Dissection régionale cérébelleuse pour l’analyse moléculaire

Des études moléculaires traditionnelles du cervelet ont été effectuées sur des extraits cérébelleux entiers, ce qui peut masquer toute distinction entre des régions cérébelleuses spécifiques. Ce protocole permet d’évaluer séparément des régions distinctes du cervelet et permet d’explorer les mécanismes moléculaires qui peuvent sous-tendre leurs contributions uniques à une variété de comportements et à la progression de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la dissection reproductible et rapide de quatre régions cérébelleuses, les noyaux cérébelleux profonds, le cortex cérébelleux antérieur et postérieur du Vermis et le cortex cérébelleux des hémisphères.

Après avoir décapité la souris euthanasiée, faites une incision avec une lame de rasoir le long de la ligne sagittale médiale de la tête, en commençant par le nez et en continuant tout le chemin vers l’arrière. Séparez la peau et utilisez la lame de rasoir pour couper le muscle de chaque côté, en coupant au-delà des conduits auditifs. À l’aide de ciseaux à dissection, coupez de nombreuses régions de la moelle épinière jusqu’à l’endroit où le tronc cérébral rencontre le cervelet, en prenant soin de ne pas endommager le cervelet.

Insérez l’une des lames de ciseaux vasculaires dans l’espace entre le tronc cérébral et la colonne vertébrale et coupez vers le conduit auditif, en soulevant vers le haut tout en coupant pour limiter les dommages aux tissus. Continuez à couper le long du bord du crâne vers les bulbes olfactifs. À l’aide de la pince émoussée, décollez doucement l’arrière de ce crâne pour découvrir la région postérieure du cerveau et du cervelet.

Positionnez la pince émoussée le long du bord coupé du crâne et décollez le crâne vers le haut et sur le cerveau. Coupez le reste du crâne avec les ciseaux vasculaires et la pince émoussée, en dégageant la majeure partie du haut du cerveau. Soulevez légèrement le cerveau avec la micro spatule pour retirer les bulbes olfactifs du crâne restant et déconnecter les fibres du tractus optique.

Le cerveau devrait se libérer facilement à ce stade. Placez le cerveau dans la boîte de Pétri, assis sur de la glace et retirez tout crâne restant ou autres débris. Placez doucement le cerveau dans la matrice cérébrale avec le côté dorsal vers le haut.

Assurez-vous qu’il est au niveau de la matrice et que la ligne médiane est au centre. Placez une lame de rasoir le long de la ligne médiane sagittale, en vous assurant que la lame pousse jusqu’au bas de la matrice. Placez une autre lame de rasoir à un millimètre sur le côté de la première lame.

Placez deux autres lames résultant en trois lames placées d’un côté du cerveau, toutes espacées d’un millimètre. Répétez cette opération de l’autre côté. Saisissez soigneusement l’avant et l’arrière des lames de rasoir et soulevez-les vers le haut hors de la matrice.

Jetez le tissu à l’extérieur des lames de rasoir. Lentement, séparez une lame de rasoir à la fois des autres en prenant soin de ne pas endommager les sections de tissus. Faites glisser la section du tissu de la lame de rasoir et sur la lame de verre avec la micro-spatule.

Six sections cérébrales sagittales doivent être prélevées. Les sections latérales les plus avant auront DCN visible. Pour isoler le DCN, tenez une pointe de pipette de 200 microlitres perpendiculairement au-dessus du DCN et poussez vers le bas à travers le tissu en le balançant fermement dans toutes les directions.

Soulevez la pipette et confirmez visuellement la présence du tissu dans la pointe. Placez un doigt en haut de la pointe et appuyez vers le bas, ce qui fait gonfler le tissu. Insérez l’embout dans un tube de microfiche correctement étiqueté et assurez-vous que le poinçon en tissu est placé au fond du tube.

Répétez cette opération pour les trois sections restantes, en plaçant les poinçons DCN dans le même tube. Congelez rapidement le tube dans de l’azote liquide. Repoussez le reste du tissu cérébral autour du cervelet dans les sections où le DCN a été extrait.

À l’aide d’une pince émoussée, prélevez doucement ces sections du cortex cérébelleux de l’hémisphère et placez-les dans des tubes de microfiches respectifs, puis congelez-les. Pour les deux dernières sections vermales, repoussez les tissus cérébraux environnants pour ne laisser que le cervelet. À l’aide d’une lame de rasoir, faites une incision séparant les lèvres antérieures des lèvres postérieures.

