Name: Profilage métabolique à haut débit pour les raffinements de modèles de microalgues (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Découvrez le profilage métabolique à haut débit par microplaque phénotypique pour affiner les modèles de réseaux métaboliques de Chlamydomonas reinhardtii. Cette méthode permet d'identifier de nouvelles réactions enzymatiques et d'améliorer la modélisation métabolique des microalgues.

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Un soutien majeur pour ce travail a été fourni par le NYUAD Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), financé par Tamkeen dans le cadre d’une subvention de l’Institut de recherche de l’Université de New York Abu Dhabi (73 71210 CGSB9) et des Fonds de recherche de la faculté de NYU Abu Dhabi (AD060). W.F. a également été soutenu par le programme des cent talents de l’Université du Zhejiang. Nous remercions Ashish Jaiswal pour son aide dans l’enregistrement de la vidéo. Nous remercions Hong Cai d’avoir généré les données sur le phénotype métabolique.

1. Expériences sur les microréseaux phénotypiques
<ol><li>Obtenez la souche CC-503 de C. reinhardtii auprès du Chlamydomonas Resource Center de l’Université du Minnesota, États-Unis (https://www.chlamycollection.org).</li>
	<li>Cultiver les cellules dans des milieux frais de tris-acétate-phosphate (TAP)19 avec des concentrations finales de 400 μg/mL de timentine, de 50 μg/mL d’ampicilline et de 100 μg/mL de kanamycine (pour inhiber la croissance bactérienne) sous 400 photons micromol/m2 s, à 25 °C, pendant deux jours à mi-phase logarithmique.</li>
	<li>Faire tourner la culture à 2 000 x g pendant 10 min à 22 °C et jeter le surnageant sans déranger la pastille.</li>
	<li>Préparer un milieu TAP frais contenant 0,1% de colorant violet de tétrazolium « D ». REMARQUE : Modifier les milieux TAP à cette étape pour exclure certains éléments nutritifs en fonction de la catégorie de métabolites testés dans chaque plaque (p. ex., exclure le chlorure d’ammonium pour les plaques sources d’azote).</li>
	<li>Resuspendez la pastille dans un milieu TAP frais préparé (à partir de l’étape 1.2) jusqu’à une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Utilisez des plaques d’essai de réseau de composés chimiques (sources de carbone, sources d’azote, plaques de sources de phosphore et de soufre et sources d’azote peptidique).</li>
	<li>Inoculer une aliquote de 100 μL de milieux contenant des cellules dans chaque puits des plaques d’essai. REMARQUE: Assurez-vous de dupliquer les tests.</li>
	<li>Striez les cellules sur les plaques d’extrait de levure / peptone et effectuez une coloration au gramme, comme dans Smith et al. 20 avant et après le test pour surveiller la contamination bactérienne.</li>
	<li>Insérez les plaques d’essai du réseau de composés chimiques dans le système de lecteur de microplaques.</li>
	<li>Incuber toutes les plaques à 30 °C jusqu’à 7 jours et programmer le système de lecteur de microplaques pour lire le changement de couleur du colorant toutes les 15 minutes. REMARQUE: Comme la plupart des lecteurs de microplaques ne fournissent pas une source de lumière continue pendant l’incubation, les algues devraient pouvoir effectuer une respiration hétérotrophe.</li>
</ol>2. Analyse des données
<ol><li>Exportez les données cinétiques brutes du lecteur de microplaques sous forme de fichiers CSV, qui seront ensuite utilisés comme entrée dans le package Omnilog Phenotype Microarray (OPM) dans R. Ajoutez les informations biologiques sous forme de métadonnées (par exemple, désignation de la souche, milieu de croissance, température, etc.).<ol>
<li>Utilisation du logiciel de conversion de données PM Kinetic; chargez les fichiers de données D5E et convertissez-les en fichiers OKA à l’aide des lignes de commande suivantes dans le logiciel d’analyse cinétique PM : | de chargement Importer (localiser le dossier des fichiers OKA) | Remplir les filtres | Importer | Ajouter toutes les plaques | Fermer. | d’exportation choisissez les données de lecture (cinétique), choisissez le format (CSV) (en-tête de tabulation)et choisissez les plaques (chaque plaque (fichiers individuels)) | Exporter des données | Sauvegarder.
