Synthèse hétérocyclique spinocyclique fonctionnalisée et dosage de cytotoxicité
9 février 2021
Ici, nous décrivons un essai biologique utilisant le bromure de 3-(4′,5′-diméthylthiazol-2′-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) pour tester les oximes spirocycliques précédemment synthétisés.
Ce protocole utilise une méthode recyclable et modifiée pour produire des composés spirocycliques. Le test MTT permet de répondre à la question relative à la cytotoxicité de ces nouvelles molécules. Cette technique produit de nouvelles molécules modifiables à l’aide d’un matériau de départ régénérant.
Le test MTT fournit des résultats biologiques relativement rapides et faciles à analyser Commencez par effectuer une synthèse en phase solide des hétérocycles spirocycliques six et sept, comme démontré précédemment. Préparer 20 millilitres d’une solution de MTT de cinq milligrammes par millilitre en utilisant du PBS stérile comme diluant. Filtrer et conserver la solution à moins 20 degrés Celsius.
Ensuite, préparez une dilution univoque de la solution de MTT dans DMEM. Préparer un millilitre chacun de solutions mères dans des tubes microcentrifugés de 1,5 millilitre de composés d’essai dans du DMSO. Conservez-les à moins 20 degrés Celsius.
Préparer 200 microlitres par dose des solutions de travail des composés d’essai en diluant les concentrations des stocks. Un à 1000 dans le milieu libre de sérum. Dans les graines de culture tissulaire, sept cellules COS en milieu complet sur une culture tissulaire à fond plat ont traité 96 plaques de puits à une concentration de 4 000 cellules par 200 microlitres par puits.
Utilisation d’un pipeter multicanal. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, aspirez le surnageant des puits à l’aide d’une pipette de pâturage en verre fixée à une pompe à vide.
Doser les cellules en trois exemplaires avec les composés d’essai en utilisant les solutions de travail préalablement préparées. Retournez ensuite les cellules dans l’incubateur. Après 24 heures, aspirez le surnageant des puits et ajoutez 200 microlitres de solution MTT à chaque puits.
Incuber l’assiette pendant quatre heures. Aspirer doucement le surnageant des puits sans déranger les cristaux de formazane pourpre. Ajouter 200 microlitres de DMSO à chaque puits pour dissoudre les cristaux.
Incuber ensuite la plaque à température ambiante pendant 15 minutes. Mesurez l’absorbance de chaque puits à 590 ou 600 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques à 96 puits. Utilisez des puits sans cellules comme fond et faites la moyenne de la valeur d’absorbance.
Les veines Spirocycliques six et sept ont été synthétisées à l’aide d’un protocole modifié. La progression de la réaction a été surveillée en détectant la disparition de l’esther alpha bêta insaturé par spectroscopie infrarouge. Le test MTT a été utilisé pour déterminer la viabilité cellulaire.
Le cisplatine, connu pour induire la mort cellulaire à des concentrations élevées, a servi de témoin positif. Comme prévu, plus la concentration de cisplatine est élevée, plus la viabilité cellulaire est faible. Le test MTT a ensuite été utilisé pour tester les composés spirocycliques six et sept et la furfurylamine.
La furfurylamine et la veine de gox spirocyclique six ont montré une cytotoxicité similaire. Cependant, la toxicité du composé spirocyclique sept était sensiblement supérieure à celle de la furfurylamine et du six. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que la N-alkylation réalisée à l’aide d’halogénures d’acyle volumineux s’est avérée réduire le taux d’élimination bêta, réduisant ainsi le rendement du produit.
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Aperçu
Cette étude décrit une méthode d'évaluation de la cytotoxicité de nouvelles oximes spirocycliques à l'aide du test au MTT. Le protocole met l'accent sur la synthèse en phase solide et évalue la viabilité des cellules COS7 traitées avec les composés synthétisés.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Essais biologiques
- Essais de cytotoxicité
- Synthèse de composés spirocycliques
Contexte
- Recherche sur les composés spirocycliques
- Importance de la cytotoxicité dans le développement de médicaments
- Utilisation du test au MTT comme méthode fiable
Méthodes utilisées
- Synthèse en phase solide d'hétérocycles spirocycliques
- Ligne cellulaire COS7 comme modèle biologique
- Dosage MTT pour mesurer la viabilité cellulaire
Résultats principaux
- Comparaison des effets cytotoxiques des composés spirocycliques et de la furfurylamine
- Les observations ont indiqué que le composé spirocyclique sept présentait une toxicité plus élevée que les autres
- Les résultats ont été validés en utilisant le cisplatine comme témoin positif
Conclusions
- L'étude démontre l'efficacité des composés spirocycliques pour induire la mort cellulaire
- Les résultats apportent des connaissances précieuses pour la recherche sur le cancer et le développement de médicaments
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce travail présente une synthèse allégée en phase solide de composés hétérocycliques spirocycliques, réduisant le nombre d'étapes de synthèse et éliminant les réactifs toxiques, ce qui améliore l'efficacité de la génération de composés candidats dans la découverte de médicaments en oncologie. Le test au MTT permet un criblage rapide et quantitatif de la cytotoxicité à des concentrations micromolaires de composés, facilitant la validation précoce des cibles et la réduction des risques mécanistiques. Ensemble, ces méthodes renforcent la fiabilité prédictive dans le choix des squelettes spirocycliques à évaluer ultérieurement au stade préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier les effets cytotoxiques de nouveaux hétérocycles spirocycliques afin d'évaluer la viabilité d'une hypothèse thérapeutique.
