Name: Immersion alternative dans le glucose pour produire une hyperglycémie prolongée chez le poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Découvrez une méthode non invasive pour induire une hyperglycémie prolongée chez Danio rerio en alternant glucose et mannitol. Ce protocole permet d'étudier les complications rétiniennes et physiologiques liées au diabète de type 2.

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Nous tenons à remercier VPC, CJR et MCP pour le développement de ce protocole. EMM a reçu un soutien financier de l’American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support pour mener à bien cette recherche. Ce travail a également été soutenu par un prix Mellon de la faculté de l’Université américaine et un financement par l’American University College of Arts and Sciences (tous deux à VPC).

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’American University.
1. Préparation des réservoirs de solution
<ol><li>Obtenir six réservoirs, deux pour chaque groupe expérimental (glucose, mannitol et eau). Étiquetez l’un des deux réservoirs « réservoir de logement » (il abritera le poisson) et étiquetez l’autre « réservoir de solution » (il contiendra la solution). REMARQUE: Le groupe de traitement mannitol est le contrôle osmotique, et le groupe de traitement de l’eau est un groupe de manipulation / stress. Il est important de garder les réservoirs, les compagnies aériennes / pierres à air, les couvercles et les fournitures de nettoyage séparés pour chaque groupe de traitement</li>
	<li>Utilisez un réservoir de 2 L si le nombre total de poissons utilisés est inférieur à 20. Utilisez un réservoir de 4 L si le nombre total de poissons utilisés est supérieur à 20. NOTA : Utilisez un N de 5 à 10 par groupe de traitement et par point de temps d’échantillonnage.</li>
	<li>Gardez les réservoirs dans un bain-marie à 28-29 °C pour maintenir la température de l’eau.</li>
	<li>Le jour 1, placez les poissons dans leurs solutions de traitement respectives (glucose, mannitol, eau) pendant 24 heures (« Water to Treatment »). Le jour 2, transférer les poissons de leurs solutions de traitement à l’eau pendant 24 heures (« Traitement à l’eau »). Le jour 3, transférer le poisson de l’eau vers des solutions de traitement (« Eau à traitement »). Cette exposition alternée se poursuit pour le reste de l’expérience (Figure 1). Transférer quotidiennement des poissons témoins traités à l’eau de l’eau à l’eau.</li>
	<li>Assurez-vous que les poissons sont nourris et transférés dans la même fenêtre de 2 heures chaque jour pendant toute la durée de l’expérience.</li>
</ol>2. Préparation du poisson
<ol><li>Utilisez le poisson zèbre adulte (4 mois – 1 an)5.</li>
	<li>Nourrissez les flocons de Tetramin au sol tous les jours à votre arrivée au laboratoire.</li>
	<li>Notez le pH et la température de tous les réservoirs et notez l’état général du poisson.</li>
</ol>3. Transfert de poisson
<ol><li>Transférer les poissons de chaque groupe de traitement du réservoir de logement au réservoir de solution correspondant à l’aide d’un filet à poisson standard.</li>
	<li>Replacez le réservoir contenant le poisson dans le bain-marie, remplacez la pierre à air et le couvercle du réservoir. Ce réservoir est maintenant le « réservoir de logement » et le réservoir qui contenait auparavant le poisson est maintenant le « réservoir de solution ».</li>
	<li>Jetez l’ancienne solution et nettoyez le réservoir, ainsi que les couvercles du réservoir, les compagnies aériennes, les pierres à air et les filets pour éviter l’accumulation de glucose et de mannitol. REMARQUE: Ne pas laver les articles avec du savon. Utilisez de l’eau et une brosse/éponge de gommage dédiée pour chaque condition de traitement afin de nettoyer correctement les réservoirs.</li>
