Name: Un modèle de culture de cellules adipocytaires pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-ARN sur la fonction des adipocytaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Apprenez la transfection inverse d'oligonucléotides dans les adipocytes 3T3-L1 de souris pour étudier l'expression des protéines et des micro-ARN. Cette méthode efficace permet d'analyser le signal de l'insuline et le transport du glucose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ces travaux ont été soutenus par l’INSERM, l’Université Côte d’Azur et l’Agence nationale de la recherche (ANR) Français à travers les programmes Investissements pour le futur Laboratoire d’Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) et Initiative d’Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. est soutenu par des subventions de la Société Francophone du Diabète (SFD), de l’Association Française d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), de l’Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) et de la Fondation Benjamin-Delessert. J.G. est pris en charge par ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. est soutenu par la bourse ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 et une subvention de la Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Nous remercions également le Centre Central d’Imagerie du C3M financé par le Conseil Départemental des Alpes-Maritimes et la Région PACA, qui est également soutenu par la Plateforme de Microscopie et d’Imagerie GIS IBiSA Côte d’Azur (MICA).

REMARQUE: Utilisez des techniques stériles pour effectuer toutes les étapes du protocole dans une hotte de culture cellulaire à flux laminaire. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les réactifs et l’équipement.
1. Différenciation des fibroblastes murins 3T3-L1 en adipocytes
<ol><li>Cultiver les fibroblastes 3T3-L1 dans des plats de 100 mm en milieu de culture DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% de sérum de veau nouveau-né et 1% de pénicilline et de streptomycine (Figure 1A). Placer les plats dans un incubateur de culture tissulaire (7% de CO2 et 37 °C).</li>
	<li>Deux jours après la confluence, changer le milieu de culture, en remplaçant par du DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) et 1 % de pénicilline et de streptomycine complétées par 0,25 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), 0,25 μM de dexaméthasone, 5 μg/mL d’insuline et 10 μM de rosiglitazone. REMARQUE: Il faut 5 jours pour atteindre la confluence lorsque les cellules sont ensemencées à 300 000 cellules par plat de 100 mm.</li>
	<li>Deux jours plus tard, remplacer le milieu de culture par du DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10 % de FCS et 1 % de pénicilline et de streptomycine complétées par 5 μg/mL d’insuline et 10 μM de rosiglitazone et incuber pendant 2 jours. Ensuite, nourrissez les cellules tous les 2 jours avec du DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% FCS, et 1% de pénicilline et de streptomycine (Figure 1B).</li>
	<li>Transfecter les adipocytes 3T3-L1 7-8 jours après le début du protocole de différenciation. NOTE: Il est important d’atteindre un niveau élevé de différenciation (>80%) avant la transfection pour éviter la prolifération des fibroblastes restants après la transfection, ce qui conduirait à une population mixte de cellules qui pourrait biaiser les résultats.</li>
</ol>2. Préparation des plaques prélaquées
<ol><li>La veille ou quelques heures avant la transfection, préparer une solution de collagène de type I à 100 μg/mL dans de l’éthanol à 30 % à partir d’une solution type à 1 mg/mL. Ajouter 250 μL de collagène par puits d’une plaque de 12 puits et 125 μL par puits d’une plaque de 24 puits, et étaler la solution sur la surface du puits.</li>