</li>
		<li>Pour effectuer l’analyse des données du phénotype Microarray (PM), utilisez le progiciel OPM21,22 qui s’exécute dans l’environnement logiciel R. Le package, le didacticiel et la documentation de référence sont disponibles à l’adresse suivante : http://www.goeker.org/opm/. Dans RStudio, une interface utilisateur graphique pour R, installez le package opm et ses dépendances à l’aide des commandes suivantes : source (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R) bibliothèque (opm)
</li>
		<li>Accédez au répertoire qui contient les fichiers CSV des données cinétiques et importez les données à l’aide de la fonctionopm read_ : x <- read_opm(« . », convert="grp », include=list (« csv: »))
</li>
		<li>Agrégez et discrétisez les données cinétiques à l’aide de l’estimation des paramètres de courbe. Pour (i en 1 :longueur(x)) { x[[i]] <Je ne _aggre(x[[i]], boot = 0 L, cores = 1 L, method ="splines », options = set_spline_options(« smooth.spline »)) x[[i]] <- do_disc(x[[i]], coupure = FAUX) } #Collection des métadonnées métadonnées <- collect_template(« . ») metadata$Strain <- c(« BLANK »,"CC- 503 ») pour (I en 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = métadonnées, remplacer = TRUE)}
</li>
		<li>Utilisez la fonction xy_plot pour cartographier les mesures de respiration (ou de croissance) (axe des y) en fonction du temps (axe des x) pour les plaques de 96 puits d’essai. print (xy_plot(x[[ 1 ]], include ="Strain », theor.max = FALSE))
</li>
		<li>Visualisez les données sous forme de carte thermique à l’aide de la fonction level_plot pour permettre un aperçu comparatif rapide des données cinétiques. level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt(« color.borders »), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep = » « , space ="Lab », bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
</li>
		<li>Extraire des informations biologiques importantes, les paramètres de la courbe, à partir des courbes cinétiques brutes et inclure la phase de décalage (λ), le taux de croissance (μ), la respiration cellulaire maximale (A) et l’aire sous la courbe (ASC)21. Pour identifier les métabolites positifs, utilisez les valeurs A du témoin négatif, qui représente la réactivité abiotique du colorant avec le milieu, en plus de l’ébauche de chaque plaque de micropuit comme valeurs de soustraction de fond. La fonction d’extraction est utilisée pour obtenir le paramètre A. opm_opt(« curve.param ») param <- extrait (x, as.labels = list(« Strain »)))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identification des réactions et des gènes associés aux nouveaux métabolites
<ol><li>Recherchez KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) et MetaCyc (http://metacyc.org/) pour identifier les numéros de commission des enzymes (CE) pour les réactions utilisant des métabolites trouvés dans des réseaux de composés chimiques23,2423,24.</li>
	<li>Utilisez les numéros CE identifiés comme base de recherche dans plusieurs ressources d’annotation d’algues disponibles telles que joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) et les publications évaluées par des pairs23,25,26,27.</li>
	<li>Si une requête ne renvoie aucune preuve génétique pour un numéro CE donné, identifier les protéines associées pertinentes dans d’autres organismes, en commençant par les espèces les plus proches du C. reinhardtii, puis effectuer une recherche basée sur un profil à l’aide du serveur NCBI PSI-BLAST avec les paramètres par défaut et utiliser des protéines non redondantes (nr) dans C. reinhardtii (taxid:3055) pour identifier les gènes candidats associés à la réaction12.</li>
	<li>Organisez manuellement les résultats PSI-BLAST avec des valeurs E de < 0,05 pour la pertinence par rapport au numéro EC recherché en interrogeant ces résultats BLAST via les serveurs de prédiction de domaine protéique EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) ou InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/). Notez que les deux derniers scans sont des étapes critiques pour assurer l’identification de l’activité enzymatique correcte pour la protéine.</li>
</ol>4. Perfectionnement et évaluation du modèle
<ol><li>Utiliser la dernière version de COBRA Toolbox v.3.028dans MATLAB29,30pour effectuer les étapes suivantes pour affiner le modèle. La boîte à outils COBRA peut être installée en suivant les étapes décrites dans : https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . Vous pouvez également noter que la boîte à outils COBRA est également implémentée dans d’autres langages de programmation open source, tels que Python (COBRApy31) et est disponible à l’adresse suivante: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .<ol><li>Après avoir installé COBRA Toolbox v.3.0, ouvrez MATLAB et exécutez la commande suivante pour initialiser la boîte à outils : initCobraToolbox;</li>