	<li>Séchez les « réservoirs de solution » nouvellement nettoyés avec une serviette en papier. Préparez les solutions pour le lendemain en utilisant ce réservoir. Assurez-vous que les autres articles sont séchés et séparés par des groupes de traitement appropriés. REMARQUE : Tenez un registre des solutions que les poissons sont transférés chaque jour, ainsi que des solutions préparées pour le lendemain. Par exemple : Poisson transféré du glucose àH2O,nouvelle solution de glucose à 1% préparée pour demain.</li>
</ol>4. Préparation de la solution post-transfert
<ol><li>Préparation de solutions de sucre<ol>
<li>Remplissez chaque réservoir de solution avec 2 L (ou 4 L) d’eau du système (l’eau du système est définie comme de l’eau qui a été traitée avec le bon rapport de solution saline et qui est à la même température que les réservoirs de stock et de traitement).</li>
		<li>Mesurez la quantité correcte de glucose et de mannitol (voir l’étape 5 ci-dessous) à l’aide d’une balance de chargement supérieure et de bateaux de pesage séparés pour chaque produit chimique.</li>
		<li>Ajouter la partie aliquote de glucose ou de mannitol pesée au réservoir de solution nettoyé approprié, qui ne contient que de l’eau du système.</li>
		<li>Agiter les solutions de glucose et de mannitol avec des tiges de verre séparées jusqu’à ce que les sucres soient complètement dissous.</li>
		<li>Retournez les réservoirs de solution au bain-marie et couvrez-les de leurs couvercles correspondants.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de solutions d’eau<ol>
<li>Remplissez les réservoirs expérimentaux (2 L ou 4 L) avec de l’eau système.</li>
		<li>Retournez ces « réservoirs de solution » au bain-marie et recouvrez-les de leurs couvercles correspondants.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Évolution des pourcentages
<ol><li>Maintenir le poisson dans une solution à 1% pendant les 2 premières semaines de traitement: 40 g de glucose ou de mannitol dans un réservoir de 4 L.</li>
	<li>Maintenir le poisson dans une solution à 2% pendant les semaines 3 et 4 du traitement: 80 g de glucose ou de mannitol dans un réservoir de 4 L.</li>
	<li>Maintenir le poisson dans une solution à 3% pendant les 4 dernières semaines de traitement: 120 g de glucose ou de mannitol dans un réservoir de 4 L.</li>
</ol>6. Mesurer la glycémie et recueillir les tissus
<ol><li>Anesthésier le poisson 2 à la fois dans une solution de tricaine à 0,02%.</li>
	<li>Décapiter le poisson directement derrière les branchies à l’aide d’une lame de rasoir.</li>
	<li>Mesurer la valeur de la glycémie. REMARQUE: Nous utilisons un lecteur de glycémie (par exemple, Freestyle Lite) pour mesurer la glycémie et placer la bandelette de test directement sur le cœur exposé (échantillon de sang cardiaque).</li>
	<li>Disséquer le tissu recherché du poisson (cerveau, muscle, etc.).</li>
	<li>Entreposer les tissus recueillis en les congelant instantanément sur de la glace carbonique et en les stockant dans un congélateur à -80 °C, en les fixant dans du paraformaldéhyde à 4 % ou en les plaçant dans une solution tampon pour une utilisation immédiate.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le diabète est un problème national. Des études montrent que d’ici 2030, on estime que 400 millions de personnes auront une forme ou une autre de diabète. Dans les modèles de rongeurs, le DM de type 2 est étudié à l’aide de manipulations génétiques. Chez les rats, les rats gras diabétiques zucker (ZDF), et les rats gras Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), fournissent plus d’informations sur les effets du type 2 DM10. En outre, des régimes riches en graisses ont été utilisés chez les rongeurs pour...