	<li>Laissez la plaque sans couvercle sous la hotte de culture jusqu’à ce que le collagène sèche. Laver deux fois avec la solution saline tamponnée au phosphate (D-PBS) de Dulbecco. REMARQUE: Des plaques pré-revêtues sont disponibles à l’achat.</li>
</ol>3. Préparation du mélange de transfection
REMARQUE: La concentration finale de siRNA est comprise entre 1 et 100 nM (1 à 100 pmol de siRNA par puits d’une plaque de 12 puits). La concentration finale de l’imitation miR est de 10 nM (10 pmol/puits). Déterminez la meilleure concentration de chaque siRNA, miR mimique ou autre oligonucléotide avant de commencer l’expérience pour éviter les effets hors cible. Effectuer des expériences de transfection en trois exemplaires pour faciliter l’analyse statistique des résultats. Préparez tous les réactifs en excès pour tenir compte de la perte normale pendant le pipetage.
<ol><li>Mélanger par pipetage (volume/volume) le siRNA (ou d’autres oligonucléotides) avec un milieu essentiel minimal amélioré(tableau 1). Incuber pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter le réactif de transfection et le milieu essentiel minimal amélioré à l’ARNi, et pipeter pour mélanger (Tableau 1). Incuber pendant 20 min à température ambiante (pendant ce temps, passer à la section 4). Ajouter le mélange de transfection à chaque puits de la plaque enduite de collagène.</li>
</ol>4. Préparation des adipocytes 3T3-L1
<ol><li>Lavez les cellules dans la boîte de Petri de 100 mm deux fois avec du D-PBS. Ajouter 5x trypsine aux cellules (1 mL par plat de 100 mm), en veillant à couvrir toute la surface avec la trypsine. Attendez 30 s et retirez soigneusement la trypsine.</li>
	<li>Incuber la boîte de Petri pendant 5-10 min à 37 °C dans l’incubateur. Appuyez sur le plat de 100 mm pour détacher les cellules.</li>
	<li>Ajouter 10 ml de DMEM sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% de FCS et 1% de pénicilline et de streptomycine pour neutraliser la trypsine. Pipetez soigneusement le milieu de haut en bas pour détacher les cellules et homogénéiser la suspension cellulaire.</li>
	<li>Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Malassez ou d’un compteur de cellules automatisé et ajustez la concentration des cellules à 6,25 x10 5 cellules/mL de milieu. Ensemencer 800 μL de la suspension/puits cellulaire d’une plaque de 12 puits (5 x10 5 cellules) ou 400 μl de la suspension cellulaire/puits d’une plaque de 24 puits (2,5 x 105 cellules) contenant le mélange de transfection. REMARQUE: Une boîte de Petri de 100 mm d’adipocytes permettra la préparation d’une plaque de 12 puits ou d’une plaque de 24 puits. Un plat de 100 mm contient généralement 6-7 x 106 adipocytes, ce qui correspond à 5 x 105 adipocytes par puits d’une plaque de 12 puits.</li>
	<li>Incuber les plaques dans un incubateur de culture cellulaire (7% de CO2 et 37 °C), et ne pas perturber les cellules pendant 24 h. Le lendemain, remplacez soigneusement le surnageant par du DMEM frais sans pyruvate, 25 mM de glucose, 10% de FCS et 1% de pénicilline et de streptomycine. REMARQUE: Il est également possible d’ensemencer les cellules dans des plaques de 48 et 96 puits précoucheuses de collagène, mais prenez plus de précautions lors du remplacement du milieu pour éviter le détachement des adipocytes.</li>
</ol>5. Analyse fonctionnelle des adipocytes 3T3-L1 transfectés
<ol><li>L’étude cible knockdown 24-48 h et 48-96 h après l’administration d’ARNs ou de miR pour l’ARNm et la protéine, respectivement.</li>
	<li>Effectuer des analyses fonctionnelles des adipocytes transfectés pour étudier la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la sécrétion d’adipokine, la lipolyse et la lipogenèse.</li>
</ol>

