Name: Évaluation in vivo de l’autorisation mucociliaire chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie SPECT/CT pour mesurer le clairance mucociliaire chez la souris. Ce protocole reproductible permet d'évaluer l'efficacité des traitements respiratoires in vivo.

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M.Z. et K.S.F. et ce travail ont été soutenus par une subvention accordée dans le cadre du Pitt Innovation Challenge (PInCh), par l’intermédiaire de l’Institut des sciences cliniques et translationnelles de l’Université de Pittsburgh, et de la subvention HL153407 de l’ICLNH R01, décernée à M.Z.

Le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh a approuvé tous les protocoles animaux spécifiés dans cette publication avant d’entreprendre l’une ou l’autre de ces expériences sur les animaux.
REMARQUE : Ce protocole détaille comment effectuer des études in vivo de dégagement mucociliary utilisant l’imagerie de radionucléide avec un scanner SPECT/CT à double modalité. Les techniques démontrées sont l’étalonnage du système, l’anesthésie des souris, l’intubation trachéale des souris, l’instillation de l’isotope dans les poumons, l’imagerie à double modalité, la co-enregistrement de ces images et l’analyse.
1. Configuration du système SPECT/CT
<ol><li>Concevoir un flux de travail approprié et mettre en place avant d’exécuter des expériences à l’aide d’animaux vivants.<ol>
<li>Utilisez une acquisition SPECT composée de 60 projections d’une taille d’étape de 6o entre les projections avec un rayon de rotation de 40 cm. L’acquisition de CT se compose de 220 projections avec un angle de 1,6o entre les projections.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Assurez-vous que le système a les collimateurs MWB corrects pour les souris et l’imagerie SPECT en place. Si les collimateurs inappropriés sont installés, utilisez l’assistant collimateur pour installer les corrects.</li>
	<li>Exécutez les étalonnages système nécessaires pour préparer le système à l’utilisation. REMARQUE : Les composants SPECT et CT du scanner ont besoin d’étalonnage. Calibrez les composants CT à l’aide d’un conditionnement source et d’un étalonnage Dark/Light (D/L) une fois par jour, d’un étalonnage Center Offset (COS) toutes les 2 semaines et évaluez le matériel à rayons X chaque mois. Les composants SPECT doivent être calibrés une fois par an.<ol>
<li>Pour évaluer le matériel à rayons X, cochez la boîte matérielle Evaluate X-ray pendant les étalonnages CT(Menu d’étalonnage CT supplémentaire).</li>
		<li>Pour effectuer le conditionnement source, cochez la boîte de conditionnement source Perform pendant les étalonnages CT(Menu d’étalonnage CT supplémentaire).</li>
		<li>Pour effectuer un étalonnage D/L, cochez la case D/L à côté du protocole d’acquisition CT utilisé lors d’expériences pendant les étalonnages CT. Décochez tous les autres protocoles(Menu d’étalonnage CT supplémentaire).</li>
		<li>Pour effectuer un étalonnage cos, remplacez le lit par l’outil anneau d’étalonnage, ajustez les paramètres de type lit pour correspondre aux paramètres de commande de mouvement et cochez la case COS à côté du protocole d’acquisition de CT utilisé lors d’expériences pendant les étalonnages CT. Décochez tous les autres protocoles(Menu d’étalonnage CT supplémentaire, Anneau d’étalonnage supplémentaire).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Intubation et instillation de souris
<ol><li>Pesez les souris à numériser. Si vous numérisez plusieurs souris, prenez soin de marquer les souris à des fins d’identification en utilisant des méthodes telles que le poinçonnage de l’oreille ou le marquage de la queue.</li>
	<li>Anesthésier une souris à l’aide de 1,5 % d’isoflurane avec un débit de gaz de 2 L/min O2 dans une chambre à gaz pendant ~5 minutes pour produire une anesthésie d’une profondeur suffisante, jusqu’à ce que la respiration ralentit à ~55-65 respirations par minute 16 (figure 1A).</li>
	<li>Retirez la souris de la chambre et suspendez par les incisives avant sur un support d’intubation à une inclinaison de 45 o. Équiper le support d’intubation d’un cône avant pour s’assurer que la souris est anesthésiée pendant l’intubation (Figure 1B).</li>
	<li>Connectez une extrémité d’un fil de fibre optique de 50 μm à une source lumineuse et enfilez une canule de calibre 20 sur elle à l’aide du fil pour servir de guide (Figure 1C).</li>