		<li>Ajoutez les réactions identifiées avec leurs gènes associés au modèle métabolique, tels que iRC1080, à l’aide des fonctions de la boîte à outils COBRA addReaction et changeGeneAssociation. Accédez au répertoire qui contient le modèle iRC1080, téléchargé à partir de http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 et exécutez les commandes suivantes pour charger le modèle, le renommer et ajouter une nouvelle réaction et son gène associé. Chargement('iRC 1080 .mat') modelNew = iRC 1080; modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2' , ... {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ... 'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ... 'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false); modelNEW = changeGeneAssociation(modelNew, ... « D-ALA 2 », « au.g 14655 _t 1 »);</li>
		<li>Dans certains cas, lorsque le métabolite n’est pas produit intracellulairement mais est repris du milieu, ajoutez des réactions de transport pour les nouveaux métabolites au modèle. Ces réactions de transport représentent la diffusion passive d’un métabolite du milieu extracellulaire vers le cytosol. En outre, ajoutez une réaction d’échange artificielle correspondante à l’aide de la fonction addExchangeRxn pour entrer ou sortir le métabolite dans le milieu extracellulaire. modelNew = addReaction(modelNew, 'CYCPt' , ... {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)' modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );</li>
		<li>Testez le comportement du nouveau modèle résultant, par exemple iBD1106, en effectuant une analyse du balance de flux (FBA) à l’aide de la fonction optimizeCbModel dans des conditions claires et sombres pour la maximisation de la biomasse en tant que fonction objective. Pour la croissance de la lumière, réglez les limites inférieure et supérieure des réactions lumineuses de la litho' solaire PRISM à 646,07 (taux maximal). Pour la croissance sombre, définissez les limites de toutes les réactions lumineuses PRISM à zéro. Utilisez la fonction Biomasse définie précédemment10 pour la croissance dans des conditions sombres et claires. La solution Expédié par Amazon produira deux vecteurs correspondant aux flux de réaction (solution.v) et au coût réduit (solution.w), ainsi qu’un vecteur correspondant aux prix fictifs des métabolites (solution.y). %Simuler la croissance à l’état de lumière : modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ... % « PRISM_solar_litho », ... « PRISM_solar_exo », ... 'PRISM_incandescent_ 60 W' , ... 'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' , ... « PRISM_metal_halide », ... « PRISM_high_pressure_sodium », ... « PRISM_growth_room », ... « PRISM_white_LED », ... « PRISM_red_LED_array_ 653 nm », ... « PRISM_red_LED_ 674 nm », ... 'PRISM_fluorescent_warm_ 18 W' , ... « PRISM_design_growth », ... }, 0, 'b' ); modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo'); FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, 'max');</li>
		<li>Répétez l’étape 4.1.4 pour iRC1080 afin de comparer les solutions Expédié par Amazon obtenuespour i BD1106 avec celles obtenuespour i RC1080.</li>
		<li>Il existe une gamme de méthodes COBRA disponibles qui peuvent être utilisées pour comparer des modèles (par exemple, analyse de la variabilité du flux, études de délétion de gènes, analyses de robustesse, prédictions de fractionnement de flux, FBA, échantillonnage, etc.). Des tutoriels détaillés peuvent être trouvés sur https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Ici, un exemple est fourni où le modèle iRC1080 est comparé à sa version raffinée, iBD1106, en obtenant les prix fictifs (sensibilité de la fonction objectif biomasse aux changements de variable système) des métabolites pris en compte dans chaque modèle. Obtenez les prix de l’ombre pour les métabolites: shadowPrices = table(modelNew.mets, ... modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le phénotypage métabolique de la microalgue verte, C. reinhardtii,a été décrit ici à l’aide de plaques de dosage des particules à haut débit et d’un PMI non modifié. Les essais ont été utilisés pour un total de 190 sources de carbone (PM01 et PM02), 95 sources d’azote (PM03), 59 sources de phosphore et 35 sources de soufre (PM04), ainsi que des sources d’azote peptidique (PM06-08). Une respiration positive a été observée pour 148 nutriments (un test positif pour l’utilisation de la source C, quatre tests positifs pour chacune des utilisations de la source S et de la source P, et 139 tests positifs pour l’utilisation de la source N). Les substrats ou les éléments nutritifs (carbone, azote, phosphore ou soufre) du milieu ne doivent pas être ajoutés au milieu défini lorsqu’ils sont appliqués sur les microplaques de particules pertinentes qui testent pour chacune de ces sources.