- Valeur opérationnelle : La synthèse en phase solide sur une résine liante REM à faible charge permet l'incorporation de chaînes latérales aromatiques encombrantes, élargissant ainsi la diversité chimique pour les études d'interaction avec la cible.
- Valeur prédictive : Les données de cytotoxicité issues du test MTT appuient les décisions de poursuite ou d'abandon en quantifiant l'induction de la mort cellulaire par rapport au témoin de cisplatine.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Le test MTT fournit une mesure reproductible et colorimétrique de la viabilité cellulaire dans les cellules COS7 traitées avec des composés test.
- Valeur opérationnelle : Le réactif MTT disponible dans le commerce et le protocole simple permettent une compatibilité avec les criblages à haut débit.
- Préparation du test : Les solutions de travail préparées dans le DMSO et diluées dans un milieu sans sérum garantissent une administration cohérente des composés entre les réplicats.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Le profilage de la cytotoxicité de composés spirocycliques et de la furfurylamine établit une base structure-activité pour l'optimisation en aval.
- Pertinence préclinique : La toxicité différentielle observée — en particulier la cytotoxicité accrue du composé spirocyclique sept — soutient l'identification de candidats prometteurs guidée par les relations structure-activité (SAR).
- Déminimisation des risques mécanistiques : L'utilisation du cisplatine comme témoin positif valide la sensibilité du test et renforce la confiance dans les effets spécifiques aux composés.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le flux de travail intégré place la synthèse en phase solide suivie d'un criblage cytotoxique basé sur le MTT comme une passerelle entre la découverte et le stade préclinique pour l'évaluation de composés hétérocycliques en oncologie.
- Découverte en biologie : La synthèse en phase solide permet la génération rapide de squelettes spirocycliques modifiables pour tester des hypothèses et analyser des voies biologiques.
- Triage : Le test au MTT fournit des mesures quantitatives de viabilité basées sur un point final, permettant de comparer la puissance et la sélectivité des composés.
- Analyse : Les mesures d'absorbance à 590–600 nm, normalisées par rapport aux puits témoins, fournissent des données fiables pour l'estimation de la CI50 dans les modèles structure-activité.
- Recherche translationnelle : Le classement des composés selon leur cytotoxicité (par exemple, composé sept > six ≈ furfurylamine) guide la sélection des composés à étudier plus en détail sur le plan mécanistique.
- Réutilisation institutionnelle : La plateforme en phase solide et le test au MTT peuvent être adaptés à différentes bibliothèques d'hétérocycles, soutenant ainsi une infrastructure de découverte réutilisable.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : La réduction du nombre d'étapes de synthèse et l'élimination des réactifs toxiques améliorent la sécurité et la possibilité de mise à l'échelle de la voie de synthèse pour la production de bibliothèques.
- Valeur opérationnelle : La résine liante REM à faible taux de chargement permet une compatibilité avec des substituants encombrants, augmentant ainsi les taux de réussite synthétique pour des chimiotypes variés.
- Valeur stratégique : Le profilage de la cytotoxicité accélère l'identification de hits spirocycliques puissants, réduisant le risque d'échec en phase avancée du développement.
- Impact sur le portefeuille : Les données quantitatives de viabilité soutiennent une priorisation ajustée au risque des candidats spirocycliques en vue de leur optimisation en chimie médicinale.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Une expertise en synthèse organique en phase solide et en manipulation de cultures cellulaires est requise pour obtenir des résultats reproductibles.
- Les équipements comprennent un lecteur de plaques à 96 puits capable de mesurer l'absorbance à 590–600 nm et une hotte de culture tissulaire pour l'administration stérile des composés.
- La standardisation entre les équipes exige une préparation constante de la solution de MTT, son stockage à –20°C et des protocoles de dosage en triple exemplaire.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles peut nécessiter une optimisation de la densité d'ensemencement cellulaire et des durées d'incubation en fonction des taux de prolifération.
- Les halogénures d'acyle encombrants dans les étapes de N-alkylation peuvent réduire les taux d'élimination bêta et diminuer le rendement du produit, comme indiqué dans le protocole.
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