	<li>Ouvrez la bouche de la souris et tirez la langue vers l’avant à l’aide de forceps contondants. Illuminez le fil du guide et utilisez-le pour visualiser les cordes vocales( Figure 1D).</li>
	<li>Passez le fil de guidage à travers les cordes vocales de sorte que le fil est juste au-delà des cordes vocales et se reposant dans la trachée supérieure. Faites glisser la canule de 1 pouce vers l’avant le long du fil pour intuber la souris, en passant la canule assez profondément pour que le moyeu de celui-ci soit contre les incisives de l’animal (Figure 1E). Retirer le fil en laissant la canule en place.</li>
	<li>Testez l’intubation en branchant brièvement la canule avec un doigt et en vérifiant les changements de respiration. L’arrêt de la respiration ou la respiration tendue lors du branchement et de la respiration accélérée à la libération sont des signes d’intubation trachéale appropriée. S’il n’y a aucun changement dans les modèles respiratoires en branchant la canule, ce dernier est probablement dans l’oesophage.</li>
	<li>Préparer 0,2 mCi de colloïde de 99 mde technétium-soufre(99 mTc-Sc) dans un volume de 10 μL, et pipette dans la canule. Laissez la souris l’inhaler spontanément dans les poumons pendant 1-2 min (Figure 1F). Retirez la canule avant de transférer la souris sur la palette du scanner. REMARQUE : Le radionucléide a été préparé et filtré par Cardinal Health.</li>
</ol>3. Imagerie SPECT/CT
<ol><li>Transférer la souris sur une palette de 25 mm avec un cône avant et fixer avec du ruban adhésif, en prenant soin de ne pas tapisser la poitrine et l’abdomen trop étroitement pour éviter d’altérer la respiration. Prenez soin d’enlever les étiquettes d’oreille métalliques attachées à la souris.</li>
	<li>Préparez un fantôme radioactif composé de 0,05 mCi en 200 μL et placez cette quantité dans un tube PCR de 0,2 mL. Placez le tube en tapant sur la palette sous le bas-ventre de la souris, en évitant le chevauchement avec les poumons. REMARQUE : Le fantôme est utilisé dans le but de co-enregistrer des images CT et SPECT, ainsi qu’un contrôle négatif pour l’autorisation.</li>
	<li>Insérez la souris dans le système SPECT/CT, sélectionnez le workflow d’imagerie et exécutez Setup.</li>
	<li>Configurez le positionnement des détecteurs sur la souris et exécutez le flux de travail d’imagerie.</li>
	<li>Préparez une cage pour les souris qui ont reçu de la radioactivité après la procédure, avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau, et un étiquetage clair à l’aide d’un autocollant de sécurité radiologique.</li>
	<li>À la fin du flux de travail, retirez la souris de la palette d’imagerie et laissez-la récupérer dans la cage préparée pendant une durée de 6 heures entre les scans (fin de l’analyse 1 au début de l’analyse 2) avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. 6 h a été choisi car il correspond à la période pendant laquelle le dégagement linéaire selon la fonction des cils a lieu avec très peu de dégagement alvéolaire.</li>
	<li>Après 6 heures, anesthésier à nouveau la souris et numériser, avec le fantôme, en utilisant le même flux de travail pour mesurer la quantité d’isotope dégagée des voies respiratoires. REMARQUE: Il est essentiel de permettre à la souris de récupérer comme anesthésie ininterrompue avec isoflurane pendant 6 heures conduira à un effet cils-dépresseur significatif, résultant en des dégagements mucociliary près de zéro.</li>
</ol>4. Analyse
<ol><li>Après l’imagerie, effectuez le post-traitement pour reconstruire des images complètes de pile 3D.<ol>
<li>Histogramme les images SPECT en utilisant les paramètres standard de l’usine pour 99mTc, puis reconstruire à l’aide d’un algorithme MAP3D et la fonction de propagation de points (PSF) reconstruction. REMARQUE : La reconstruction a été effectuée à l’aide de 8 itérations et de 6 sous-ensembles. Une reconstruction efficace nécessite un rapport de sous-ensembles aux projections à 1:10 ou diviser uniformément en nombre de projections, de sorte que 6 sous-ensembles ont été utilisés en raison de l’acquisition à l’aide de 60 projections.</li>
		<li>Reconstruisez les images CT à l’aide de l’algorithme Feldkamp et d’un filtre Shepp-Logan. REMARQUE : La reconstruction a été effectuée à l’aide de 4 itérations.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Traiter les images CT et SPECT dans FIJI ImageJ21 à l’aide de l’outil de reslice pour générer des images de vue coronale à partir des images axiale par défaut. Effectuez ensuite une projection de somme z-stack sur l’image SPECT pour ajouter les données de comptage de chaque tranche et générer une seule image pour faciliter l’analyse.</li>