<ol><li>Klöting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size%2C+but+not+obesity+itself%2C+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li>
<li>Blüher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li>
<li>Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity%3A+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li>
<li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2%2Fprostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li>
<li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li>
<li>Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).</li>
<li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cet article présente un protocole détaillé pour la différenciation et la transfection des adipocytes matures. Cette méthode de transfection inverse est une méthode simple, économique et très efficace pour transfecter des oligonucléotides tels que, mais sans s’y limiter, les siRNA, les imitations de micro-ARN et les anti-micro-ARN en adipocytes 3T3-L1, qui est l’une des lignées cellulaires les plus difficiles à transfecter. Cette méthode présente certaines limites qui doivent être prises en compte. Ce protocole n’est pas ...

L’obésité est considérée comme un facteur de risque majeur pour de nombreuses maladies métaboliques, y compris la résistance à l’insuline (RI), le diabète de type 2 (DT2) et les maladiescardiovasculaires 1. Les thérapies actuelles n’ont pas réussi à arrêter la prévalence sans cesse croissante de ces maladies, et la prise en charge de l’IR des patients obèses et diabétiques reste un problème clinique important. Le tissu adipeux joue un rôle crucial dans le contrôle de l’homéostasie énergétique, et son expansion pathologique pendant l’obésité contribue au développement de l’IR et du DT2D2,3. Cela souligne la nécessité de mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans le dysfonctionnement des adipocytaires pour développer de nouvelles thérapies contre les maladies liées à l’obésité. De nombreuses études ont étudié le rôle des ARN codant pour les protéines dans la physiologie des adipocytes et leur association avec l’obésité.
Plus récemment, la découverte d’ARN non codants (ARNnc), en particulier de micro-ARN (miR), a forgé de nouveaux concepts liés au mécanisme de régulation des programmes d’expression génique. Des études ont montré que les ARNnc sont d’importants régulateurs de la fonction adipocytaire, et que leur dérèglement joue un rôle important dans les maladies métaboliques4. Ainsi, la manipulation des protéines et des ARNnc dans les adipocytes est cruciale pour déchiffrer leurs rôles dans la fonction adipocytaire et leur impact sur des pathologies telles que le DT2. Cependant, la manipulation de l’expression des protéines et des ARNnc in vivo ainsi que dans les adipocytes primaires reste très difficile, favorisant l’utilisation de modèles adipocytaires in vitro.
Les fibroblastes murins 3T3-L1 se différencient facilement en adipocytes matures, fonctionnels et sensibles à l’insuline, qui sont une lignée cellulaire bien caractérisée utilisée pour étudier la fonction adipocytaire (par exemple, la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la lipolyse et la sécrétion d’adipokines)5,6,7,8,9,10. Ces propriétés font des adipocytes 3T3-L1 un modèle attrayant pour moduler l’expression des protéines codant et des ARN nc afin de déchiffrer leur rôle dans la fonction adipocytaire et leur rôle potentiel dans les maladies liées à l’obésité. Malheureusement, alors que les fibroblastes 3T3-L1 sont faciles à transfecter à l’aide de réactifs disponibles dans le commerce, les adipocytes 3T3-L1 différenciés sont l’une des lignées cellulaires les plus difficiles à transfecter. C’est pourquoi de nombreuses études manipulant l’expression des gènes dans les cellules 3T3-L1 se sont concentrées sur la différenciation des adipocytaires plutôt que sur la fonction adipocytaire.
Pendant longtemps, la seule technique efficace pour transfecter les adipocytes était l’électroporation5, qui est fastidieuse, coûteuse et peut causer des dommages cellulaires. Cet article rapporte une technique de transfection inverse utilisant un réactif de transfection commun, qui réduit le temps de transfection pratique, n’a aucun effet sur la viabilité cellulaire et est beaucoup moins coûteuse que l’électroporation. Ce protocole est parfaitement adapté à la transfection de siRNA et d’autres oligonucléotides tels que les mimiques de micro-ARN (miR mimics) et les anti-miR. Le principe du protocole de transfection inverse est d’incuber le réactif de transfection et les oligonucléotides pour former un complexe dans la plaque de culture cellulaire, puis d’ensemencer les adipocytes matures dans les puits. Ensuite, les adipocytes se rattachent à la surface de la plaque adhérente en présence du complexe oligonucléotides/réactif de transfection. Cette méthodologie simple, efficace et peu coûteuse permet d’étudier le rôle des ARN et des miR codant pour les protéines dans la fonction adipocytaire et leur rôle potentiel dans les maladies liées à l’obésité.

<table><tbody><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 12 puits</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>2,5 % de trypsine (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>diluée à 5x avec D-PBS</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-méthylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Accell Non-targeting Pool</td><td>Horizon Discovery</td><td>D-001910-10-05</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de type I de la peau de veau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s&nbsp ; Milieu Eagles modifié (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>4,5 g/L de D-glucose ; L-Glutamine ; pas de pyruvate</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Témoin négatif si-RNA marqué FAM</td><td>Invitrogen</td><td>AM4620</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de glycérol libre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Solution étalon de glycérol</td><td>Anticorps Sigma-Aldrich</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HSP90</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-131119</td><td>Dilution : 0.5 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Insuline humaine recombinante</td><td>Gibco</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN micro-ARN imite Horizon</td><td>Discovery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Dosages Hs_RNU6-2_11</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1</td><td>Qiagen</td><td>MS00001428</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>219073</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Souris Plin1 si-RNA SMARTpool</td><td>Horizon Discovery</td><td>L-056623-01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline et streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps contre la périlipine-1</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>3470</td><td>Dilution : 1/1000</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 100 mm x 20 mm Anticorps</td><td>Dutscher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>PKB</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9272</td><td>Dilution : 1/1000</td></tr><tr><td>Cellule d’anticorps PKB Phospho Thr308</td><td> Signalisation</td><td>9275</td><td>Dilution : 1/1000</td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de transfection (INTERFERin)</td><td>Polyplus</td><td>409-10</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-tubuline</td> anticorps <td>Sigma aldrich</td><td>T6199</td><td>Dilution : 0.5 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>d’anticorps Vamp2</td><td>R& D Systems</td><td>MAB5136</td><td>dilution : 0,1 & micro ; g/mL</td></tr></tbody></table>