Le poisson zèbre (Danio rerio) devient rapidement un modèle animal largement utilisé pour étudier à la fois la maladie et la cognition1. La facilité de la manipulation génétique et la transparence embryonnaire à travers les premiers stades de développement, en font un candidat de choix pour étudier les maladies humaines avec une base génétique connue. Par exemple, le poisson zèbre a été utilisé pour étudier le syndrome de Holt-Oram, les cardiomyopathies, les maladies rénales glomérulokystiques, la dystrophie musculaire et le diabète sucré (DM) parmi d’autres maladies1. De plus, le modèle du poisson zèbre est idéal en raison de la petite taille de l’espèce, de sa facilité d’entretien et de sa fécondité élevée2,3.
Le pancréas du poisson zèbre est à la fois anatomiquement et fonctionnellement similaire au pancréas des mammifères4. Ainsi, les caractéristiques uniques de taille, de fécondité élevée et de structures endocriniennes similaires font du poisson zèbre un candidat approprié pour étudier les complications liées au DM. Chez le poisson zèbre, il existe deux méthodes expérimentales utilisées pour induire l’hyperglycémie prolongée qui est caractéristique du DM : un afflux de glucose (modélisation de type 2) et l’arrêt de la sécrétion d’insuline (modélisation de type 1)5,6. Expérimentalement, pour arrêter la sécrétion d’insuline, les cellules β pancréatiques peuvent être détruites chimiquement à l’aide d’injections de streptozotocine (STZ) ou d’alloxane. STZ a été utilisé avec succès chez les rongeurs et les poissons zèbres, entraînant des complications associées à la rétinopathie7,8,9,troubles cognitifs10et à la régénération des membres11. Cependant, chez le poisson zèbre, les cellules β se régénèrent après le traitement, ce qui rend nécessaires des « injections de rappel » de STZ pour maintenir des conditions diabétiques12. Alternativement, le pancréas du poisson zèbre peut être enlevé6. Ce sont deux procédures très invasives, en raison des injections multiples, et le temps de récupération étendu.
Réciproquement, l’hyperglycémie peut être induite non envahissante par l’exposition au glucose exogène. Dans ce protocole, les poissons sont immergés dans une solution de glucose hautement concentrée pendant 24 heures5,13 ou continuellement pendant 2 semaines14,15,16. Le glucose exogène est pris par voie transdermique, par ingestion et/ou à travers les branchies, ce qui entraîne une glycémie élevée. Puisque cette technique non envahissante ne manipule pas directement des niveaux d’insuline, elle ne peut pas prétendre induire le DM de type 2. Cependant, il peut être utilisé pour examiner les complications induites par l’hyperglycémie, qui est l’un des principaux symptômes du DM de type 2.
Récemment, le mutant du poisson zèbre pdx1-/- a été développé en manipulant le gène de l’homéobox 1 pancréatique et duodénal, un gène lié à la cause génétique du DM de type 2 chez l’homme. En utilisant ce mutant, les chercheurs ont pu reproduire la perturbation du développement pancréatique, l’hyperglycémie et étudier la rétinopathie diabétique induite par l’hyperglycémie17,18.
En ce document, nous décrivons une méthode non envahissante d’induction d’hyperglycémie qui emploie un protocole alternatif d’immersion. Ce protocole maintient des conditions hyperglycemic pendant jusqu’à 8 semaines avec des complications suivantes observées. En bref, les poissons zèbres adultes sont placés dans une solution de sucre pendant 24 heures, puis dans une solution aqueuse pendant 24 heures. Contrairement à l’immersion continue dans des solutions de glucose externes, l’alternance de jours entre le sucre et l’eau imite la montée et la chute de la glycémie dans le diabète. Un protocole de glucose alternatif permet en outre à l’hyperglycémie d’être induite pendant de plus longues périodes de temps, car les poissons zèbres ne sont pas aussi capables de compenser les conditions de glucose externe élevées. Comme preuve de principe, nous fournissons des données 444 40000 10000.As proof of principle, we provide data showing that hyperglycemia induced using this protocol alters retinal chemistry and physiology.

<table><tbody><tr><td>Tuyau d’air</td><td>petsmart</td><td>5291863</td><td>Cela peut être utilisé dans le réservoir pour faire circuler l’air</td></tr><tr><td>Airpump</td><td>petsmart</td><td>5094984</td><td>Cela peut être utilisé dans le réservoir pour faire circuler l’air</td></tr><tr><td>Airstones</td><td>petsmart</td><td>5149683</td><td>Cela peut être utilisé dans le réservoir pour faire circuler l’air</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-5KG</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>AC125340050</tr><tr><td>Freestyle Lite Meter</td><td>Amazon</td><td>B01LMOMLTU</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Lite Strips</td><td>Amazon</td><td>B074ZN3H2Z</td><td></td></tr><tr><td>Net</td><td>petsmart</td><td>5175115</td><td></td></tr><tr><td>Tanks</td><td>Amazon</td><td>B0002APZO4</td><td></td></tr></tbody></table>

immersion alternative dans le glucose pour produire une hyperglycémie prolongée chez le poisson zèbre