La méthode présentée ici est efficace pour caractériser les phénotypes de microalgues métaboliques qui peuvent être utilisés pour étendre les modèles de réseau métabolique existants ou diriger la reconstruction de nouveaux modèles. De plus, comme les besoins nutritionnels de la plupart des microalgues ne sont pas connus, cette plate-forme peut être utilisée pour les définir rapidement. Nelson et coll. 43 avait appliqué avec succès ces méthodes pour identifier de nouveaux composés qui soutiennent la croissance des microalgues Chloroidium sp. UTEX 3007 et a utilisé les informations obtenues pour définir les métabolites d’entrée de l’espèce, qui, contrairement à Chlamydomonas, comprennent 40 sources de carbone différentes.
L’une des principales limites du PM pour le profilage des microalgues est que le PMI n’a pas d’éclairage dans la chambre d’incubation et que les microalgues doivent pouvoir effectuer un métabolisme hétérotrophe. L’absence de lumière pourrait affecter l’interprétation des modèles qui incorporent la lumière pour calculer les flux métaboliques. Les paires de gènes avec les fonctions de coordination ont co-évolué pour constituer des centres de réseau métabolique, et la distinction entre les hubs de réseau photosynthétique et non photosynthétique peut être faite44. En général, les concentrateurs de réseau photosynthétiques (c.-à-d. les nœuds hautement connectés dans le modèle) seraient exclus des modèles hétérotrophes. À des fins pratiques, la modélisation de l’hétérotrophisme chez les espèces mixotrophes devrait omettre les réactions connues pour être entraînées par la lumière et tenir compte des différences de bilan énergétique entre les conditions. Ainsi, la modélisation du métabolisme dépendant de la lumière et indépendant de la lumière est une pratique courante dans la modélisation métabolique de Chlamydomonas6,45.
Certaines microalgues vertes, comme les trébouxiophytes, sont connues pour assimiler une variété de molécules de carbone pour la croissance, et on pense que cela est issu de leur longue histoire évolutive en tant que membres des lichens46. Alors que les chlorophytes comme Chlamydomonas peuvent utiliser l’acétate pour la croissance, la microalgue marine brune Tisochrysis lutea, connue pour son potentiel à produire commercialement des acides gras polyinsaturés à très longue chaîne (AGPI-VLC), ne peut pas utiliser l’acétate mais peut utiliser le glycérol pour la croissance47. Une concentration de biomasse supérieure à 100 g l−1 de poids de cellule sèche a été atteinte avec Chlorella avec ajout optimisé de sources de carbone organique en mode batch nourri48. De plus, l’ajout de sucre à chlorellavulgaris peut élever sa séquestration de CO2, offrant ainsi un avantage additif lors de la croissance photosynthétique49. La plupart des microalgues hétérotrophes peuvent également se développer de manière mixotrophique, mais il a été démontré que le chlorophyte Chromochloris zofingiensis arrête la photosynthèse lors de l’ajout de sucre50.
Les diatomées, appartenant à la division Bacillariophyta, sont un groupe majeur de phytoplancton. Bien que la plupart des diatomées ne puissent se développer que photoautotrophement, certaines d’entre elles peuvent être cultivées de manière mixotrophe ou hétérotrophe51. Par exemple, le glycérol s’est avéré soutenir la croissance de la lumière en l’absence de CO2 chez certaines diatomées, y compris l’espèce modèle Phaeodactylum tricornutum52. En outre, certaines diatomées benthiques comme Nitzschia linearis peuvent se développer sur les glucides dans l’obscurité53. Il est probable qu’il étende les tests de particules aux diatomées et à d’autres groupes d’algues en complétant les sources de carbone organique appropriées pour permettre aux cellules de se développer de manière hétérotrophe, et une stratégie de mixotrophie peut également être utilisée pour les microalgues autotrophes obligatoires fournissant un apport de lumière minimalement requis.