	<li>Resize et co-enregistrer les images CT et SPECT en utilisant le tube fantôme d’Eppendorf comme référence (Figure 2A,B). Suivez et utilisez des mesures de resize cohérentes sur tous les échantillons.</li>
	<li>Binarize l’image CT en utilisant le seuil automatique, suivie par l’inversion de la pile, et l’exécution d’une projection de somme z-stack pour générer un contour des poumons pour analyse (Figure 2C).</li>
	<li>Faites pivoter les images CT et SPECT et fusionnez l’image à l’aide des outils du canal. Calculez mcc en tirant un retour sur investissement autour du poumon droit et en mesurant( Figure 2D). REMARQUE: Cette mesure sera du nombre total dans le poumon droit pour les points de temps de 0 et 6 heures, avec les images de 6 heures corrigées pour la désintégration radioactive en utilisant la formule: N(t) = N0e−t. 99m (99m) Tc-Sc a une constante de décomposition de 3,21e−5 par seconde avec une demi-vie d’environ 6 heures. Ces valeurs peuvent ensuite être utilisées pour calculer une autorisation en pourcentage. REMARQUE : Le poumon droit est choisi pour le dessin et la mesure du retour sur investissement, car le dégagement mucociliaire transportera la radioisotope hors des poumons jusqu’au pharynx d’où elle sera avalée et se retrouvera dans l’estomac. Assez fréquemment, les comptes peuvent être vus dans l’estomac qui peuvent se chevaucher avec le poumon gauche et donc produire des comptes erronés. Cette confusion peut être évitée en mesurant les comptes dans le poumon droit seulement.</li>
</ol>

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</ol>

Aucun n’était lié à ce travail.

Le rôle des cils respiratoires motiles dans la maladie et le développement continue d’évoluer et d’être mieux apprécié. Les battements synchrones et métaclronaux de cils motiles multiples à la surface apique des cellules tapissant l’arbre trachéobronchial génèrent le flux de céphalad produisant le dégagement mucociliary ou MCC. McC est compromise dans les ciliopathies comme PCD22, maladies acquises comme la MPOC18, et son importance est reconnue dans les CHDs, pas traditionnellement considéré comme ciliopathies. Les données récentes ont montré le dysfonctionnement ciliaire respiratoire dans chd avec l’hétérotaxie23 et sans hétérotaxie7. Un tel dysfonctionnement motile de cils s’est traduit par de plus grandssymptômes respiratoires 9 aussi bien qu’une plus grande morbidité postopératoire8. La plupart, sinon la toute, de ces maladies, ont des modèles muraux disponibles et notre protocole pour mesurer le MCC chez la souris est un outil précieux qui peut être utilisé pour tester des thérapeutiques potentielles.
Les modèles animaux offrent une utilité pour comprendre les maladies et le développement de thérapies. L’imagerie animale in vivo offre une utilité supplémentaire avec la possibilité d’acquérir plusieurs points de données auprès des mêmes animaux, sans avoir besoin de sacrifier les animaux, permettant aux chercheurs de suivre le cours longitudinal de la maladie ainsi que la durée de l’étude des effets du traitement. Le modèle murin du MCC a été développé au cours des décennies par plusieurs chercheurs, d’abord exécuté sur des chiens beagle utilisant la scintigraphie planaire, une technique d’imagerie nucléaire bidimensionnelle24. La technique a été adaptée pour une utilisation chez la souris une décennie plus tard, suivie d’une adaptation à l’imagerie SPECTune décennie après que 25,26. Le développement de cette technique dans les modèles muraux a été un développement majeur dans la pertinence de cette technique, en raison de la disponibilité de plusieurs modèles muraux de maladies humaines comme la PCD dans laquelle la fonction ciliaire est considérablement modifiée. McC a été évalué dans des modèles muraux de dénervation pulmonaire et d’immunosuppression, et a le potentiel d’être utilisé en conjonction avecd’autres modèles 19,26. Des études de mesure de MCC dans les patients humains présentant des maladies de voie aérienne telles que CF, asthme, PCD, et ciliopathies liées à CHD ont été conduites, et ont donné des résultats que la technique peut aider des études de physiologie pulmonaire et d’efficacité thérapeutique13.
