Xenopus laevis Préparation d’extrait d’oeuf et méthodes d’imagerie en direct pour visualiser l’organisation cytoplasmique dynamique
6 juin 2021
Nous décrivons une méthode de préparation et d’imagerie en direct d’extraits cytoplasmiques non dilués d’œufs de Xenopus laevis .
Cette méthode convient à l’imagerie en direct de la dynamique cytoplasmique à l’aide d’extraits d’œufs de grenouille, permettant l’étude des informations de motif spatial dans le cytoplasme. Les échantillons peuvent être façonnés en une couche avec une épaisseur uniforme et réglable et imagés sur un champ 2D ou un volume 3D. Cette méthode est rentable et facile à mettre en œuvre.
Commencez par appliquer une couche de ruban adhésif FEP sur une lame de verre à l’aide d’un applicateur à rouleaux. Coupez le ruban adhésif excessif sur les bords avec une lame de rasoir propre. Ensuite, préparez les bordereaux de couverture enduits de ruban adhésif FEP de la même manière.
Appliquez ensuite une entretoise d’imagerie collante double face sur le côté enduit de ruban FEP de la glissière, en laissant la doublure de protection non pelée. Transférer les œufs dans un bécher en verre de 400 millilitres et enlever autant de tampon de ponte que possible en les décantant. Ensuite, incuber les œufs dans 100 millilitres de solution dégelante fraîchement préparée et les agiter doucement.
Après environ trois minutes, versez la solution et ajoutez 100 millilitres de solution de dégelage fraîche. Continuez l’incubation jusqu’à ce que les œufs soient bien emballés, mais évitez de laisser les œufs dans la solution de déjeltion pendant plus de cinq minutes au total. Après l’incubation, retirez la solution dégelante autant que possible et lavez les œufs dans un tampon ROR 0,25x.
Faites tourbillonner les œufs, puis versez le tampon. Répétez plusieurs fois jusqu’à ce qu’un litre total du tampon soit utilisé pour les lavages. Ensuite, lavez les œufs plusieurs fois avec un total de 400 millilitres de tampon de lyse des œufs, en éliminant les œufs anormaux entre les lavages.
Utilisez ensuite une pipette de transfert avec une pointe de coupe large pour transférer les œufs dans un tube centrifuge à fond rond de 17 millilitres contenant un millilitre de tampon de lyse des œufs. Faites tourner le tube dans une centrifugeuse clinique à 400 g pendant 15 secondes pour emballer les œufs. Ensuite, retirez autant de tampon de lyse de l’œuf que possible à l’aide d’une pipette Pasteur.
Déterminez le volume approximatif des œufs emballés. puis ajoutez cinq microgrammes par millilitre d’aprotinine, de leupeptine et de cytochalasine B et 50 microgrammes par millilitre de cyclohexamide directement sur les œufs emballés. Écraser les œufs en centrifuyant le tube pendant 15 minutes à 12 000 g et quatre degrés Celsius dans un rotor de godet oscillant.
Ensuite, fixez une aiguille de calibre 18 à une seringue. Avec le biseau de l’aiguille tourné vers le haut, percer le tube du côté au bas de la couche cytoplasmique et récupérer l’extrait en tirant lentement. Transférer l’extrait cytoplasmique récupéré dans un nouveau tube microcentrifuge et le garder sur la glace.
Lorsque vous êtes prêt à imager, complétez l’extrait avec les réactifs souhaités et les sondes d’imagerie par fluorescence. Retirez le revêtement protecteur supérieur de l’entretoise d’imagerie sur la lame préparée et déposez environ sept microlitres d’extrait au centre du puits. Appliquez immédiatement le couvercle enduit de ruban FEP avec le côté FEP face à l’extrait pour sceller le puits et procéder rapidement à l’imagerie.
Placez la lame sur un microscope inversé ou droit avec une platine motorisée et un appareil photo numérique. Imagez les extraits aux positions spatiales souhaitées à intervalles de temps dans les canaux de champ clair et de fluorescence. Une expérience time-lapse utilisant des extraits d’œufs de xenopus laevis pour étudier l’auto-organisation du cytoplasme pendant l’interphase est présentée ici.
Après environ 20 minutes d’incubation à température ambiante, des zones appauvries en composants cytoplasmiques diffusant la lumière étaient visibles dans les canaux de champ lumineux et les mitochondries. Environ 60 minutes à température ambiante, un schéma spatial constitué de compartiments en forme de cellules devrait être bien établi avec des microtubules formant une structure creuse en forme de couronne et des mitochondries clairement réparties dans chaque compartiment. Une comparaison des performances d’extraction dans les chambres d’imagerie avec et sans bandes FEP sur verre est présentée ici.
Dans la chambre en verre scotché FEP, l’extrait s’est auto-organisé en motifs cellulaires normaux. Dans la chambre où les surfaces de verre n’étaient pas recouvertes par le ruban FEP, l’extrait présentait des motifs anormaux de champ lumineux et de microtubules qui devenaient de plus en plus perturbés au fil du temps. Aucune différence significative n’a été observée dans l’importation nucléaire de la protéine GST-mCherry-NLS.
Les choses importantes à retenir sont de passiver les surfaces en verre avec du ruban FEP et d’enlever tous les mauvais œufs pendant la préparation de l’extrait. Avec ce système, nous pouvons facilement contrôler l’épaisseur de l’échantillon d’extrait, ouvrant la voie à l’imagerie des modèles cytoplasmiques en 3D, en utilisant la microscopie à feuille de lumière.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode simplifiée pour préparer et imager en direct des extraits cytoplasmiques non dilués provenant d'œufs de Xenopus laevis. La technique permet d'observer la dynamique cytoplasmique et le développement de motifs spatiaux au sein du cytoplasme, facilitant ainsi la compréhension de l'organisation cellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Biologie cellulaire
- Microscopie
- Biologie du développement
Contexte
- La dynamique cytoplasmique est cruciale pour comprendre l'organisation cellulaire.