Pour évaluer la reproductibilité des données, il est fortement recommandé d’effectuer des tests en double pour toutes les plaques. Un essai ne peut être considéré comme positif que si, après soustraction du témoin négatif et des puits à blanc respectifs, l’absorbance (valeur PMI) est positive. Cette description, en présence du composé testé, est le reflet de la réaction abiotique du colorant avec le milieu.

L’optimisation du métabolisme des algues pour une production améliorée et stable de métabolites ciblés nécessite le développement de stratégies complexes d’ingénierie métabolique grâce à des analyses des réseaux métaboliques au niveau des systèmes. Les modèles de réseaux métaboliques peuvent guider les conceptions rationnelles pour le développement rapide de stratégies d’optimisation1,2,3,4. Bien qu’environ 160 espèces de microalgues aient été séquencées5, il n’existe, à notre connaissance, que 44 modèles métaboliques d’algues disponibles4,6,7. En raison de la difficulté d’obtenir des données phénotypiques métaboliques à haut débit pour la validation expérimentale de l’information génomique, la reconstruction de modèles de réseau de haute qualité est à la traîne par rapport au développement rapide du séquençage du génome des algues.
C. reinhardtii est un système modèle attrayant pour les études à base d’algues. Cette espèce peut croître photoautotrophe ou hétérotrophe et a été largement utilisée comme organisme modèle dans la recherche fondamentale et appliquée. Sa séquence génomique a été publiée en 20078, avec des modèles métaboliques à l’échelle du génome reconstruits par la suite pour les espèces9,10,11. Le modèle à l’échelle du génome de C. reinhardtii (iRC1080) a été reconstruit par Chang et al. 10 basé sur des preuves génomiques et documentaires (impliquant environ 250 sources). Il a 1 706 métabolites avec 2 190 réactions10; toutefois, l’exhaustivité du modèle n’a pas pu être vérifiée au-delà des preuves expérimentales publiées disponibles à l’époque.
La technologie des microréseaux phénotypiques (PM) est une plate-forme à haut débit qui peut fournir des informations de profilage métabolique pour les micro-organismes hétérotrophes ainsi que pour les cellules de culture tissulaire. En particulier, il peut être utilisé pour combler le déficit de connaissances entre le phénotype et le génotype dans les microalgues, comme cela a été signalé pour La première fois pour Chlamydomonas reinhardtii12 et par la suite pour une espèce de Chloroidium13 et Chlorella14. En étudiant les réponses cellulaires à des milliers de métabolites, de molécules de signalisation, d’osmolytes et de molécules effectrices, les tests PM peuvent fournir un profilage métabolique fonctionnel et offrir des informations sur la fonction, le métabolisme et la sensibilitéenvironnementale 15,16,17. Plus précisément, les tests PM détectent l’utilisation des métabolites des cellules dans des microplaques de 96 puits contenant différents nutriments, métabolites ou osmolytes contenus dans chaque puits. De plus, il est également possible de tester des molécules bioactives, telles que des antibiotiques et des hormones. Comme déterminé par l’intensité de la production de couleur par la réduction du NADH d’un colorant redox à base de tétrazolium, l’utilisation métabolique des substrats est évaluée en termes de respiration cellulaire15,16,17. Les expériences sur des microplaques de 96 puits peuvent être surveillées et déterminées automatiquement au fil du temps avec la plate-forme d’instrument de microréseau phénotypique (PMI). Vingt microplaques de 96 puits sont conçues pour représenter les métabolites communs pour étudier les phénotypes cellulaires afin d’utiliser des sources de carbone, d’azote, de soufre et de phosphore, ainsi que différents effets osmotiques / ioniques et pH. La technologie PM a été utilisée avec succès pour mettre à jour et mettre à niveau un certain nombre de modèles métaboliques existants à l’échelle du génome pourlesmicro-organismes15, 16,17,18.