Une partie importante de ce protocole est la mise en place d’acquisitions avec les paramètres d’imagerie corrects pour acquérir des images précises pour la quantification. Un certain nombre de facteurs sont essentiels lors de la conception des paramètres d’acquisition SPECT, y compris les collimateurs utilisés, le nombre de projections à acquérir par révolution et la taille de l’étape de rotation. La sélection des collimateurs est un facteur important dans la sensibilité et la résolution de l’acquisition, et les paramètres d’acquisition peuvent devoir être adaptés au collimateurutilisé 27. Alternativement, lors de l’utilisation de plus gros animaux comme les rats, les collimateurs devraient être ajustés. Plusieurs collimateurs de trous d’épingle par exemple sont plus sensibles, mais il faut prendre soin de choisir une taille d’étape afin d’éviter les projections qui se chevauchent et de provoquer un multiplexage non nécessaire, ce qui peut encore augmenter la sensibilité de l’acquisition au détriment d’une certaine ambiguïté d’image qui peut causer des artefacts de reconstruction25. La configuration de reconstruction est également essentielle pour générer des images quantifiables. MAP3D est un algorithme de reconstruction itératif couramment utilisé, et PSF est un modèle de reconstruction commun. Les deux sont fiables pour reconstruire des images, mais il faut prendre soin de définir le nombre d’itérations et de sous-ensembles. Un plus grand nombre d’itérations augmentera le temps de calcul requis pour la reconstruction, et augmentera la qualité de la reconstruction avec des rendements décroissants à la suite d’une nouvelle augmentation.
Afin de quantifier les images dans ImageJ, l’outil de mesure idéal à utiliser est RawIntDen, qui produit la valeur de somme des pixels dans une sélection. Lors de la quantification des données SPECT sur des IA pulmonaires de taille différente, l’utilisation de RawIntDen fournit une mesure absolue des dénombrements et évite d’ajuster la mesure à la zone du retour sur investissement, comme la mesure moyennele ferait 21.
Cette technique a un certain nombre de sources d’erreur associées que l’enquêteur devrait connaître lors de l’application de cette technique. Une confusion notable est l’utilisation d’agents anesthésiques. L’isoflurane est un anesthésique inhalé à action rapide dont les souris se rétablissent rapidement après l’achèvement d’une acquisition. Cependant, il faut prendre soin de donner aux souris suffisamment de temps pour récupérer dans leurs cages, et ne pas rester anesthésié plus longtemps que nécessaire. Dans notre expérience personnelle (données non publiées), les souris qui ont été gardées anesthésiées en permanence à l’aide d’isoflurane inhalé entre le point de temps de 0 et 6 heures ont montré un dégagement négligeable. De même, une dose contrôlée d’anesthésie est également nécessaire pour assurer un rétablissement rapide. Lors de la fixation de l’animal à la palette pour l’imagerie, le tube fantôme utilisé pour le co-enregistrement doit être maintenu bas sur le ventre pour éviter que les artefacts ne se chevauchent avec les poumons. De même, pour assurer une image CT de qualité, prenez soin d’enlever toutes les étiquettes métalliques de la souris pour éviter les artefacts de la diffusion aux rayons X.
Le protocole MCC actuel peut être appliqué à une myriade de modèles animaux. Cette technique a un effet négligeable sur la santé de l’animal scanné, est bien tolérée par les souris, et pour cette raison, elle peut être utilisée avec des modèles de maladies sans risquer la santé de souris déjà délicates. La force de cette méthodologie vient d’elle étant une technique in vivo, qui permet l’acquisition de mesures cohérentes et reproductibles de la fonction des voies respiratoires sans le sacrifice des animaux pour exciser les trachées pour la vidéo-microscopie, que les modèles ex vivonécessitent 26. La cohérence de cette technique dans la production de mesures reproductibles sur plusieurs scans d’un même animal permet au même animal d’être traité avec des agents différents ou des thérapeutiques potentielles, et des comparaisons statistiques faites entre le même animal pour réduire la variabilité biologique inhérente à tout modèle animal, réduisant ainsi la taille de l’échantillon nécessaire pour montrer des différences statistiquement significatives.