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Le poisson zèbre (Danio rerio) est un excellent modèle pour étudier les effets de l’hyperglycémie chronique, une caractéristique du diabète sucré de type II (DT2). Ce protocole alternatif d’immersion est une méthode non envahissante et pas à pas d’induire l’hyperglycémie pendant jusqu’à huit semaines. Les poissons zèbres adultes sont alternativement exposés au sucre (glucose) et à l’eau pendant 24 heures chacun. Le poisson zèbre commence le traitement dans une solution de glucose à 1% pendant 2 semaines, puis une solution à 2% pendant 2 semaines et enfin une solution à 3% pendant les 4 semaines restantes. Comparé aux contrôles traités à l’eau (stress) et traités au mannitol (osmotique), les poissons zèbres traités au glucose ont des niveaux de sucre dans le sang significativement plus élevés. Le poisson zèbre glucose-traité montre des niveaux de sucre dans le sang de 3 fois celui des contrôles, suggérant qu’après quatre et huit semaines hyperglycémie puisse être réalisée. L’hyperglycémie soutenue a été associée à la protéine acide fibrillaire glial accrue (GFAP) et aux niveaux nucléaires accrus du facteur Kappa B (N-F-kB) dans la rétine et aux réponses physiologiques diminuées, ainsi qu’aux déficits cognitifs suggérant que ce protocole puisse être employé pour modéliser des complications de la maladie.

En utilisant ce protocole(figure 1),les valeurs de sucre dans le sang sont significativement élevées après 4 semaines et 8 semaines de traitement(figure 2A),l’hyperglycémie étant définie comme 3 fois les moyennes de contrôle des groupes traités à l’eau et traités au mannitol. Les témoins traités à l’eau sont transférés quotidiennement dans et hors de l’eau, ce qui fournit un contrôle du stress et de la manipulation. Le mannitol sert de contrôle osmotique dans le...

Ce protocole induit non envahissantement l’hyperglycémie chez le poisson zèbre pendant jusqu’à 8 semaines. À l’aide de ce protocole, une étude approfondie des effets indésirables de l’hyperglycémie peut être réalisée.

Immersion alternative dans le glucose pour produire une hyperglycémie prolongée chez le poisson zèbre