un modèle de culture de cellules adipocytaires pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-arn sur la fonction des adipocytaires

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

L’altération de la fonction adipocytaire contribue à la pathogenèse des maladies métaboliques, y compris le diabète de type 2 et la résistance à l’insuline. Cela souligne la nécessité de mieux comprendre le mécanisme moléculaire impliqué dans le dysfonctionnement des adipocytaires pour développer de nouvelles thérapies contre les maladies liées à l’obésité. La modulation de l’expression des protéines et des micro-ARN dans les adipocytes reste très difficile. Cet article décrit un protocole pour différencier les fibroblastes murins en adipocytes matures et pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN dans les adipocytes matures par transfection inverse en utilisant des oligonucléotides imitant l’ARN (siRNA) et le micro-ARN (miR mimic). Ce protocole de transfection inverse implique l’incubation du réactif de transfection et des oligonucléotides pour former un complexe dans la plaque de culture cellulaire à laquelle les adipocytes matures sont ajoutés. Les adipocytes sont ensuite autorisés à se rattenir à la surface de la plaque adhérente en présence du complexe oligonucléotides/réactif de transfection. Des analyses fonctionnelles telles que l’étude de la signalisation de l’insuline, de l’absorption du glucose, de la lipogenèse et de la lipolyse peuvent être effectuées sur les adipocytes matures 3T3-L1 transfectés pour étudier l’impact de la manipulation des protéines ou des micro-ARN sur la fonction adipocytaire.

En utilisant la procédure de transfection inverse décrite ici pour moduler l’expression de protéines ou de micro-ARN dans les adipocytes 3T3-L1, il a été démontré que les adipocytes préservent leur morphologie après la transfection (Figure 1B,C). En effet, 2 jours après la transfection, les adipocytes étaient bien étalés et attachés à la plaque et présentaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires qui sont une caractéristique des adipoc...

Présenté ici est un protocole pour délivrer des oligonucléotides tels que l’ARN interférent petit (siRNA), les imitations de micro-ARN (miRs) ou les anti-micro-ARN (anti-miR) dans les adipocytes matures pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN.

Un modèle de culture de cellules adipocytaires pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-ARN sur la fonction des adipocytaires