L’évaluation de la fonction des voies respiratoires à l’aide de la technique mcc peut être ajustée à une variété de modèles animaux et appliquée à de nombreux modèles différents de santé des voies respiratoires, ainsi que l’essai de nouvelles thérapies. Les voies respiratoires des modèles muraux de PCD peuvent être évaluées à l’aide de cette technique, ainsi que des modèles de MPOC. Notre méthode peut également être utilisée pour étudier les effets différentiels de divers anesthésiques sur mcc qui sont en usage clinique commun. Enfin, les effets des agents thérapeutiques sur les voies respiratoires peuvent également être évalués à l’aide de ce modèle. Comme indiqué précédemment, mais porte la répétition, car il s’agit d’une mesure in vivo, il permet de répéter les évaluations mcc au cours d’une maladie, ainsi que les avantages de test des interventions thérapeutiques au fil du temps. En outre, les souris sont les animaux de laboratoire les plus couramment utilisés pour imiter/étudier les maladies humaines, avec, dans certains cas, plusieurs modèles transgéniques de souris de maladies humaines disponibles à choisir.

Les cils sont des organites cellulaires à base de microtubules conservés dans toute l’histoire de l’évolution, des algues aux humains. Ils émanent des surfaces cellulaires et ont un certain nombrede fonctions 1, allant de la reconnaissance des signaux sensoriels environnementaux locaux à la motilité, fonctions qui peuvent être retracées de l’homme aux premiers organismes eucaryotes unicellulaires2,3. Les cils peuvent être non motiles et servir d’antenne spécialisée d’une cellule pour traiter les signaux environnementaux; ou motile et multiple, battant en ondes métaclronales synchronisées pour générer un flux fluide, comme dans la paroi des trompes de Fallope et des voies respiratoires supérieures et inférieures, à l’exception des bronchioles terminales menant aux alvéoles1,2.
La vaste surface épithéliale des voies respiratoires est exposée à un barrage constant de contamination sous la forme d’une variété de polluants et d’agents pathogènes inhalés potentiellement dangereux, nécessitant une défense. Un mécanisme de défense clé est l’appareil mucociliaire de l’arbre trachéobronchial, où un flux continu de mucus sécrété est mécaniquement transporté hors des voies respiratoires par le battement des cils motiles multiples tapissant les surfaces apical des cellules épithéliales trachéo-bronchiques. Ceux-ci fonctionnent pour piéger les contaminants inhalés, et par leur battement continu et synchrone, les transportent cephalad4,5.
Il a été démontré que les cils ont des rôles clés tels que dans le développement du modelage gauche-droite dans le développement d’embryons, où les cils motiles à la symétrie embryonnaire de rupturede nœud 6. Les mutations dans les gènes liés aux cils ont été liées à des maladies telles que les maladies cardiaques congénitales (CHD) dues à la structure asymétrique ducœur 6. Des études récentes ont rapporté une incidence élevée de dysfonctionnement ciliaire dans les voies respiratoires des patients atteints de CHD, ainsi qu’une prévalence accrue de complications respiratoires postopératoires et de symptômes chroniques des voies respiratoires dans les voies respiratoiressupérieures et inférieures 7,8,9,10. Il a été démontré que les patients atteints de CHD et de dysfonction ciliaire, avec ou sans hétérotaxie, avaient un risque accru de complications respiratoires et de résultats respiratoires négatifspostopératoirement 5,8,10. Au-delà de leur rôle dans la signalisation et le développement, l’importance des cils des voies respiratoires a été démontrée par des ciliopathies, dont un excellent exemple est la dyskinésie ciliaire primaire (PCD). La PCD est un désordre congénital résultant d’un certain nombre de mutations affectant les cils respiratoires motiles, menant aux infections pulmonaires récurrentes, à la bronchiectasie, et potentiellement au besoin de transplantation pulmonaire11. En outre, même si les cils sont normaux dans la fibrose kystique (CF), désordre congénital le plus commun dans la population caucasienne, MCC est altéré dû au mucus épais et visqueux résultant des mutations dans le gène de CFTR12. Il existe plusieurs modèles muraux de PCD et de CF, ainsi qu’un nombre sans cesse croissant de modèles de CHD. En fin de compte, les cils sont des structures polyvalentes avec de nombreux rôles clés, et une méthode pour évaluer la fonction des cils respiratoires motiles in vivo peut être utile pour l’étude préclinique, et l’évaluation des effets des mutations ainsi que des médicaments sur le dégagement mucociliaire (MCC)13. La méthode serait également utile pour évaluer les effets de nouveaux médicaments, thérapie génique ou interventions sur mcc dans ces modèles de souris.
