Différenciation des cellules précurseurs neuronales induites par le champ électrique dans les appareils microfluidiques
14 avril 2021
Dans cette étude, nous présentons un protocole pour la différenciation des cellules souches neurales et progénitrices (PNJ) uniquement induite par la stimulation par impulsions à courant direct (DC) dans un système microfluidique.
Cette étude présente un protocole pour la différenciation des cellules précurseurs neuronales uniquement induites par la stimulation directe du courant pulsé dans un système microfluidique. Cette technique fournit une approche bénéfique pour réduire le temps d’installation expérimentale, le volume de l’échantillon et le volume des réaccents. De plus, la puce MOE convient aux observations de microscopie confoccale.
Le traitement à courant direct simple peut contrôler le sort des cellules précurseurs neuronales de la souris et pourrait être utilisé pour développer des stratégies thérapeutiques pour les troubles du système nerveux. Pour commencer, dessiner des motifs pour les différentes couches PMMA et le ruban à double face à l’aide d’un logiciel approprié. Allumez le scriber laser au dioxyde de carbone et connectez-le à un ordinateur personnel.
Ouvrez le fichier de motifs conçu à l’aide du logiciel. Placez les feuilles PMMA ou le ruban adhésif à double face sur la plate-forme du scriber laser, puis concentrez le laser sur la surface des feuilles PMMA ou sur le ruban à double face à l’aide de l’outil de mise au point automatique. Sélectionnez le scriber laser comme imprimante, puis utilisez le scriber laser pour démarrer l’ablation directe sur la feuille PMMA ou le ruban adhésif à double face.
Retirer le film protecteur des feuilles pmma et nettoyer la surface à l’aide de gaz azoté. Pour lier plusieurs couches de feuilles PMMA, empilez trois morceaux de feuilles PMMA d’un millimètre et les lier sous une pression de cinq kilogrammes par centimètre carré dans un obligataire thermique pendant 30 minutes à 110 degrés Celsius pour former l’assemblage du canal de stimulation électrique ou d’écoulement. Adhérez 12 pièces d’adaptateurs aux ouvertures individuelles dans la couche un de l’assemblage de puce de MOE avec la colle cyanoacrylate à action rapide.
Désinfectez les substrats PMMA d’un millimètre, le ruban adhésif à double face et le PMMA optique de trois millimètres à l’aide de l’irradiation ultraviolette pendant 30 minutes avant d’assembler la puce. Adhérez aux substrats PMMA d’un millimètre sur le PMMA optique de trois millimètres avec le ruban adhésif à double face pour compléter l’assemblage pmma. Adhérez à la couverture nettoyée à l’assemblage PMMA avec le ruban adhésif à double face.
Sceller les ouvertures des adaptateurs de pont d’agar avec des bouchons blancs serrés aux doigts. Connectez le connecteur à fond plat à l’assemblage de puces MOE via l’entrée moyenne et les adaptateurs de sortie, puis connectez l’adaptateur cone Luer aux robinets d’arrêt à trois sens. Ajoutez deux millilitres de solution 0,01% PLL à l’aide d’une seringue de trois millilitres qui se connecte au robinet d’arrêt à trois sens de l’entrée moyenne, et connectez une seringue vide de trois millilitres à la robinet d’arrêt à trois sens de la prise moyenne.
Remplissez les régions de culture cellulaire avec la solution PLL, et pompez lentement la solution de revêtement dans les deux sens. Fermez les deux robinets à trois pour sceller la solution à l’intérieur des régions de culture. Incuber la puce MOE à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans un incubateur rempli de 5% d’atmosphère de dioxyde de carbone.
Ouvrez les deux robinets d’arrêt à trois voies et chassez les bulles dans les canaux en pompant manuellement la solution de revêtement dans les deux sens dans le canal à l’aide des deux seringues. Dessinez trois millilitres de milieu complet dans une seringue de trois millilitres qui se connecte au robinet d’arrêt à trois sens de l’entrée moyenne et ajoutez-la pour remplacer la solution de revêtement dans les régions de culture cellulaire. Remplacez la prise blanche serrée au doigt par l’adaptateur Luer et injectez 3 % d’agarose chaude pour remplir l’adaptateur.