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Ce protocole permet de manipuler des protéines, ou expression de microARN, dans des adipocytes différenciés pour étudier leur rôle dans la fonction des adipocytes. Cette méthode de transfection inverse est une méthode simple, économique et très efficace pour transfecter des oligonucléotides dans des adipocytes 3T3-L1 de souris. Cette méthode peut également être appliquée aux préadipocytes humains différenciés en adipocytes.La démonstration de la procédure sera faite par Melanie Gaudfrin, une technicienne de notre laboratoire. Cultivez les fibroblastes 3T3-L1 dans des plats de 100 millimètres dans le DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% de sérum de veau nouveau-né et un pour cent de pénicilline et de streptomycine. Placez les plats dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et sept pour cent de dioxyde de carbone.Deux jours après la confluence, changez le milieu de culture, en le remplaçant par du DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% fcS et un pour cent de pénicilline et de streptomycine complétés par 0,25 millimolaire IBMX, 0,25 micromolaire dexaméthasone, cinq microgrammes par millilitre d’insuline et 10 rosiglitazone micromolaires. Incuber les plats pendant deux jours. Deux jours plus tard, remplacez le milieu de culture par du DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% FCS et un pour cent de pénicilline et de streptomycine complétés par cinq microgrammes par millilitre d’insuline et 10 rosiglitazone micromolaires et incuber pendant deux autres jours.Nourrissez les cellules tous les deux jours avec du DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% FCS et un pour cent de pénicilline et de streptomycine et gardez les cellules dans l’incubateur. Un jour ou quelques heures avant la transfection, préparer une solution de collagène de type I à 100 microgrammes par millilitre dans de l’éthanol à 30% à partir d’une solution type à un milligramme par millilitre. Ajouter 250 microlitres de collagène par puits d’une plaque de 12 puits ou 125 microlitres par puits d’une plaque de 24 puits et étaler la solution sur la surface du puits.Laissez la plaque sans couvercle sous la hotte de culture jusqu’à ce que le collagène sèche. Ensuite, lavez-le deux fois avec D-PBS. Pipettez le siRNA avec un milieu essentiel minimum amélioré pour mélanger et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.Ajouter le réactif de transfection et le milieu essentiel minimal amélioré à l’ARNi et à la pipette à mélanger. Incubé pendant 20 minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite le mélange de transfection à chaque puits de la plaque recouverte de collagène.Lavez les cellules dans la boîte de Petri de 100 millimètres deux fois avec D-PBS. Ajoutez 5x trypsine aux cellules, en vous assurant de couvrir toute la surface avec la trypsine. Attendez 30 secondes et retirez soigneusement la trypsine.Incuber la boîte de Petri pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius dans l’incubateur. Ensuite, tapotez le plat pour détacher les cellules, en évitant les dommages cellulaires. Ajouter 10 millilitres de DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% FCS, et un pour cent de pénicilline et de streptomycine pour neutraliser la trypsine.Pipettez soigneusement le milieu de haut en bas pour détacher les cellules et homogénéiser la suspension cellulaire. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Malassez ou d’un compteur cellulaire automatisé et ajustez la concentration des cellules à 0,625 million de cellules par millilitre de milieu. Ensemencez 800 microlitres de la suspension cellulaire par puits d’une plaque de 12 puits ou 400 microlitres de la suspension cellulaire par puits d’une plaque de 24 puits contenant le mélange de transfection.Incuber les plaques dans un incubateur de culture cellulaire et ne pas les déranger pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez soigneusement le surnageant par du DMEM frais sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% fcS et un pour cent de pénicilline et de streptomycine et retournez les cellules à l’incubateur. Les points de temps typiques pour détecter l’argnement de la cible après l’administration de siRNA ou de miR sont de 24 à 48 heures pour l’ARNm et de 48 à 96 heures pour les protéines.Des expériences fonctionnelles peuvent être effectuées sur des adipocytes transfectés, y compris la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la sécrétion d’adipokine, la lipolyse et la lipogenèse. Il a été démontré que les adipocytes préservent leur morphologie après la transfection. Deux jours après la transfection, les adipocytes présentaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires dont la teneur en lipides n’était pas différente entre les adipocytes transfectés et non transfectés.L’expression de l’ARNm de divers marqueurs de différenciation était inchangée dans les cellules transfectées par rapport à celle des adipocytes non transfectés. Le protocole de transfection inverse est efficace car plus de 70% des adipocytes ont été transfectés. Trois jours après la transfection avec siRNA contre La périlipine-1, le niveau d’ARNm de perilipine-1 avait diminué de 70% et le niveau de protéine de 63% L’expression de perilipine-1 a également été analysée par microscopie à fluorescence quatre jours après la transfection et s’est avérée avoir diminué de 92% par rapport à son expression dans les adipocytes témoins.La transfection inverse des adipocytes avec des microARN imitant les oligonucléotides pour réguler à la hausse l’expression de miR-34a est montrée ici. La sur-expression de miR-34a a conduit à la diminution de l’expression de la protéine VAMP2 de 50% L’élimination de la périlipine-1 dans les adipocytes 3T3-L1 a entraîné une augmentation de la lipolyse basale tandis que la sur-expression de miR-34a a conduit à l’inhibition de la phosphorylation de la protéine kinase B induite par l’insuline et de l’absorption du glucose. Il est important d’atteindre un niveau élevé de différenciation des adipocytes pour effectuer la transfection sur les adipocytes nouvellement différenciés et de surveiller attentivement le traitement des adipocytes avec de la trypsine.Après la transfection, il est possible d’effectuer des expériences fonctionnelles sur les adipocytes pour étudier l’impact des protéines ou de la manipulation des microARN sur la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la lipogenèse et la lipolyse.