Il existe de nombreux modèles différents qui ont été utilisés pour évaluer mcc. Une méthode notable implique l’utilisation du colorant bleu méthylène qui a été inculqué dans la bronche, avec dégagement mesuré par mesure fibreoptique du mouvement decolorant 14. Cette méthode est limitée par la capacité d’observer le mouvement du colorant, qui est plus routinier chez l’homme que dans les modèles précliniques de souris. Une autre méthode notable est l’imagerie par rayons X à contraste de phase synchrotron (PCXI), qui peut être utilisée pour suivre les particules individuelles dans les voies respiratoires. Cette méthode est relativement nouvelle et peu accessible15. Il existe de nombreuses méthodes ex vivo d’évaluation des voies respiratoires en excisant une trachée pour la vidéo-microscopie, mais ces modèles fournissent peu d’utilité chez les patients humains16. Les techniques de haute résolution pour l’imagerie cils telles que la tomographie par cohérence optique sont limitées de la mêmemanière 17.
Dans cet article, nous présentons une méthode reproductible pour mesurer mcc in vivo qui a été employé pour mesurer des dégagements de poumon dans une myriade de modèles animaux, aussi bien qu’étudier MCC dans la maladie pulmonaire obstructive chronique et évaluer les effets des drogues immunosuppressrices18,19. Cette méthode suit le dégagement du colloïde radiopharmaceutique de 99mtechnétium-soufre(99mTc-Sc), un radiotraceur de particules insolubles, après instillation dans les poumons. Le radionucléide peut ensuite être suivi à l’aide d’une tomographie calculée par émission de photons (SPECT)18,20. Nous avons encore affiné cette technique pour mesurer mcc en utilisant la double modalité SPECT et la tomographie calculée (CT) imagerie avec co-localisation des comptes de radioisotope pour les poumons et de mesurer la diminution de ces comptes sur 6 heures. L’imagerie à double modalité, avec co-enregistrement des images CT et SPECT, permet une localisation précise du nombre de radiations dans notre région d’intérêt, les poumons. Bien que nous décrivions en détail la méthode de mesure du MCC chez la souris, le protocole peut être ajusté pour étudier le MCC chez les rats. Les collimateurs devraient être ajustés ainsi que la dose de rayonnement. À notre avis, les balayages de MCC de souris sont plus techniquement provocants en raison de la petite taille animale, mais plus utiles que des rats en raison du grand nombre de modèles établis de souris d’un certain nombre de désordres humains. De plus, en raison de leur coût et de leur coût d’entretien plus faibles dans les colonies animales, une plus grande taille d’échantillon est plus réalisable chez la souris.

<table><tbody><tr><td>500 et micro ; m Fil de fibre optique sans gaine</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Vaporizer</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Logiciel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan Cathéters de sécurité 20G 1inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>118-2097</td><td></td>Support d’intubation</tr> pour <tr><td>souris</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Channel Anesthesia Stand</td> Summit <td>Anesthesia Solutions</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation in vivo de l’autorisation mucociliaire chez la souris

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

Les cils motiles respiratoires, organites spécialisés de la cellule, tapissent la surface apical des cellules épithéliales tapissant les voies respiratoires. En battant de façon métachronique et synchrone, ces organites multiples, motiles et à base d’actine génèrent un flux de liquide céphaladien dégageant les voies respiratoires des polluants inhalés et des agents pathogènes. Avec l’augmentation de la pollution de l’environnement, les nouveaux agents pathogènes viraux et les bactéries multirésistantes émergentes, le dégagement mucociliaire généré par les cils est essentiel au maintien de la santé pulmonaire. McC est également déprimé dans les désordres congénitaux multiples comme la dyskinésie ciliaire primaire, la fibrose kystique aussi bien que les désordres acquis comme la maladie pulmonaire obstructive chronique. Tous ces troubles ont établi, dans certains cas, plusieurs modèles muraux. Dans cette publication, nous détaillons une méthode utilisant une petite quantité de radioactivité et d’imagerie SPECT/CT à double modalité pour mesurer avec précision et reproductibilité mcc chez la souris in vivo. La méthode permet la récupération des souris après l’imagerie, rendant les mesures en série possibles, et testant les thérapeutiques potentielles longitudinellement au fil du temps. Les données sur les souris de type sauvage démontrent la reproductibilité de la mesure mcc tant qu’une attention adéquate aux détails est accordée, et que le protocole est strictement respecté.