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

Ce protocole induit l’hyperglycémie chez les poissons zèbres dans un modèle de montée et de chute qui imite l’hyperglycémie qui est vue dans le type deux diabète. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une technique non invasive qui permet de s’assurer que l’hyperglycémie est la cause de toute altération observée chez les poissons hyperglycémiques. Ce protocole pourrait potentiellement être employé pour explorer des avenues thérapeutiques ou des produits pharmaceutiques qui ciblent des complications de l’hyperglycémie.Ce protocole comporte de nombreuses étapes, mais lorsque les étapes sont suivies correctement et avec soin, il devrait rapidement devenir une seconde nature. N’oubliez pas cependant de toujours traiter les animaux avec douceur et humanité tout au long du protocole. Commencez par mettre en place six réservoirs, deux pour chaque groupe expérimental.Utilisez des réservoirs de deux litres, si le nombre total de poissons est inférieur à 20 et des réservoirs de quatre litres si le nombre total de poissons est supérieur à 20. Étiquetez l’un des deux réservoirs, le réservoir de logement et l’autre réservoir de solution. Gardez les réservoirs dans un bain-marie à 28 à 29 degrés Celsius pour maintenir la température de l’eau.Le premier jour, placez le poisson dans leurs solutions de traitement respectives pendant 24 heures. Le deuxième jour, transférer les poissons de leurs solutions de traitement à l’eau pendant 24 heures. Le troisième jour, transférez le poisson de l’eau vers des solutions de traitement.Poursuivre cette exposition alternée pour le reste de l’expérience. Transfert quotidien des poissons témoins traités à l’eau d’eau à eau. Assurez-vous que les poissons sont nourris et transférés dans la même fenêtre de deux heures chaque jour pendant toute la durée de l’expérience.Transférer les poissons de chaque groupe de traitement du réservoir de logement au réservoir de solution correspondant à l’aide d’un filet à poisson standard. Replacez le réservoir contenant le poisson dans le bain-marie et remplacez la pierre d’air et le couvercle du réservoir. Ce réservoir est maintenant le réservoir de logement et le réservoir qui contenait auparavant le poisson est maintenant le réservoir de solution.Jetez l’ancienne solution et nettoyez le réservoir avec les couvercles du réservoir, les conduites d’air, les pierres d’air et les filets pour éviter l’accumulation de glucose et de mannitol. Utilisez de l’eau et une éponge dédiée pour chaque condition de traitement afin de nettoyer correctement les réservoirs. Séchez les réservoirs de solution nouvellement nettoyés avec une serviette en papier et préparez les solutions pour le lendemain en utilisant ce réservoir.Assurez-vous que les autres articles sont séchés et séparés par des groupes de traitement appropriés. Pour préparer les solutions de sucre, remplissez chaque réservoir de solution avec deux ou quatre litres d’eau système. Mesurez la quantité correcte de glucose et de mannitol à l’aide d’une balance à chargement par le haut et séparez les bateaux de pesage pour chaque produit chimique.Ajouter la partie aliquote de glucose ou de mannitol pesée dans le réservoir de solution propre approprié. Remuer les solutions avec des tiges de verre séparées jusqu’à ce que les sucres soient complètement dissous. Retournez ensuite les réservoirs de solution au bain-marie et couvrez-les de leurs couvercles correspondants.Pour préparer la solution d’eau, remplissez les réservoirs expérimentaux avec de l’eau système Retournez ces réservoirs de solution au bain-marie et couvrez-les de leurs couvercles correspondants. Des valeurs de sucre de sang ont été sensiblement élevées après des traitements de glucose de quatre semaines et de huit semaines. Avec l’hyperglycémie définie comme trois fois les moyennes de contrôle des groupes traités par l’eau et traités par mannitol.Le tissu rétinien rassemblé après quatre semaines d’hyperglycémie a eu une augmentation des niveaux acides fibrillaires glial de protéine ou de GFAP. L’expression de GFAP est observée dans les cellules gliales de Mueller dans la rétine, qui sont altérées dans la rétinopathie diabétique. Cette augmentation de GFAP a été associée à une augmentation des niveaux nucléaires de kappaB de facteur.Suggérant que l’hyperglycémie induite déclenche une réponse inflammatoire et un gliosis réactif. Les enregistrements d’ERG après quatre semaines de traitement ont identifié une réponse diminuée dans les rétines traitées par glucose comparées aux contrôles traités par mannitol. Des amplitudes du photorécepteur et des composants bipolaires de cellules ont été diminuées chez les poissons hyperglycemic.Cette procédure peut être complétée par d’autres tests d’hyperglycémie. Par exemple, un test de mémoire peut être utilisé pour examiner les déficits cognitifs ou enregistrer des réponses visuelles telles que la réponse optomotrice pour évaluer les complications basées sur la vision. Une fois cette technique établie, notre laboratoire a pu l’utiliser pour étudier les complications induites par l’hyperglycémie dans le modèle des poissons zèbres.Nous avons observé ces complications relativement rapidement, après quatre semaines de traitement.

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Nous démontrons injection intrapéritonéale dans le poisson zèbre adulte. Nous utilisons une microseringue 10 ul Nanofil contrôlée par un contrôleur Micro4 et UltraMicroPump III. Cette manifestation comprend l'utilisation de l'eau froide comme anesthésique.