Le protocole et les données présentées ici sont basés sur des travaux précédemment publiés par Chaiboonchoe et al. 12 Les travaux présentés détaillent l’utilisation de la méthode d’essai des particules pour caractériser les phénotypes métaboliques des microalgues et pour élargir un modèle métabolique algal existant de C. reinhardtii ainsi que pour guider la reconstruction de nouveaux modèles métaboliques.

<table><tbody><tr><td>Ampicilline</td><td>VWR</td><td>97062-796</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de dosage Biolog [ PM01-08]</td><td>Biolog, Hayward, CA, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biolog Omnilog Instrument</td><td>Biolog, Hayward, CA, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii souche CC-503</td><td>Chlamydomonas Resource Center à l’Université du Minnesota, États-Unis.</td><td></td><td>Régents de l’Université du Minnesota</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>VWR</td><td>0408-EU-10G</td><td></td></tr><tr><td>Colorant violet de tétrazolium " D"</td><td>Biolog, Hayward, CA, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td><td>42010012-2</td><td></td></tr></tbody></table>

profilage métabolique à haut débit pour les raffinements de modèles de microalgues

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

Les modèles métaboliques sont reconstruits sur la base de l’annotation du génome disponible d’un organisme et fournissent des outils prédictifs pour étudier les processus métaboliques au niveau des systèmes. Les modèles métaboliques à l’échelle du génome peuvent inclure des lacunes ainsi que des réactions qui ne sont pas vérifiées expérimentalement. Les modèles reconstruits d’espèces de microalgues nouvellement isolées entraîneront des faiblesses en raison de ces lacunes, car il existe généralement peu de preuves biochimiques disponibles pour le métabolisme de ces isolats. La technologie des microréseaux phénotypiques (PM) est une méthode efficace à haut débit qui détermine fonctionnellement les activités métaboliques cellulaires en réponse à un large éventail de métabolites d’entrée. La combinaison des essais phénotypiques à haut débit avec la modélisation métabolique peut permettre de reconstruire ou d’optimiser rapidement les modèles de réseau métabolique existants en fournissant des preuves biochimiques pour soutenir et élargir les preuves génomiques. Ce travail montrera l’utilisation des tests PM pour l’étude des microalgues en utilisant l’espèce modèle de microalgue verte Chlamydomonas reinhardtii comme exemple. Des preuves expérimentales de plus de 254 réactions obtenues par PM ont été utilisées dans cette étude pour étendre et affiner d’environ 25% un modèle de réseau métabolique de C. reinhardtii à l’échelledu génome, i RC1080. Le protocole créé ici peut être utilisé comme base pour profiler fonctionnellement le métabolisme d’autres microalgues, y compris les mutants de microalgues connus et les nouveaux isolats.

Ce protocole démontre l’utilisation d’une plate-forme technologique de microréseau phénotype (PM) pour définir les besoins métaboliques de Chlamydomonas reinhardtii, une microalgue verte, et affiner un modèle de réseau métabolique existant.

Profilage métabolique à haut débit pour les raffinements de modèles de microalgues

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...