En utilisant ce protocole, nous avons anesthésié des souris dans une chambre isoflurane( Figure 1A). Après avoir atteint un niveau adéquat d’anesthésie, les souris ont été placées sur des supports verticaux (figure 1B) et les cordes vocales ont été visualisées à l’aide d’un fil guide lumineux (figure 1C-1D). Les souris ont été intubées et inculquées avec 0,2 mCi 99mTc-Sc en volumes de 10 μL à travers une canule et les souris autorisées à inhaler spontanément dans les poumons (Figure 1E-1F). Après l’acquisition et le traitement d’images, les images CT et SPECT ont été colocalisées (Figure 2A) en utilisant le tube fantôme comme point de repère (Figure 2B). Les masques des poumons ont été générés à partir de l’image CT (Figure 2C) et utilisés pour dessiner des IA autour du poumon droit pour analyse à 0 (Figure 2D) et 6 heures (Figure 2E-2F). Pour tester la reproductibilité du protocole, un total de 8 souris ont été numérisées deux fois à des jours différents avec des conditions expérimentales identiques, l’analyse utilisant un t-test apparié ne montrant aucune différence significative entre les balayages répétés (p-value=0,9904) (Figure 3A). Deux autres souris ont été numérisées trois fois à des jours différents avec des conditions expérimentales identiques, l’analyse utilisant anova uni-sens montrant l’appariement significatif entre les balayages répétés (p-valeur de 0.0041) (figure 3B). Au total, 8 souris ont été numérisées et deux images représentatives ont été affichées( figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> Figure 1 : Intubation de souris et instillation d’isotopes. Images des étapes nécessaires pour intuber et inculquer l’isotope dans les voies respiratoires. R)La souris est anesthésiée dans une chambre. B) La souris anesthésiée est placée sur un support vertical, suspendu par les incisives avant. C) Un fil de fibre optique illuminé de 0,5 mm servant de fil de guidage est préparé en le faisant passer à travers une canule de 20 G. D)La bouche de la souris est ouverte à l’aide de forceps et éclairée à l’aide du fil de guidage éclairé pour visualiser les cordes vocales. E) La canule est poussée à travers les cordes vocales et guidewire est enlevé. F)L’isotope soluble est inculqué à la canule à l’aide d’une pipette et la souris est autorisée à inhaler spontanément l’isotope dans les poumons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> Figure 2 : Images SPECT/CT d’un scan MCC. A) Une image SPECT qui a été co-localisée avec une image CT. B) Une image CT avec un tube fantôme visible qui a été utilisé pour la co-localisation. C) Un masque des voies respiratoires dérivé en binarisant l’image CT et en effectuant une projection de somme z-stack. D) Le masque CT co-localisé avec l’image SPECT. Un retour sur investissement pour l’analyse a été dessiné autour du poumon droit. E) Un masque des voies respiratoires à 6 heures. F) Une image co-localisée CT et SPECT des voies respiratoires à 6 heures avec un retour sur investissement pour analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> Figure 3 : Mesures de dégagement des mêmes souris sur plusieurs scans. A) Deux dégagements répétés individuels ont été mesurés pour 8 souris sans changement dans des conditions expérimentales. Un test t apparié a montré qu’il n’y avait pas de différence significative entre les balayages répétés avec une valeur p de 0,9904. B) Trois dégagements répétés individuels ont été mesurés pour deux souris sans changement dans des conditions expérimentales. Un ANOVA uni-sens a montré qu’il y avait correspondance significative entre les balayages répétés avec une valeur p de 0,0041. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> Figure 4 : Images co-localisées de SPECT/CT des voies respiratoires de 0 et 6 heures chez 2 souris avec des IDR dessinés à 0 et 6 heures décrivant le poumon droit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Figure supplémentaire 1 : Une vidéo des cordes vocales éclairée par un fil de fibre optique avec l’effet de la respiration visualisée. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.</a>
Fichiers supplémentaires. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces fichiers.</a>

Dans cette publication, nous décrivons des protocoles pour évaluer le dégagement mucociliary de voie aérienne (MCC) chez les souris in vivo utilisant la formation image de radionucléide de double modalité. Ce protocole est conçu pour une seule tomographie calculée par émission de photons (SPECT) et un protocole d’acquisition de tomographie calculée (CT) à l’aide de collimateurs de corps entier de souris (MWB) dans un système spect/CT double.

