Un test amélioré et des outils pour mesurer la nociception mécanique chez les larves de Drosophila

Ce protocole est important car il permet à l’utilisateur de construire un outil qui peut être utilisé pour mesurer avec précision les réponses de nociception mécanique chez les larves de drosophile génétiquement traitables. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise des matériaux simples pour construire des outils personnalisés qui peuvent être utilisés pour mesurer la nociception mécanique du sous-seuil à la plage de réponse complète. Ces outils et méthodes peuvent être utilisés pour mesurer la nociception mécanique de base et la sensibilisation nociceptive à la suite d’une blessure ou d’une maladie.

Sonder les larves avec des filaments personnalisés demande de la pratique. Les utilisateurs devraient être en mesure de générer des courbes dose-réponse avec des larves témoins avant de tenter une expérience. Pour construire une sonde mécanique, utilisez une petite pince coupante pour couper chaque filament de Nitinol à la longueur spécifiée perpendiculaire à son axe long.

Les filaments sont disponibles en trois diamètres prédéfinis différents. Examinez l’extrémité des filaments au microscope stéréoscopique pour vous assurer qu’il ne reste pas d’arêtes vives ou irrégulières qui pourraient endommager les tissus de la peau de la larve et interférer avec l’étalonnage. Ensuite, utilisez une pierre à aiguiser pour lisser manuellement les bords de la sonde jusqu’à ce qu’aucune irrégularité nette ne persiste.

Ensuite, utilisez une aiguille hypodermique pour percer un trou près de l’extrémité d’un bâtonnet de popsicle en bois. Appliquez de la colle à bois sur un seul filament de Nitinol et insérez le filament enduit de colle dans la fente de l’aiguille. Une fois la colle sèche, appuyez la sonde contre la balance jusqu’à ce que la sonde se plie pour déterminer la force maximale qui peut être enregistrée en grammes.

Utilisez la formule pour convertir la masse enregistrée en force en millinewtons. Divisez ensuite la force mesurée par la surface de la pointe du filament pour convertir la force calculée en kilopascals de pression. La préparation de plusieurs sondes à l’aide de filaments de différents diamètres et longueurs générera un ensemble complet, couvrant toute la gamme de réactivité des larves de drosophile.

Pour préparer les larves de drosophile à une expérience, élevez la progéniture larvaire avec de la nourriture standard dans un incubateur à 25 degrés Celsius pendant environ 96 heures. Lorsque les larves atteignent le stade du troisième stade, préparez un bouchon de nourriture pour mouches dans une petite boîte de Pétri pour que les larves soient testées et utilisez des pinces pour trier délicatement les larves de taille moyenne du milieu du troisième stade des plus petites du deuxième et du début du troisième stade et des larves plus grandes du troisième stade tardif ou errant. Ensuite, à l’aide de la pince, transférez 20 à 30 larves du milieu du troisième stade dans une petite boîte de Pétri contenant un petit bouchon de nourriture pour mouches humidifié avec de l’eau à température ambiante.

Pour effectuer un test de nociception mécanique, utilisez une pince pour placer une larve du milieu du troisième stade sur un tampon en vinyle mince foncé sous un stéréomicroscope à fond clair et disposez des lumières à fibre optique entre les lentilles de l’objectif du microscope et le tampon. Utilisez une serviette en papier pour essuyer tout excès d’eau entourant la larve et déplacez le coussinet pour orienter la tête et la bouche de la larve vers la main non dominante du chercheur. Choisissez une sonde mécanique et appliquez-la sur la face dorsale postérieure de la larve, à environ le segment abdominal A8, pendant une à deux secondes, en comprimant soigneusement la larve dans le coussinet sous-jacent au point de contact avec la sonde jusqu’à ce que la sonde se plie et suscite la pression précédemment mesurée.

Une réponse nociceptive positive est indiquée si la larve présente un roulement complet en tire-bouchon de 360 degrés le long de l’axe de son corps en trois secondes. Enregistrez la réponse comportementale de chaque larve. Ensuite, jetez la larve testée et préparez la larve suivante pour le test.

Ces sondes mécaniques personnalisées avec des filaments de nitinol peuvent être utilisées pour susciter des comportements évoqués mécaniquement et pour générer une courbe dose-réponse comportementale complète en utilisant des sondes mécaniques inoffensives et nocives d’intensité variable. Comme le démontrent les résultats de ces tests comportementaux, les sondes qui exercent une pression de 200 kilopascals ou moins ne provoquent pas de réponse de roulement aversif chez les larves de drosophile. Comme prévu, ces sondes mécaniques sous-seuils ou non nocives ne provoquent pas de lésions visibles des tissus neuronaux.

À l’inverse, les sondes super seuils ou nocives provoquent une réponse comportementale accrue ainsi que des lésions tissulaires aux neurones sensoriels périphériques eux-mêmes de manière dose-dépendante. Ces sondes peuvent également être utilisées pour mesurer l’hypersensibilité mécanique après une blessure. Environ 20 % des larves réagissent par un roulement aversif dès deux heures après le traitement UV, tandis que 50 % ont réagi quatre heures par rapport aux animaux irradiés par UV.

Étant donné que la sonde utilisée pour cette analyse était une sonde normalement inférieure au seuil de 200 kilopascals, cette réponse a été considérée comme une allodynie mécanique. À des moments ultérieurs, la réponse comportementale des larves traitées aux UV est légèrement augmentée, mais pas statistiquement différente de celle du groupe témoin irradié simulé. Les larves sondées avec une sonde de 462 kilopascals quatre, huit et 16 heures après le traitement UV présentent une augmentation significative de la réponse de roulement aversif, quatre heures étant le pic de l’hypersensibilité comportementale car le stimulus était initialement nocif.

La réponse a été considérée comme une hyperalgésie mécanique. La préparation de la sonde ainsi que la sélection et la compression des larves sont essentielles au succès du processus. L’utilisation de ces sondes a permis d’obtenir la nociception de base et l’hypersensibilité nociceptive mécanique peut être mesurée après une lésion.

À l’aide de ces outils et de ces tests, les bases moléculaires et génétiques de la nociception mécanique et de l’hypersensibilité nociceptive peuvent être mesurées dans le modèle de drosophile génétiquement traitable.