La technologie des micro-réseaux phénotypiques est une méthode efficace à haut débit qui détermine fonctionnellement les activités métaboliques cellulaires en réponse à un large éventail de métabolites d’entrée. L’utilisation dans cette technologie est mesurée sous la forme d’une respiration cellulaire déterminée par la quantité de développement de couleur produite par la réduction NADH d’un colorant redox à base de tétrazolium. Dans ce travail, nous introduirons l’utilisation de tests de microrésement phénotypiques dans le contexte de micro-algues en utilisant l’espèce modèle Chlamydomonas reinhardtii.L’objectif de cette étude est d’établir une méthode fiable pour caractériser le phénotypage métabolique des micro-algues qui peut être utilisée pour étendre les modèles de réseau métabolique d’algues existants ou guider la reconstruction de nouveaux modèles. La souche CC-503 de Chlamydomonas reinhardtii peut être obtenue auprès du centre de ressources Chlamydomonas de l’Université du Minnesota aux États-Unis. Cultiver les cellules dans des milieux de graisse de phosphate de tris-acétate frais jusqu’à la phase médiane logarithmique.Vérifiez les cellules au microscope pour vous assurer qu’elles sont en bon état et sans aucune contamination. Faites tourner la culture à 2000 G-force pendant 10 minutes. Jetez le surnageant sans déranger la pastille.Préparez des milieux frais contenant 0,1% de colorant violet tétrazolium D"Ajoutez différents antibiotiques, notamment timentin, ampicilline et kanamycine, au milieu pour inhiber la croissance bactérienne. Les milieux gras et cette étape doivent être omis des nutriments, en fonction de chaque type de plaque. Ressés suspendez la pastille et le milieu frais du robinet jusqu’à une concentration finale de 1 million de cellules par millilitre.Utilisez des plaques d’essai de réseau de composés chimiques, telles que des sources de carbone, des sources d’azote, des plaques de sources de phosphore et de soufre, et les sources d’azote peptidique. Inoculer 100 microlitres adéquats de supports autonomes dans chaque puits des plaques d’essai. Assurez-vous de dupliquer les tests.Il convient de noter qu’à ce stade, les cellules doivent être testées avec une coloration à Gram négatif avant et après le test pour surveiller la contamination bactérienne. Insérez les plaques d’essai de la zone de composé chimique dans le système de lecteur de microplaques. Incuber toutes les plaques à 30 degrés pendant sept jours et programmez le système de lecteur de microplaques pour lire le changement de couleur du colorant toutes les 15 minutes.Comme la plupart des lecteurs de microplaques ne fournissent pas de source de lumière continue pendant l’incubation, les algues devraient pouvoir effectuer une respiration hétérotrophe. Exportez les données cinétiques brutes du lecteur de microplaques sous forme de fichiers CSV, qui seront ensuite utilisés comme entrée dans le progiciel de microréseau phénotypique et notre logiciel. Pour effectuer l’analyse des données du microréseau phénotypique, utilisez le progiciel OmniLog phenotype micro Erik OPM qui s’exécute dans l’environnement logiciel R.Dans R studio, l’interface utilisateur graphique de R, installez le package OPM et ses dépendances à l’aide des commandes détaillées dans le manuscrit. Accédez au répertoire qui contient les fichiers CSV des données cinétiques et importez les données à l’aide de la fonction OPM de lecture. Les données cinétiques peuvent être agrégées et discrétisées à l’aide de l’estimation des paramètres pref.L’utilisation de la fonction XY plot permet de cartographier les mesures de respiration ou de croissance en fonction du temps pour les plaques de dosage à 96 puits. Les données peuvent être visualisées sous forme de carte thermique à l’aide du diagramme au niveau de la fonction pour permettre un aperçu comparatif rapide des données cinétiques. L’étape suivante consiste à identifier les réactions et les gènes associés aux nouveaux métabolites.En cas de présence d’un modèle existant pour les algues, l’analyse des données du système de microréseau phénotypique peut être utilisée pour affiner ce modèle. Nous présentons ici le pipeline que nous avons utilisé pour affiner le réseau métabolique à l’échelle du génome pour le modèle Chlamydomonas en utilisant des données de microréseau phénotypique. Lorsqu’un nouveau composé est testé positif pour l’utilisation, les profils de réaction pertinents du composé sont définis à l’aide de connaissances métaboliques, fournissant les numéros de commission d’enzyme associés.La première étape consiste à rechercher Kegg et MetaCyc pour identifier les numéros de commission d’enzymes, ECs, pour les réactions à l’aide de métabolisés trouvés dans les réseaux de composés chimiques. Ensuite, nous utilisons les numéros EC identifiés comme base de recherche dans