- Les extraits d'œufs de grenouille offrent un système pertinent pour étudier ces processus.
- Les techniques d'imagerie vivante permettent d'approfondir l'exploration du modèle spatial dans le cytoplasme.
Méthodes utilisées
- Préparation d'extraits cytoplasmiques non dilués provenant d'œufs de Xenopus laevis.
- Utilisation d'un ruban FEP pour assurer la stabilité de l'échantillon pendant l'observation.
- Imagerie en temps réel utilisant des marqueurs fluorescents et la microscopie en champ clair.
Résultats principaux
- Visualisation réussie de l'auto-organisation dans des extraits cytoplasmiques au fil du temps.
- Mise en place de compartiments semblables à des cellules présentant des structures de microtubules bien définies.
- La comparaison des performances d'imagerie selon les traitements de surface a révélé des effets significatifs sur l'organisation des extraits.
Conclusions
- L'étude décrit une méthode pratique pour l'imagerie des structures et de la dynamique cytoplasmiques.
- Les résultats améliorent notre compréhension des processus cellulaires et soulignent l'importance des techniques de préparation.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet l'imagerie en direct des dynamiques cytoplasmiques dans des extraits d'ovocytes de Xenopus laevis, offrant un système évolutif et rentable pour étudier la formation de motifs spatiaux et les processus d'auto-organisation liés à l'organisation cellulaire. En éliminant le recours à des traitements chimiques de surface et en utilisant des consommables produits en masse, elle permet une visualisation reproductible et haute résolution de l'organisation des microtubules, du noyau et des mitochondries dans un environnement in vitro contrôlé. L'approche renforce la confiance prédictive dans les études mécanistiques du comportement cytoplasmique, soutenant la validation précoce des cibles et le développement d'essais dans les voies de découverte.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques liées à l'auto-organisation cytoplasmique et aux mécanismes de structuration spatiale.
- Valeur opérationnelle : Contribue à l'atténuation des risques biologiques en visualisant l'organisation cytoplasmique dynamique dans un système d'extrait physiologiquement pertinent.
- Biomarqueur translationnel : Facilite l'identification de caractéristiques cytoplasmiques dynamiques pouvant être corrélées à des états cellulaires fonctionnels.
Développement de tests et criblage
- Standardisation des tests : Fournit une plateforme reproductible pour préparer des extraits de épaisseur et de stabilité uniformes en utilisant un passivage par ruban FEP.
- Résultats quantitatifs : Permet la mesure des dynamiques cytoplasmiques et de l'organisation spatiale par imagerie en champ clair et en fluorescence en laps de temps.
- Préparation au criblage : Offre un système évolutif et peu coûteux, compatible avec la microscopie grand champ et confocale, pour l'évaluation des effets de composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Système pertinent pour les maladies : Sert de modèle mécanistique pour l'étude de processus cytoplasmiques conservés liés à la division et à l'organisation cellulaires.
- Confiance prédictive : Permet de réduire les risques associés aux cibles impliquées dans la régulation du cytosquelette et le balisage spatial grâce à la visualisation directe de l'auto-organisation de l'extrait.
- Continuité translationnelle : Fait le lien entre les observations de découverte et la validation préclinique en établissant un modèle cytoplasmique cohérent et prêt à l'imagerie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la vérification précoce de l'hypothèse sur la cible jusqu'au développement de tests et à la validation préclinique, en particulier pour les cibles influençant la dynamique du cytosquelette et l'organisation subcellulaire.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en permettant la visualisation directe de la dynamique des microtubules et des mitochondries dans des extraits en interphase.
- Criblage : Offre une prête-à-l'emploi pour les tests grâce à une préparation standardisée des extraits et des conditions d'imagerie stables, sans traitement chimique des surfaces.
- Analytique : Produit des données quantitatives spatiales et temporelles sur l'organisation cytoplasmique, permettant des analyses comparatives entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans les travaux précliniques en fournissant un modèle reproductible pour l'étude des processus d'organisation cellulaire conservés.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme d'imagerie réutilisable et peu coûteuse, adaptable à plusieurs cibles et campagnes de criblage.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans les études sur l'organisation cytoplasmique.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité grâce à une préparation normalisée des extraits et à un appoint de surface standardisé basé sur du ruban FEP.
- Valeur stratégique : Permet de mieux décider d'aller ou non plus loin en permettant une visualisation précoce des effets phénotypiques sur la dynamique cytoplasmique.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque en fournissant des informations mécanistiques sur les composés affectant l'organisation cellulaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des œufs de Xenopus, la préparation d'extraits et les techniques d'imagerie en direct.
- Dépend de l'accès à des centrifugeuses, des systèmes de microscopie (champ large/confocale) ainsi qu'au ruban adhésif FEP et aux entretoises d'imagerie.
- Exige une standardisation inter-équipes des protocoles de lavage des œufs, de dégélatinage et de récupération des extraits.
- L'adaptation à l'imagerie 3D peut nécessiter une intégration avec la microscopie à feuillet de lumière et une optimisation du contrôle de l'épaisseur des échantillons.
- Les limitations pratiques incluent la sensibilité à la qualité des œufs et la nécessité d'éliminer les œufs anormaux durant la préparation afin d'assurer une homogénéité des extraits.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Preparation of Slides and Coverslips
1:06
Preparation and Live Imaging of Interphase-Arrested Egg Extracts
4:06
Result: Microscopy Analysis of Interphase-Arrested Egg Extracts Self-Organized into Cell-Like Compartments
5:23
Conclusion