Connectez la seringue de verrouillage Luer à l’adaptateur Luer et injectez 3% d’agarose chaude à travers le bong en caoutchouc noir pour remplir la seringue de verrouillage Luer. Laisser refroidir et solidifier de 10 à 20 minutes l’agarose. Installez la puce MOE ensemencée sur le chauffe-eau ITO transparent qui est fixé sur un stade motorisé XYZ programmable maintenu à 37 degrés Celsius.
Infuser les mNPC en pompant manuellement dans la puce MOE via la prise moyenne, puis incuber la puce MOE ensemencée sur le chauffe-eau ITO pendant quatre heures. Utilisez des fils électriques pour connecter un multiplexeur EF à la puce MOE via les électrodes de la puce. Connectez un multiplexeur EF et un générateur de fonction à un amplificateur pour produire des impulsions DC à ondes carrées.
Retirez tous les connecteurs et adaptateurs à fond plat sur la puce MOE et remplissez les adaptateurs avec PBS, puis scellez les ouvertures de l’adaptateur avec du parafilm. Après immunostaining, observez les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence confoccale. La stimulation d’impulsion de DC a eu comme conséquence les mNPCs simultanés différeciant dans les neurones, les astrocytes, et les oligodendrocytes dans le milieu d’entretien de cellules souches.
Les pourcentages de neurones, d’astrocytes et d’oligodendrocytes dans le groupe témoin et dans le groupe de stimulation sont montrés ici. Après le traitement d’impulsion de DC, les mNPCs ont exprimé des nombres sensiblement élevés de neurones à DIV sept, d’astrocytes à DIV trois, et d’oligodendrocytes au DIV sept et au DIV 14 étaient présents aux niveaux relativement plus élevés dans les groupes de stimulation que dans le groupe témoin. Les neurosphères formées par 30 à 40 cellules sont préférées pour initier la différenciation mNPC.
La prolifération des MNPC nuira à la survie cellulaire pendant le processus de différenciation.
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Aperçu
Cette étude présente un protocole de différenciation de cellules souches neurales induite par une stimulation par impulsions de courant continu dans un système microfluidique. Cette technique réduit le temps de mise en place de l'expérience, le volume d'échantillon et le volume de réactifs, ce qui la rend efficace pour les applications de recherche.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Microfluidique
Contexte
- Les cellules souches neurales (CSN) sont essentielles pour comprendre le développement neural.
- La stimulation par impulsions de courant continu peut influencer le destin cellulaire.
- Les systèmes microfluidiques permettent un contrôle précis des conditions expérimentales.
- Cette approche peut contribuer au développement de thérapies pour les troubles du système nerveux.
Objectif de l'étude
- Établir un protocole fiable pour la différenciation des cellules progénitrices neuronales (NPC).
- Utiliser la stimulation par courant continu comme méthode de contrôle du destin cellulaire.
- Démontrer l'efficacité d'un système microfluidique dans la recherche en neurosciences.
Méthodes utilisées
- Conception de motifs pour les couches de PMMA et le ruban double face.
- Utilisation d'un graveur au laser au dioxyde de carbone pour la fabrication.
- Application d'une stimulation par impulsions de courant continu sur les NPCs.
- Réalisation d'observations par microscopie confocale pour l'analyse.
Résultats principaux
- Différenciation réussie des CPN à l'aide du protocole proposé.
- Réduction du temps de configuration expérimentale et de l'utilisation des ressources.
- Faisabilité de l'utilisation de la puce MOE pour la microscopie.
- Applications potentielles dans les stratégies thérapeutiques des troubles du système nerveux.
Conclusions
- Le protocole propose une approche simplifiée pour la différenciation des NPCs.
- La stimulation par courant continu est efficace pour contrôler le destin cellulaire.
- Les systèmes microfluidiques améliorent l'efficacité expérimentale en neurosciences.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette plateforme microfluidique permet un contrôle précis de la différenciation des cellules souches neurales à l’aide d’une stimulation par impulsions de courant continu, offrant ainsi un modèle évolutif et économe en ressources pour la validation ciblée en recherche sur les maladies neurodégénératives. En réduisant la complexité expérimentale et la consommation de réactifs, elle soutient l’évaluation précoce des mécanismes et renforce la prévisibilité des stratégies de modulation du destin cellulaire. La compatibilité du système avec une stimulation à long terme et un imagerie automatisée le rend apte à s’intégrer dans des flux de découverte axés sur les thérapeutiques du système nerveux.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier les signaux électriques en tant que régulateurs du destin des cellules souches neurales, en soutenant la vérification d'hypothèses ciblées dans les voies du développement neuronal.