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

Notre protocole permet de mesurer avec précision la clairance mucociliaire dans un modèle animal à l’aide de radionucléides suivis par SPECT à double modalité et imagerie CT pour localiser et mesurer avec précision le dégagement des voies respiratoires. Cette technique est une méthode reproductible de mesure de la CMC qui peut être appliquée à différents modèles d’animaux et de maladies grâce à l’utilisation de la double SPECT/CT. Après avoir confirmé une absence de réponse au réflexe de pédale, équipez le support d’un cône nasal pour maintenir l’anesthésie et suspendez la souris anesthésiée par les incisives avant sur un support d’intubation à un angle de 45 degrés.Connecte une extrémité d’un fil de fibre optique de 50 microns à une source lumineuse et enfile une canule de calibre 20 sur le fil. À l’aide d’une pince émoussée, tirez la langue et illuminez le fil-guide pour visualiser les cordes vocales. Passez le fil-guide à travers les cordes vocales de sorte que le fil soit juste au-delà des cordes vocales reposant dans la trachée supérieure et faites glisser la canule d’un pouce vers l’avant le long du fil jusqu’à ce qu’elle soit suffisamment profonde pour que le moyeu soit contre les incisives de l’animal.Retirez le fil tout en laissant la canule en place et utilisez un doigt pour boucher brièvement la canule afin de vérifier s’il y a des changements dans la respiration. Ajoutez ensuite 10 microlitres de colloïde de soufre de technétium de 99 m fraîchement préparé dans la canule et laissez la souris inhaler spontanément le radionucléide dans les poumons sur une période d’une à deux minutes. Pour l’imagerie SPECT/CT, après avoir retiré la canule, utilisez du ruban adhésif pour fixer la souris à une palette de 25 millimètres avec un cône nasal et collez un tube PCR de 200 microlitres contenant 0,05 millicurie de fantôme radioactif sous le bas-ventre de la souris sous les poumons.Placez la souris dans le système SPECT/CT. Sélectionnez le flux de création d’images et cliquez sur Configurer. Configurez le positionnement des détecteurs sur la souris et exécutez le flux de travail d’imagerie.Une fois le flux de travail terminé, transférez la souris dans une nouvelle cage avec surveillance et accès illimité à la nourriture et à l’eau et à l’autocollant de sécurité contre les radiations pendant six heures entre les scans. Après l’imagerie, histogrammez les images SPECT en utilisant les paramètres standard d’usine pour le colloïde technétium-soufre de 99 m et utilisez un algorithme MAP3D et la reconstruction de la fonction d’étalement de point pour reconstruire les images d’empilement 3D. Reconstruisez les images CT à l’aide de l’algorithme de Feldkamp et d’un filtre Shepp-Logan et ouvrez les images CT et SPECT dans FIJI.Utilisez l’outil de redistribution pour générer des images de vue coronale à partir des images axiales par défaut et effectuez une projection de somme z-stack sur l’image SPECT pour ajouter les données de comptage de chaque tranche. Générez une seule image pour faciliter l’analyse. Et en utilisant le tube Phantom Eppendorf comme référence, redimensionnez et co-enregistrez les images CT et SPECT.Utilisez le seuillage automatique pour binariser l’image CT, inverser la pile et effectuer une projection de somme z-stack pour générer un contour des poumons à analyser. Faites pivoter les images CT et SPECT et utilisez les outils de canal pour les fusionner en une seule image. Dessinez ensuite une région d’intérêt autour du poumon droit pour déterminer la clairance mucociliaire.Après l’acquisition et le traitement de l’image, les images CT et SPECT peuvent être co-localisées en utilisant le tube fantôme comme point de repère. Des masques des poumons peuvent être générés à partir de l’image CT et utilisés pour dessiner des régions d’intérêt autour du poumon pour leur analyse à différents points temporels. Dans cette analyse, un total de huit souris ont été scannées deux fois à des jours différents dans des conditions expérimentales identiques pour tester la reproductibilité du protocole.L’analyse du test T apparié n’a montré aucune différence significative entre les balayages répétés. Deux autres souris ont également été scannées trois fois à des jours différents dans des conditions expérimentales identiques. L’analyse ANOVA à sens unique a montré une correspondance significative entre les balayages répétés.Ici, des images représentatives de deux des souris scannées peuvent être observées. Il est essentiel de pouvoir visualiser les voies respiratoires. Et pour vérifier que l’intubation est réussie, si nécessaire, retirez la canule et réintubez pour éviter une intubation œsophagienne erronée.Ce protocole peut être appliqué à des modèles de maladies afin d’évaluer les effets de différents médicaments sur les dégagements des voies respiratoires et de contribuer au développement de nouveaux traitements médicamenteux.

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