïncident avec la floraison chaque année. Lorsque vous essayez ce protocole, assurez-vous d’utiliser un plus grand nombre de fleurs de prunier japonais pour les pollinisations manuelles, car le pourcentage de nouaison est très faible par rapport aux autres espèces de Prunus.Il n’est pas possible de déterminer l’auto-incompatibilité par des approches moléculaires. D’autres travaux de séquençage de l’allèle S sont nécessaires pour évaluer si certains allèles S sont associés à l’autocompatibilité. La combinaison d’approches sur le terrain et en laboratoire a permis d’obtenir des informations précieuses pour la conception de nouveaux vergers commerciaux et peut être utilisée pour d’autres espèces d’arbres fruitiers.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous avons développé une méthodologie pour effectuer des croisements dans viridis Setaria viridis (S.). Le procédé consiste à tailler la panicule préalable à un traitement à l'eau chaude pour tuer pollen viable. Croix sont effectuées suivant un régime de croissance bien maîtrisée et aboutissent généralement à la reprise de 1 à 7 pollinisation croisée semences / s par panicule.

Méthodes pour effectuer des croix dans<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Un nouveau système modèle pour les graminées

Pour révéler l'efficacité des pollinisateurs d'une espèce végétale donnée, plusieurs méthodes d'expériences sur le terrain ont été développés. Cette étude démontre les méthodes de base d'expériences sur le terrain pour la pollinisation de l' écologie à l' aide de l'étude de cas de Lycoris sanguinea var. Sanguinea et le nouveau mécanisme de pollinisation, brisant bourgeon pollinisation.

Les expériences sur le terrain de l&#39;écologie Pollinisation: le cas de<em&gt; Lycoris sanguinea</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

Nous présentons ici un protocole pour forcer la floraison dans les mandariniers conditions phytotron. Stress, éclairement élevé et une photopériode de printemps simulé a permis des fleurs viables d’obtenir dans un court laps de temps de l’eau. Cette méthodologie permet aux chercheurs d’avoir plusieurs périodes de floraison en 1 an.

Forcé de floraison dans les mandariniers Phytotron conditions

Nous démontrons une méthode pour déterminer la fertilisation réussie ou échouée sur la base de la morphologie nucléaire de sperme dans la double fertilisation d'Arabidopsis utilisant un microscope d'épifluorescence.

Évaluation de l'état de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de l'arabidopsise

Nous présentons une méthodologie pour établir les exigences de pollinisation des cultivarsd’abricot (Prunus armeniaca L.) combinant la détermination de l’auto-compatibilité par microscopie de fluorescence avec l’identification du S-génotype par analyse pcr.

Détermination des relations d’auto et d’intercompatibilité dans les a abricots combinant la pollinisation manuelle, la microscopie et les analyses génétiques

Ce protocole fournit une méthode rapide pour déterminer la compatibilité et l’incompatibilité du pollen chez les cultivars d’agrumes.

Détermination des relations d’auto-(in)compatibilité et d’inter-(in)compatibilité chez les agrumes à l’aide d’analyses manuelles de pollinisation, de microscopie et de génotype S

Ici, nous décrivons une amélioration de la méthode semi-in vitro (SIV) pour observer le guidage et la réception du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana, ce qui augmente la réceptivité des ovules. La méthode SIV cum septum à haut débit peut être couplée à des lignées marqueurs gamétophytes et à des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller le processus dynamique de fécondation.

Imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’Arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum

Une méthode améliorée pour mesurer les profils d’hydratation du pollen chez Arabidopsis thaliana est décrite ici. La nouvelle méthode offre une résolution plus élevée, est non invasive et est hautement reproductible. Le protocole représente un nouvel outil pour une dissection plus fine des processus qui régulent les premiers stades de la pollinisation.

Un essai biologique in vivo à haute résolution sur l’hydratation du pollen à grain unique pour Arabidopsis thaliana

Les teneurs en protéines dans les cellules et les tissus sont souvent étroitement réglementées par l'équilibre de la production de protéines et de dégagement. En utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP), la cinétique de dégagement de protéines peuvent être mesurées expérimentalement in vivo.

Mesure de la stabilité des protéines dans le salon embryons de poissons zèbres en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP)

Pour étudier le mécanisme d’utilisation des lipides dans les membranes du sac vitellin pendant les derniers stades du développement embryonnaire aviaire, nous avons établi un système de culture de cellules épithéliales endodermiques embryonnaires primaires de caille japonaise.

Primaire endodermique des cellules épithéliales de la Culture Yolk Sac Membrane de japonais Quail Embryons

Découvrez comment déterminer les exigences de pollinisation chez les prunes japonaises par pollinisation manuelle, microscopie à fluorescence et génotypage PCR. Cette méthode aide à identifier les pollinisateurs adaptés.

Établir les exigences de pollinisation dans la prune japonaise par surveillance phénologique, pollinisation manuelle, microscopie à fluorescence et génotypage moléculaire (Vidéo) | JoVE Journal

Établir les exigences de pollinisation dans la prune japonaise par surveillance phénologique, pollinisation manuelle, microscopie à fluorescence et génotypage moléculaire

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