Assurez-vous que la coupe est juste après la formation de la lèvre six et n’inclut pas la lèvre 10. À l’aide d’une pince émoussée, placez soigneusement les sections antérieures du cortex cérébelleux et postérieures du cortex cérébelleux dans leurs tubes de microfiches respectifs et congelez-les en laissant les tubes dans de l’azote liquide pendant cinq minutes. Placez les tubes de microfiches sur de la glace pour empêcher le tissu de dégeler trop rapidement et appliquez 150 microlitres de solution d’isolement d’ARN froid dans le tube de microfiches, puis homogénéisez avec un pilon stérilisé.

Une fois le tissu homogénéisé, pipetez la solution de haut en bas pour vous assurer qu’il ne reste pas de tissu intact. De plus, brisez tous les petits morceaux de tissu en les tirant plusieurs fois dans une seringue à insuline. Ajoutez encore 350 microlitres de réactif, pipetez de haut en bas pour bien mélanger et laissez reposer à température ambiante pendant cinq minutes.

Ajoutez 150 microlitres de chloroforme dans le tube et secouez-le vigoureusement, puis laissez-le reposer pendant deux à trois minutes. Centrifuger à 12 000 fois G à 15 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse et réglez la température de la centrifugeuse à quatre degrés Celsius.

Transférez uniquement la phase aqueuse claire dans un nouveau tube en prenant soin de ne pas perturber l’interphase opaque. Conservez ou jetez la solution restante dans les tubes. Ajoutez de l’alcool isopropylique à 100 % dans un rapport de un à deux et mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas.

Laissez reposer l’échantillon à température ambiante pendant 10 minutes pour précipiter l’ARN hors de la solution. Centrifugez à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, en plaçant tous les tubes dans la même orientation pour faciliter la visualisation de la pastille. Après la centrifugation, retirez délicatement les tubes et retirez le surnageant avec la pipette, en veillant à ne pas perturber la pastille.

La pastille ressemble à un gel et est difficile à voir, alors estimez où elle se trouve en fonction de l’orientation des tubes dans la centrifugeuse. Après avoir retiré tout surnageant, ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 75 %, tourbillonnez brièvement et centrifugez à 7, 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le surnageant avec précaution, sans perturber la pastille.

Laissez les capuchons ouverts pour sécher l’échantillon pendant cinq à 10 minutes. Une fois sec, remettre la pastille en suspension dans l’eau libre de l’ADN à 20 microlitres pour les échantillons pour le DCN et 30 microlitres pour tous les autres. Conservez les échantillons à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que l’analyse soit plus approfondie.

Ce protocole a été utilisé pour disséquer quatre régions distinctes du cervelet de la souris et pour explorer les différences régionales dans l’expression des gènes. Les niveaux d’expression de l’aldolase C, de la parvalbumine et de KCNG4 ont été évalués par PCR quantitative en temps réel. L’aldolase C est plus fortement exprimée dans le vermis cérébelleux postérieur.

Mais plus faible dans la DCN et la région antérieure du vermis par rapport à la dissection cérébelleuse en vrac. La parvalbumine est également présente dans le derme antérieur, le vermis postérieur et le cortex cérébelleux de l’hémisphère, par rapport aux extraits cérébelleux en vrac. KCNG4 est significativement enrichi dans le DCN et le vermis intérieur, mais pas dans le vermis postérieur ou les hémisphères par rapport à l’extraction en vrac.

Pour comparer directement l’expression de l’aldolase C dans le cortex cérébelleux, les niveaux d’expression ont été comparés à ceux du vermis antérieur. Le niveau d’expression de l’aldolase C était significativement plus élevé dans le Vermis postérieur et avait tendance à augmenter dans les hémisphères cérébelleux. L’ARN extrait de ces régions peut également être utilisé dans des expériences de séquençage de l’ARN.

séquençage de l’ARN comparant ces derniers pour les régions cérébelleuses fournirait des informations plus détaillées sur les mécanismes moléculaires, sous-jacents aux fonctions discrètes de ces régions. Ainsi que les différences potentielles dans leur vulnérabilité à la maladie.