plusieurs ressources d’annotation d’algues disponibles, telles que le Joint Genome Institute, JGI, Phytozome et des publications évaluées par des pairs. Les réactions et les métabolites sont ajoutés au modèle de réseau métabolique de Chlamydomonas reinhardtii à base de COBRA, iRC1080, pour élargir et affiner le modèle.Si aucune preuve génétique n’est trouvée à l’appui du numéro EC, une recherche basée sur un profil telle que NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, peut être effectuée pour identifier les gènes candidats associés à la réaction. Les résultats sont ensuite évalués manuellement. Ceux qui réussissent cette étape de contrôle qualité avec des valeurs E inférieures à 0,05 pour la pertinence par rapport aux numéros EC de recherche sont ensuite ajoutés au modèle métrique.La dernière étape de ce protocole consiste à affiner le modèle, à évaluer et à comparer les modèles. Utilisez la dernière version 3.0 de la boîte à outils COBRA et la plate-forme MATLAB pour effectuer les étapes d’affinement du modèle. Après avoir installé la boîte à outils Cobra, vous pouvez télécharger le modèle iRC1080.Ensuite, dans MATLAB, la première chose à faire est de naviguer vers le dossier contenant le modèle de référence, iRC1080. Ajoutez les réactions identifiées avec leurs gènes associés au modèle métabolique, comme iRC1080, à l’aide des fonctions de la boîte à outils Cobra. Ajouter la réaction et modifier l’association des gènes.Accédez au répertoire qui contient le modèle iRC1080 et exécutez les commandes pour charger le modèle. Renommez-le et ajoutez une nouvelle réaction et son gène associé. Dans certains cas, lorsque le métabolite n’est pas produit intracellulairement, mais est prélevé dans le milieu, des réactions de transport pour les nouveaux métabolites doivent être ajoutées au modèle à l’aide de la fonction de réaction d’ajout/échange pour entrer ou sortir le métabolite dans le milieu extracellulaire.Testez le comportement du nouveau résultat et du nouveau modèle, par exemple, iBD1106, en effectuant une analyse d’équilibre de flux, FBA, en utilisant la fonction optimiser le modèle CB dans des conditions claires et sombres pour la maximisation de la biomasse en tant que fonction objet. Entre autres, la solution Expédié par Amazon produit trois vecteurs, à déterminer les flux de réaction, les prix de l’ombre des métabolites et les coûts de réduction de la réaction. Ici, un exemple est fourni où le modèle iRC1080 est comparé à sa version raffinée, iBD1106, en obtenant les prix fictifs qui représentent la sensibilité de la fonction objectif de biomasse aux changements et métabolites pris en compte dans chaque modèle.Ici, nous montrons des diagrammes XY de respiration et des diagrammes de niveau des sources de carbone et des plaques d’essai des sources d’azote pour l’ébauche et cc-503 en couleur sarcelle et violet, respectivement. Dans chaque puits, les courbes de respiration représentent la conversion du colorant par réduction en fonction du temps. Le pic mis en évidence dans le panneau A représente la détection de l’acétate comme seule source de carbone de cette plaque, ce qui est cohérent avec la littérature sur Chlamydomonas.La comparaison du nombre de métabolites identifiés à l’aide de trois méthodes différentes, iRC1080, qui est le modèle métabolique bien organisé de Chlamydomonas, le temps de chromatographie en phase gazeuse du vol GC-TOF et l’essai de microréseau phénotypique montre que seulement six métabolites se chevauchent entre les trois ensembles, tandis que 149 étaient courants entre iRC1080 et l’ensemble de tests de microréseaux phénotypiques. Cela montre que, bien que chaque technologie ait une force pour la recherche sur le profilage métabolique, l’ensemble de tests de microréseau phénotype peut être une source importante de nouvelles informations métaboliques. Les informations obtenues ont été utilisées pour étendre et affiner le modèle de réseau métabolique iRC1080.Ici, nous comparons le contenu du modèle iRC1080 et du modèle élargi iBD1106, y compris le nombre de réactions, le nombre de métabolites et le nombre de gènes. Nous montrons que l’affinement de notre modèle a ajouté plus de 254 réactions au nouveau réseau résultant. Ces réactions sont classées en acides aminés, dipeptides, tripeptides et réactions de transport.Les métabolites nouvellement identifiés ont été utilisés pour l’expansion du réseau métabolique et le raffinement du modèle métabolique existant de Chlamydomonas reinhardtii. Les tests de microréseaux phénotypiques peuvent être utilisés pour caractériser les phénotypes métaboliques de souches existantes et nouvellement isolées. De plus, le protocole que nous avons utilisé dans le contexte des micro-algues peut guider le raffinement des modèles métaboliques d’autres espèces.

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