Imagerie et analyse de fluorescence résolues dans le temps de l’invasion des cellules cancéreuses dans le modèle sphéroïde 3D

Ce protocole peut être utilisé pour étudier les mécanismes régissant l’invasion des cellules cancéreuses dans la matrice extracellulaire en temps réel. Le principal avantage de cette technique est qu’il utilise un dispositif d’imagerie sphéroïde simple, ce qui rend l’essai d’invasion sphéroïde plus facile à mettre en place et améliore son efficacité et son coût. Tandis que nous démontrons utilisant l’essai d’invasion sphéroïde pour modéliser le carcinome mammaire, cet essai est un excellent modèle pour l’invasion de n’importe quelle tumeur pleine dans le tissu sain environnant.

Après l’impression 3D de l’espaceur, weight out un rapport de 10:1 de polymère de base à cross-linker dans une tasse en plastique et utiliser une pipette jetable pour bien mélanger la solution PDMS résultant dans la tasse. Placez la tasse dans une chambre à vide et relâchez rapidement la pression du vide pour éliminer tout air emprisonné à la surface du mélange et dissiper les bulles d’air restantes. Incuber l’espaceur imprimé 3D à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes pour augmenter sa flexibilité et nettoyer deux plaques de verre avec 100% isopropanol.

Placez l’espaceur de sorte qu’il soit rincé entre les deux plaques nettoyées et placez deux gros agrafes de liant sur le bord inférieur et un sur le coin supérieur pour sceller le moule sur les bords extérieurs des plaques. Inspecter la partie supérieure du moule pour s’assurer que l’espaceur est rincé avec les plaques de verre et utiliser une pipette jetable avec environ deux centimètres coupés de la pointe à ajouter lentement mais continuellement le mélange PDMS dans le coin supérieur gauche du moule. Lorsque le moule entier a été rempli, placez le moule dans la chambre à vide pour enlever les bulles d’air qui se sont formées, avant de guérir le PDMS pendant une heure à 100 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, placez le moule à température ambiante. Quand il est frais au toucher, retirez les agrafes de liant et les plaques de verre de l’espaceur contenant le PDMS durci et utilisez une lame de rasoir pour couper à travers le joint qui a été créé sur les quatre côtés du moule entre l’espaceur et la plaque de verre. Démonter le moule pour révéler la feuille PDMS dans l’espaceur et utiliser des pinces à épiler pour peler soigneusement la feuille PDMS hors de l’espaceur.

Placez la feuille sur un tapis de coupe et utilisez un poinçon de biopsie pour percer un disque PDMS de 17,5 millimètres de diamètre, puis perforez trois trous uniformément répartis de 5,5 millimètres dans le disque. Utilisez du ruban adhésif pour enlever les particules de poussière de chaque insert et collez les inserts nettoyés sur un morceau de ruban adhésif à double face. Enroulez la bande autour du couvercle d’une boîte de Petri de 10 centimètres et placez le couvercle dans une machine à plasma avec des plats ouverts en verre de 35 millimètres.

Activez les inserts et le verre avec une minute de traitement au plasma à 300 millitorrs et utilisez des pinces à épiler pour fixer rapidement le côté traité de chaque insert à la partie vitrée d’un plat de fond en verre traité par insert. Lorsque tous les inserts ont été appliqués, utilisez le doigt pointeur et le pouce pour appliquer une pression même sur chaque insert tout en tournant le plat pour fixer solidement les inserts à la vaisselle. Lorsque tous les inserts ont été sécurisés, incuber les dispositifs d’imagerie sphéroïde qui en résultent pendant 20 minutes à 60 degrés Celsius, avant d’effectuer une deuxième série de traitement plasmatique comme démontré.

Après le deuxième traitement, ajouter 35 microlitres de solution de revêtement fraîchement préparée à chaque trou d’insertion. Après une heure à température ambiante, retirer la solution de revêtement et rincer l’appareil trois fois à l’eau distillée. Après le dernier lavage, ajouter 35 microlitres de solution de liaison croisée à chaque trou pour une incubation de 30 minutes à température ambiante.

À la fin de l’incubation, rincer l’appareil trois fois à l’eau distillée comme démontré, avant de remplir chaque appareil de 70 % d’éthanol pour une incubation de 30 minutes sous lumière UV. À la fin de la stérilisation, rincer les appareils trois fois à l’eau distillée et ajouter 2,5 millilitres de solution de stockage à chaque appareil. Pour intégrer les sphéroïdes dans le collagène, lavez les appareils trois fois avec trois millilitres de PBS par lavage.

Après le dernier lavage, laissez les appareils sécher complètement, avant d’ajouter un sphéroïde dans 30 microlitres de collège fraîchement préparé une solution dans un trou de l’insert et de commencer une infimes. Après avoir confirmé la présence du sphéroïde dans le trou, ajouter des sphéroïdes aux deux autres trous comme démontré. Utilisez une pointe de pipette de 10 microlitres pour plus récents les sphéroïdes qui sont situés près de la frontière PDMS, ou pour séparer les sphéroïdes si plusieurs sphéroïdes sont distribués et arrêter la infimeur.

Pour centrer verticalement le sphéroïde dans la couche de collagène, après l’ensemencement, retourner l’appareil à l’envers et incuber l’appareil à 37 degrés jusqu’à ce que le collagène polymérise, inversant l’orientation de l’appareil toutes les deux minutes pour un total de 30 minutes, puis ajouter 2,5 millilitres de milieu par appareil et acquérir une image des sphéroïdes au point de temps zéro heure. L’utilisation d’un dispositif d’image sphéroïde facilite l’intégration efficace et l’enregistrement en accéléré de l’invasion des cellules cancéreuses dans le collagène ou par imagerie longitudinale. Tandis que ce sphéroïde a été image longitudinalement au cours de six jours exigeant l’expression stable des protéines fluorescentes cytoplasmiques et/ou nucléaires, la formation image longitudinale semblable peut être exécutée sur une période plus courte utilisant l’étiquetage de colorant.

Les sphéroïdes peuvent également être fixés et immunolabeled. Par exemple, ces sphéroïdes ont été immunolabeled pour epithelial-cadherin, cortactin, et F-actin. Dans ces images, une illustration étape par étape de la procédure de traitement de l’image à l’aide de la macro Fidji pour mesurer la zone du sphéroïde au fil du temps peut être observée.

Assurez-vous de distribuer un seul sphéroïde dans chaque trou de l’appareil d’imagerie sphéroïde et de positionner le sphéroïde au centre du trou dans les directions XY et Z. La conception de l’appareil peut facilement être modifiée en changeant la taille et l’agencement des trous, des inserts et des plats de fond en verre pour s’adapter à un débit sphéroïde plus élevé.