- Valeur opérationnelle : Réduit les volumes d'échantillons et de réactifs grâce au confinement microfluidique, abaissant ainsi les coûts lors des campagnes de criblage précoce de cibles.
- Valeur prédictive : Fournit des mesures quantitatives de la différenciation neuronale, astrocytaire et oligodendrocytaire, permettant des décisions fondées sur les données concernant la poursuite ou l'abandon de cibles modulatrices.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des produits de différenciation standardisés et reproductibles selon des paramètres de champ électrique contrôlés, adaptés à l'optimisation des tests.
- Valeur opérationnelle : Permet le test multiplexé de conditions grâce à des conceptions à canaux, augmentant le débit dans l'évaluation de composés ou de stimuli.
- Préparation au test : Supporte la culture à long terme et l'imagerie en temps réel, permettant le profilage cinétique des dynamiques de différenciation pour la validation des tests.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Utilise des cellules souches précursrices neuronales de souris dans un microenvironnement défini, renforçant la pertinence par rapport aux processus de différenciation neuronale in vivo.
- Modélisation préclinique : Permet la génération de lignées gliales et neuronales à partir d’un progéniteur commun, utile pour modéliser des troubles du système nerveux.
- Progression ajustée au risque : Permet d’évaluer le biais de différenciation sous stimulation, fournissant des informations sur le profil mécanistique de sécurité et d’efficacité.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte précoce, en particulier aux étapes de validation de cibles et d'identification de composés initiateurs, où la compréhension mécanistique des régulateurs du destin cellulaire est essentielle. Elle soutient les campagnes de criblage en fournissant un système contrôlé et quantifiable pour évaluer l'activité biologique de modulateurs électriques ou pharmacologiques. Les résultats produits par la plateforme — des métriques de différenciation spécifiques aux lignées — alimentent des pipelines d'analyse utilisés pour hiérarchiser les cibles avec une confiance prédictive dans les mécanismes de réparation neuronale.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur les voies de signalisation bioélectrique dans les cellules souches neurales, réduisant ainsi l'ambiguïté concernant le mécanisme cible.
- Criblage : Permet la réalisation d'essais de différenciation reproductibles et quantitatifs sous stimulation électrique définie, améliorant la fiabilité des essais.
- Analytique : Fournit des paramètres mesurables (par exemple, % de neurones, d'astrocytes, d'oligodendrocytes) pour des analyses comparatives entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Modélise la dynamique de différenciation associée aux troubles du système nerveux, assurant une continuité préclinique.
- Réutilisation en milieu professionnel : Conçu pour être utilisé de manière répétée dans diverses conditions expérimentales, favorisant la standardisation et la cohérence entre projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance dans la validation des cibles en isolant la stimulation électrique comme variable définie dans la détermination du destin cellulaire.
- Valeur opérationnelle : Standardise les protocoles de différenciation grâce à la précision microfluidique, améliorant la reproductibilité entre sites et équipes.
- Valeur stratégique : Accélère les décisions d'aller/arrêt en fournissant des indicateurs précoces et mécanistiques de l'engagement lignagique, réduisant le risque d'échec en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles modulant la différenciation neuronale, améliorant l'efficacité du capital dans les portefeuilles en neurosciences.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en assemblage de dispositifs microfluidiques, en électrophysiologie et en culture de cellules souches neuronales.
- Suppose l'accès à des outils de fabrication laser, à des chauffages ITO, à des multiplexeurs de champ électrique et à des systèmes de microscopie inversée.
- Exige une standardisation des paramètres électriques (largeur d'impulsion, fréquence, amplitude) entre les expériences afin d'obtenir des résultats reproductibles.
- L'adaptation à des cellules précurseurs neuronales d'origine humaine peut nécessiter une optimisation des paramètres de stimulation et des conditions de culture.
- La stabilité à long terme des électrodes et l'encrassement biologique dans les études de stimulation chronique constituent des limitations pratiques à prendre en compte.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Design and Fabrication of the Multichannel, Optically Transparent, Electrotactic Chip and Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions
2:49
Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions and Preparation of the Salt Bridge Network
4:47
Setup of the Microfluidic System for DC Pulse Stimulation
5:55
Results: Differentiation of the mNPC Cells in the Control Group and in the DC Pulse Stimulation Group at DIV 3, 7, and 14
6:43
Conclusion