Injection intrapéritonéale en Zebrafish adultes

Cette vidéo décrit la technique de création d’un modèle de poisson-zèbre pour le diabète sucré de type 1 à l’aide du médicament Streptozocine, afin d’étudier la physiopathologie des complications diabétiques et la mémoire métabolique.

Traitement à la streptozocine : un modèle de poisson zèbre du diabète sucré de type 1

Mémoire métabolique est le phénomène par lequel les complications du diabète persistent et progresser sans entrave, même après euglycémie est atteint pharmaceutique. Nous décrivons ici un modèle de poisson zèbre diabète sucré qui est unique en ce qu'elle permet d'examiner des éléments mitotiquement transmissibles épigénétiques de mémoire...

Un modèle de poisson zèbre du diabète sucré et de la mémoire métabolique

Les poissons-zèbres sont un organisme modèle important pour l’étude de l’homéostasie énergétique.  En utilisant un indicateur redox sensible au NADH2, alamar Blue, nous avons mis au point un test qui mesure le taux métabolique des larves de poisson-zèbre dans un format de plaque à 96 puits et peut être appliqué à la découverte de médicaments ou de gènes.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Dépense énergétique Assay

Ce travail décrit des méthodes pour établir des modèles hyperglycémiques aigus et chroniques dans le poisson zèbre. L'objectif est d'étudier l'impact de l'hyperglycémie sur les processus physiologiques, tels que la neurogénèse constitutive et induite par les blessures. Le travail souligne également l'utilisation du poisson zèbre pour suivre les molécules radiomarquées (ici, [ 18 F] -FDG) en utilisant PET / CT.

Les modèles aigus et chroniques de l&#39;hyperglycémie dans le poisson-zèbre: une méthode pour évaluer l&#39;impact de l&#39;hyperglycémie sur la neurogénèse et la biodisposition des molécules radiomarquées

Ici, nous discutons d’une méthode de protocole qui permettra une analyse simple du système vasculaire rétinienne tg(fli:EGFP) adult poisson zèbre comme une lecture rapide en paramètres de pathologies vasculaires à long terme, liées à la néoangiogenèse et changements structurels.

Étudier le diabète à travers les yeux d’un poisson : Microdissection, la visualisation et l’analyse de le tg(fli:EGFP) adulte vascularisation rétinienne de poisson-zèbre

Fonctionnalités de bêta-cellules sont importante pour l’homéostasie du glucose dans le sang, qui est évalué à cellule unique résolution utilisant un journaliste génétiquement codé pour l’influx de calcium.

Analyse de la fonction des cellules bêta à l’aide d’imagerie calcique résolution unicellulaire dans les îlots de poisson-zèbre

Nous présentons une chambre comportementale conçue pour évaluer les performances cognitives. Nous fournissons des données montrant qu’une fois acquis, le poisson-zèbre se souvient de la tâche 8 semaines plus tard. Nous montrons également que les poissons-zèbres hyperglycémiques ont modifié les performances cognitives, ce qui indique que ce paradigme est applicable aux études évaluant la cognition et la mémoire.

La tâche comportementale de choix à trois chambres utilisant le poisson-zèbre comme système modèle

Paradigme classique conditionnement de la peur a été adapté pour les participants humains dans un contexte de réalité virtuelle immersive. L'utilisation d'un paradigme de la discrimination, la peur conditionnée, queue et rétention de la mémoire contexte, et l'extinction a été mesurée avec la réponse à la dynamique de conductance de la peau des serpents et des araignées virtuelles (les stimuli conditionnés) dans deux contextes distincts virtuel.

Conditionnement de la peur humaine, à l&#39;immersion en 3 dimensions pleine réalité virtuelle

La vidéo montre le présent une méthode qui prend avantage de la combinaison de l'électroporation et la microscopie confocale pour l'imagerie en direct sur chaque cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur poisson zèbre en développement.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Découvrez une méthode non invasive pour induire une hyperglycémie prolongée chez Danio rerio en alternant glucose et mannitol. Ce protocole permet d'étudier les complications rétiniennes et physiologiques liées au diabète de type 2.

Immersion alternative dans le glucose pour produire une hyperglycémie prolongée chez le poisson zèbre

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