an-adipocyte-cell-culture-model-to-study-impact-protein-micro-rna

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Le tissu adipeux (AT) peut influencer l’homéostasie de l’ensemble du corps, il est donc important de comprendre les mécanismes moléculaires de la différenciation et de la fonction des adipocytes. Nous fournissons un protocole pour acquérir de nouvelles connaissances sur ces processus en analysant l’homéostasie des adipocytes, la différenciation et l’exposition à l’hypoxie comme modèle de l’apoptose adipocytaire induite.

Mécanisme de règlement des numéros adipocytes dans les organismes adultes grâce à la différenciation et l&#39;apoptose homéostasie

Le tissu adipeux blanc (WAT) a des lacunes critiques dans ses modèles actuels de la culture primaire, qui entravent le développement pharmacologique et études métaboliques. Nous présentons ici un protocole visant à produire un système adipeux microphysiological par WAT intercaler entre deux feuilles de cellules stromales. Cette construction fournit une plateforme stable et adaptable pour la culture primaire de WAT.

Une plate-forme de Microphysiologic pour la graisse humaine : en sandwich le tissu adipeux blanc

La culture d’agrégats d’adipocytes matures de membrane (MAAC) est une nouvelle méthode pour la culture des adipocytes humains mûrs. Ici, nous détaillons comment isoler les adipocytes de l’adipose humain et comment mettre en place MAAC.

Isolement et culture des adipocytes matures humains utilisant les cultures agrégées d’adipocytemûr mûr de membrane (MAAC)

Nous décrivons un système de culture in vitro de matrice-adipocyte extracellulaire humain 3D qui permet la dissection des rôles de la matrice et des adipocytes en contribuant au phénotype métabolique de tissu adipeux.

Un modèle de culture matrix-adipocyte extracellulaire humaine 3D pour étudier matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Ce protocole décrit l’isolement des préadipocytes de souris de la graisse sous-cutanée, leur différenciation en adipocytes matures et l’induction de la résistance à l’insuline. L’action de l’insuline est évaluée par la phosphorylation/activation des membres de la voie de signalisation de l’insuline par transfert Western. Cette méthode permet de déterminer directement la résistance/sensibilité à l’insuline dans les adipocytes primaires.

Adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline

Ce protocole décrit l’isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et obtenir une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase réduit la variation expérimentale et augmente la reproductibilité.

Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire

Ici, nous décrivons un protocole pour isoler, cultiver et phénotyper des cellules endothéliales microvasculaires à partir de tissu adipeux sous-cutané humain (hSATMVECs). De plus, nous décrivons un modèle expérimental de diaphonie hSATMVEC-adipocyte.

Étude de la diaphonie entre les cellules endothéliales adipeuses adipeuses et les adipocytes dans le tissu adipeux sous-cutané humain

La taille et la fragilité des adipocytes matures ont limité les techniques et les outils disponibles pour leur étude et leur isolement. Ici, un protocole est décrit pour l’isolement des adipocytes murins matures, qui peuvent être facilement adaptés à différents dépôts adipeux et régimes alimentaires de souris.

Isolement et culture d’adipocytes murins primaires à partir de souris maigres et obèses

Test de sensibilité visuelle chez les lézards en utilisant un paradigme de conditionnement opérant, qui emploie la lecture vidéo de points aléatoires kinematograms et générés par ordinateur invertébrés.

Test sensibilité visuelle à la vitesse et la direction du mouvement chez les lézards

Générées par ordinateur en utilisant des stimuli du dragon Jacky comme un modèle.

Computer-Generated Stimuli modèle animal

Apprenez la transfection inverse d'oligonucléotides dans les adipocytes 3T3-L1 de souris pour étudier l'expression des protéines et des micro-ARN. Cette méthode efficace permet d'analyser le signal de l'insuline et le transport du glucose.

Un modèle de culture de cellules adipocytaires pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-ARN sur la fonction des adipocytaires (Vidéo) | JoVE Journal

Un modèle de culture de cellules adipocytaires pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-ARN sur la fonction des adipocytaires

Explorer plus de vidéos