Imagerie in vitro de cellules vivantes en accéléré pour explorer la migration cellulaire vers l’organe de Corti

Les méthodes in vitro existantes pour étudier la migration des CSM comprennent Transwell ou les protocoles de cicatrisation des plaies. La méthode décrite ici peut être utilisée pour suivre la migration des CSM vers l’explantation en temps réel. En termes de culture d’explant, l’avantage de cette méthode par rapport aux autres est qu’elle permet une réduction du temps et des coûts, ainsi qu’une simplification des étapes expérimentales.

Cette technique peut être utilisée pour observer la localisation des cellules souches à cibler en temps réel, ce qui permet de développer des modèles avec une efficacité de guidage optimisée. L’ablation de la membrane tectoriale est difficile pour les chercheurs inexpérimentés. Selon le stade de développement, il est important de comprendre le bon moment pour retirer la membrane tectoriale pour le succès de ce protocole.

La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Jeong-Eun Park et Dr.Su Hoon Lee, professeurs-chercheurs de mon laboratoire. Commencez par stériliser le capot de culture tissulaire à flux laminaire en allumant la lumière ultraviolette pendant environ 30 minutes. Vaporisez toutes les surfaces avec de l’éthanol à 70 % avant l’utilisation et laissez-les sécher.

Placez les instruments de dissection dans de l’éthanol à 70 % pendant 10 minutes, puis séchez-les avant de les utiliser. Après avoir décapité une souris âgée de trois à quatre jours, trempez l’avant dans de l’éthanol à 70 % et placez-le sous un microscope en série dans la hotte à flux laminaire. Trempez rapidement le tissu dans une solution de dissection tissulaire pour éliminer l’éthanol.

Coupez la ligne médiane du crâne avec la lame chirurgicale, puis exposez le crâne en tirant vers le bas la peau vers l’avant et en coupant le conduit auditif externe de l’oreille. Coupez de la partie antérieure à la partie postérieure du crâne à travers la ligne des yeux, puis ouvrez le crâne et retirez le cerveau antérieur, le cervelet et le tronc cérébral avec une pince émoussée. À l’aide d’une micropince, séparez la cochlée de l’os temporal et transférez-la dans une boîte de Pétri contenant une solution de dissection tissulaire.

Disséquez soigneusement toute la capsule otique cochléaire en ne laissant que les tissus mous cochléaires internes. Tenez le modiolus de la cochlée à l’aide d’une pince et le canal cochléaire à l’aide d’une autre paire de pinces, puis séparez lentement les deux tissus. Retirez la strie vasculaire et la membrane tectorale en les décollant doucement.

Placez une lamelle en plastique stérilisé dans une nouvelle solution de dissection tissulaire, puis placez l’organe de Corti sur la lamelle en vous assurant que la membrane basilaire est orientée vers le bas. Immobiliser le tissu en appuyant sur la membrane de Reissner et le tissu modiolus restant sur la lamelle à l’aide d’une pince. Transférez la lamelle avec le tissu incrusté au centre d’une boîte confocale de 35 millimètres.

Placez le cylindre de clonage en verre sur la parabole avec l’explant cochléaire positionné au centre de la parabole et ajoutez 100 microlitres de milieu de culture d’explant dans le cylindre. Placez 5 000 cellules souches mésenchymateuses ou CSM marquées GFP dérivées de la moelle osseuse dans deux millilitres de milieu de culture à l’extérieur du cylindre de verre et placez la boîte dans l’incubateur. Après avoir cultivé les cellules comme décrit dans le manuscrit du texte, aspirez tout le milieu à l’intérieur et à l’extérieur du cylindre et retirez le cylindre de verre de la parabole confocale.

Ajoutez deux millilitres de milieu de culture frais dans le plat. Placez-le dans un incubateur humidifié jusqu’à ce qu’il soit prêt à être analysé. Utilisez un système de microscopie confocale avec un incubateur sur scène.

Allumez le microscope confocal, la lumière fluorescente et l’ordinateur. Réglez les conditions de l’incubateur supérieur à 37 degrés Celsius et 5 % d’atmosphère de dioxyde de carbone. Placez le plat d’échantillon sur le récipient de fixation de la vaisselle, couvrez-le avec le couvercle de fixation de la vaisselle et fermez la chambre avec le couvercle de chauffage supérieur.

Ajustez le zoom et la mise au point pour localiser l’organe de Corti et les CSM dans le champ de vision. Ouvrez le logiciel de traitement d’image. Sous l’option de localisation, sélectionnez un objectif plan-apochromatique 20X ou une ouverture numérique de 0,8 et une zone de recadrage de 0,5X.

Sous acquisition, cliquez sur configuration intelligente et sélectionnez EGFP. Ouvrez l’onglet des canaux sous l’acquisition et réglez la puissance laser sur 0,2 %, le sténopé sur 44 micromètres, le gain principal sur 750 volts et le gain numérique sur 1,0. Cliquez sur ESID sous Configuration de l’imagerie et réglez le gain ESID sur quatre et le gain numérique sur 7,5.

Cliquez sur les tuiles et misez pour produire 210 tuiles. Ouvrez la stratégie de mise au point et sélectionnez le mode de mise au point. Sous Série chronologique, définissez la durée sur 24 heures et l’intervalle sur 10 minutes.

Lors de l’acquisition, réglez la taille de l’image sur 512 x 512 pixels, la vitesse de balayage sur huit, la direction sur bidirectionnelle, la moyenne sur 4X et le nombre de bits par pixel sur 16. Cliquez sur démarrer l’expérience pour commencer l’expérience. Le chemin bidimensionnel des cellules souches mésenchymateuses ou CSM a été suivi dans une méthode de cicatrisation des plaies en utilisant un cylindre de verre comme barrière entre les CSM et l’organe de Corti.

Lorsque l’organe de Corti a été cultivé, les fibroblastes se sont développés très rapidement vers l’extérieur à partir des cellules ciliées externes de la couche la plus externe. La plupart des CSM marquées à la GFP ont été expulsées par des fibroblastes à croissance rapide. Néanmoins, certains ont pénétré la couche de fibroblastes et ont migré avec succès vers l’organe de Corti.

Les résultats de 72 heures d’incubation ont montré que les CSM migraient vers l’organe de Corti et étaient principalement localisées dans le modiolus et la zone où les fibres nerveuses cochléaires étaient séparées du modiolus. La morphologie des CSM a été modifiée en une forme radiale similaire à celle des fibres nerveuses. Les cellules ont été transformées en une forme linéaire le long de la ligne des limbes, plutôt que de la zone des cellules ciliées.

Les CSM ont pu migrer et se développer dans la zone de collecte des fibres nerveuses en pénétrant les différentes couches cellulaires et les barrières physiques. Lorsque des dommages aux cellules ciliées ont été induits par un traitement de 16 heures avec de la kanamycine et que les cellules ont été cultivées pendant 72 heures supplémentaires après l’élimination de la kanamycine, les CSM ont été localisées non seulement dans le modiolus, mais aussi dans les cellules ciliées externes. L’immobilisation du tissu est une étape importante dans ce protocole où l’organe de Corti est attaché.

Il ne tombe pas facilement. Il s’agit d’une astuce triviale, mais utile pour une culture d’explants réussie. Cette méthode peut être adaptée pour étudier l’efficacité des exosomes sécrétés par les CSM.