Microdissection du cerveau de souris en régions fonctionnellement et anatomiquement différentes

L’étude de régions cérébrales distinctes est un tremplin vers la compréhension de la complexité moléculaire et structurelle du cerveau. Ce protocole décrit une dissection systématique du cerveau de souris pour isoler des régions cérébrales distinctes. Du point de vue de l’anatomie du cerveau, il s’agit d’une approche descendante qui peut être facilement reproduite.

Les avantages de ce protocole sont doubles. Tout d’abord, cette approche offre l’occasion de comprendre les fondements moléculaires de petites régions cérébrales critiques. Deuxièmement, l’ensemble de ce processus de dissection est suffisamment court pour assurer la préservation de l’intégrité moléculaire, une condition préalable essentielle aux essais rétrospectifs et moléculaires.

Cette procédure implique de la pratique et une manipulation délicate. Le timing est très crucial ici pour maintenir les repères structurels, et peut être réalisé avec une formation et une pratique appropriées. Seid Muhie, chimiste de recherche et bioinformaticien de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure d’ablation du cerveau de souris.

James Meyerhoff, un neuroscientifique de notre laboratoire, fera une démonstration plus poussée de la procédure de dissection cérébrale de souris. Pour commencer, nettoyez et retirez la peau pour une bonne prise en main. Serrez le maxillaire de la tête décapitée avec un hémostatique et utilisez une gaze pour refléter le cuir chevelu de manière rostrale.

Insérez les fins ciseaux incurvés dans le foramen magnum pour séparer les méninges adhérentes. Insérez ensuite les ciseaux à l’ouverture de la base du crâne où passe la moelle épinière avec la lame pointant verticalement, mais parallèlement et appuyant contre la surface interne de l’os de la plaque basale, en tournant la lame de 45 degrés vers le côté gauche, puis vers le côté droit. Enlevez l’os occipital dans l’os intrapariétal pour exposer le cervelet.

Avancez les ciseaux rostralement le long de la suture sagittale moyenne jusqu’au bregma, et coupez-le en le soulevant vers le haut pour éviter la lacération du cortex cérébral. Au fur et à mesure que les os pariétaux sont soulevés, identifiez et coupez les attaches méningées restantes. Faites deux coupes parallèles dans le plan sagittal et retirez les fragments de l’os frontal, en évitant de lacéré la surface du cerveau.

Tout en coupant les attaches méningées et les nerfs crâniens, inverser le crâne pour permettre à la gravité d’aider à l’élimination du cerveau dans une petite tasse préremplie de solution saline. Gardez la bulle auditive intacte pour que l’anatomie hypophysaire soit identifiable. Faites une coupe parasaggitale extrêmement petite des deux côtés dans la crête de la tente membraneuse qui maintient l’hypophyse à sa place, et soulevez le lobe postérieur de l’hypophyse avec une pince ultra fine.

Faites une coupe sagittale entre les marges latérales du lobe antérieur de l’hypophyse dans le nerf trijumeau le plus proche, puis soulevez le lobe antérieur de l’hypophyse. Dirigez la source de lumière blanche sur le tissu. Placez le cerveau sur un bloc en acier inoxydable pré-refroidi et gardez le bloc froid en l’entourant de glace dans une solution saline glacée.

Humidifiez périodiquement le tissu avec une solution saline glacée pour préserver les structures. Positionnez le cerveau de telle sorte que les cortex cérébraux soient orientés vers le haut. À l’aide de petites pinces incurvées, retirez le cervelet.

En utilisant l’approche dorsale, glissez les lames fermées d’une petite pince incurvée sous le corps calleux et écartez-le doucement pour rétracter le néocortex bilatéralement afin de préserver les repères médians critiques. Éventuellement, des structures telles que le chiasme optique, l’hypothalamus, les bulbes olfactifs, le bulbe rachidien, l’hypophyse et le pont pontin seraient visibles. Essayez de séparer les hémisphères.

Retournez le site ventral cérébral vers le haut et faites une coupe sagittale moyenne à partir du dos entre les bulbes olfactifs dans les hémisphères cérébraux. Retirez la moelle, puis séparez doucement les deux hémisphères. Ensuite, faites une coupe coronale à la marge intérieure des étangs pour obtenir le cerveau postérieur et séparer la moelle à la marge postérieure des étangs.

Retournez le tissu cérébral pour une séparation minutieuse des deux hémisphères cérébraux. Retirez le bulbe olfactif à cette étape. Faire une coupe coronale d’un millimètre antérieur au genre du corps calleux, et retirer les bulbes olfactifs accessoires, puis séparer le cortex préfrontal médial et latéral.

Couper partiellement horizontalement ou coronalement à travers la partie transversale de la commissure antérieure à partir de la ligne médiane sous la corne antérieure du ventricule latéral pour libérer le noyau septal dorsalement et le striatum ventral ventralement. Retirez la petite quantité du cortex de la surface latérale pour enlever le succombe du noyau et le tubercule olfactif. Séparez la partie rostrale du corps striatum du cortex sus-jacent via un scalpel incurvé coupé juste à l’extérieur de la capsule externe.

Identifiez les noyaux septaux ou septum et isolez-les de cette section. Faites une coupe incurvée pour séparer l’hypothalamus à cette étape. Cela se fera en utilisant une coupe coronale partielle postérieure aux corps mamillaires ne s’étendant que latéralement jusqu’au sillon hypothalamique.

Libérez ensuite la section transversale de l’hypothalamus avec une coupe parasagittale le long du sillon hypothalamique. Inversez le ventricule latéral pour révéler des connexions intralimbiques supplémentaires dans les composants restants du système limbique. Sur la partie interne du cortex interne, une structure en éventail est observée après l’ouverture du ventricule.

Utilisez la structure en éventail dans le cortex entorhinal pour définir les marges aux fins de la dissection, puis identifiez et supprimez l’amygdale, le cortex entorhinal, le cortex cingulaire postérieur et l’hippocampe. Confirmer l’identification du thalamus par visualisation de la strie médullaire sur sa surface dorsale s’étendant dans le plan cortical rostral médian. Séparez complètement le thalamus du mésencéphale par une coupe coronale.

Ce protocole peut être utilisé pour l’ablation immédiate du cerveau du crâne, suivie d’une dissection. Les tissus disséqués peuvent être conservés et traités ultérieurement en fonction des exigences de l’étude. L’ARN extrait de plusieurs tissus disséqués peut être dosé pour l’expression génique.

Les résultats représentatifs ont été obtenus en utilisant des cerveaux récoltés qui ont été stockés à moins 80 degrés Celsius pendant plusieurs mois avant l’extraction de l’ARN. Des régions cérébrales distinctes ainsi que des données sur le poids ont été recueillies dans le cadre du modèle de stress social exposé à l’agresseur du SSPT. Les concentrations d’ARN et les lectures spectrophotométriques sont indiquées ici.

Lorsque vous suivez ce protocole, assurez-vous que les tissus sont refroidis en tout temps en gardant le cerveau sur un bloc d’acier glacé et en aspergeant périodiquement le tissu avec une solution saline glacée. Une fois que les tissus sont collectés et immédiatement congelés, ils peuvent être utilisés pour des tests tels que la transcriptomique, la métabolomique et la protéomique à un moment ultérieur.