Name: Synthèse hétérocyclique spinocyclique fonctionnalisée et dosage de cytotoxicité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Découvrez la synthèse en phase solide d'oximes spirocycliques et leur évaluation cytotoxique par dosage MTT sur cellules COS7. Cette méthode avance la recherche en développement de nouveaux agents anticancéreux.

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Ce travail a été financé par une subvention du Conseil de recherche de la faculté à K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. et J.F.M. sont récipiendaires de la bourse SURE (Scholarly Undergraduate Research Experience). S.K.M. et B.M.R. sont récipiendaires des bourses de recherche STEM (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Nous sommes reconnaissants au Dr Matthew Berezuk et au Dr Philip Cox pour leurs conseils sur les essais biologiques.

NOTE: Plusieurs produits chimiques et réactifs biologiques utilisés dans ce protocole sont toxiques et cancérogènes. Consultez les fiches signalétiques (FS) pertinentes avant de les utiliser. Utilisez des équipements de protection individuelle appropriés (lunettes de sécurité approuvées par l’Occupational Safety and Health Administration, gants appropriés, blouses de laboratoire, pantalons longs et chaussures fermées) avant de commencer l’expérience. En outre, adopter des pratiques de sécurité appropriées lors de la synthèse et de la manipulation de produits chimiques toxiques et de réactifs (hotte).
1. Synthèse en phase solide des hétérocycles spirocycliques 6 et 7
NOTE: La synthèse était basée sur des travaux publiés précédemment11,12. Le protocole mis à jour révèle que l’ouverture cyclique catalysée par le fluorure de tétrabutylammonium de l’hétérocycle tricyclique n’était pas nécessaire, et donc son élimination raccourcit la procédure synthétique.
<ol><li>Effectuer l’ajout de furfurylamine à Michael au linker REM (durée: 25 min de configuration + 24 h de temps de réaction).<ol><li>Ajouter 1 g (1 équivalent [équiv.]) de résine REM, 20 mL (20 équivalents) de diméthylformamide (DMF) et 2,4 mL de furfurylamine dans une cuve de réaction en phase solide de 25 mL. Agiter la cuve de réaction à température ambiante pendant 24 heures après le début de la réaction. REMARQUE: Assurez-vous d’un mélange complet afin que la résine ne reste pas au fond du récipient.</li>
		<li>Lavez la résine avec DMF 1x une fois la réaction terminée. Ensuite, laver 4x, en alternant entre le dichlorométhane (DCM) et le méthanol. Sécher soigneusement la résine dans la cuve de réaction après les lavages.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer l’addition Michael en tandem/cycloaddition 1,3-dipolaire (durée : 25 min de configuration + 48 h de temps de réaction).<ol><li>À la résine sèche, ajouter 1,48 mL (5 équivalents) de triéthylamine (TEA), 0,637 g (2 équivalents) de nitro-oléfine et 10 mL de toluène sec dans la cuve de réaction.</li>
		<li>Ensuite, ajouter 1,085 mL (4 équivalents) de chlorure de triméthylsilyle (TMSCl) dans la cuve de réaction dans une hotte bien ventilée. NOTE: Comme cette réaction produit du gaz HCl, ne pas boucher le récipient de réaction tant que le gaz n’a pas été libéré sous une hotte.</li>
		<li>Boucher solidement la cuve de réaction et agiter à température ambiante pendant 48 h. REMARQUE: Assurez-vous de bien mélanger la résine avec les réactifs.</li>
		<li>Utilisez 5 mL de méthanol pour éteindre la réaction.</li>
		<li>Vidangez le récipient pour éliminer la solution, puis lavez 4x, en alternant entre DCM et méthanol. Sécher soigneusement la résine dans la cuve de réaction après les lavages.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer la N-alkylation de l’hétérocycle lié à la résine pour former l’amine quaternaire (durée : 10 min de configuration + 24 h de temps de réaction).<ol><li>Ajouter à la résine sèche dans la cuve de réaction 5 mL de DMF et 10 équivalents d’halogénure d’alkyle, et agiter à température ambiante pendant 24 h. REMARQUE: Assurez-vous de bien mélanger les réactifs avec la résine.</li>
		<li>Lavez la résine avec DMF 1x une fois la réaction terminée. Ensuite, utilisez du DCM et du méthanol en alternance pour laver 4x. Sécher la résine dans le récipient de réaction après les lavages.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer β-élimination de l’amine quaternaire pour le clivage du support polymère (durée: 15 min de configuration + 24 h de temps de réaction).<ol><li>À la résine sèche dans la cuve de réaction, ajouter 3 mL de DCM et 1,49 mL (5 équivalents) de TEA pour cliver l’hétérocycle du support polymère.</li>
		<li>Agiter le mélange réactionnel pendant 24 h pour assurer un mélange complet de la résine avec la solution. Lavez 4x, en alternant entre DCM et méthanol. Recueillir l’élution de tous les lavages et concentrer par évaporation rotative.</li>
		<li>Triturer avec du méthanol pour purifier l’oxime spirocyclique. Sécher soigneusement la résine dans la cuve de réaction après les lavages pour la réutiliser dans de futures expériences.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Essai de cytotoxicité à l’aide de MTT 14
<ol><li>Préparer 20 mL d’une solution de MTT à 5 mg/mL en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS, NaCl à 0,9 % dans l’eau) comme diluant. Filtrer et conserver à -20 °C. Ensuite, préparer une dilution 1:1 de la solution de MTT à partir de l’étape 2.1 dans un milieu de culture cellulaire sans sérum (DMEM).</li>
	<li>Préparer 1 mL de solutions mères dans des tubes microcentrifuges de 1,5 mL de 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM et 0,01 μM de composés à essai dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver à -20 °C. Préparer 200 μL par dose des solutions de travail des composés d’essai en diluant les concentrations mères 1:1000 dans un milieu sans sérum dans des tubes de 1,5 mL.</li>
	<li>Dans le capot de culture tissulaire, ensemencer des cellules COS-7 (cellules rénales de singe vert africain, rein de Cercopithecus aethiops ) dans un milieu complet [DMEM avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS)] sur des plaques à fond plat traitées par culture tissulaire à 96 puits à une concentration de 4 × 103 cellules/200 μL par puits à l’aide d’un pipeteur multicanaux. Les cellules COS-7 ont été choisies parce que (1) ce sont des cellules couramment utilisées pour les tests de cytotoxicité et (2) elles étaient déjà disponibles dans l’établissement.</li>
	<li>Incuber les cellules COS-7 pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.</li>
	<li>Aspirer le surnageant des puits à l’aide d’une pipette Pasteur en verre fixée à une pompe à vide. Doser les cellules en trois exemplaires avec les composés d’essai à l’aide des solutions de travail préparées à l’étape 2.2 (voir tableau 1). Incuber les cellules comme décrit à l’étape 2.4.</li>
	<li>Aspirer le surnageant des puits. Ajouter 200 μL de solution de MTT à chaque puits. Incuber à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% deCO2 pendant 4 h.</li>
	<li>Aspirez doucement le surnageant des puits sans déranger les cristaux de formazan pourpre. Ajouter 200 μL de DMSO à chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan violet. Incuber à température ambiante pendant 15 min.</li>
	<li>Mesurer l’absorbance à 590 nm14 ou 600 nm pour chaque puits à l’aide d’un lecteur de plaques de 96 puits. Utilisez des puits sans cellules comme fond et faites la moyenne de la valeur d’absorbance. Soustrayez la valeur de fond moyenne de l’absorbance de la valeur d’absorbance de chaque puits traité. Normaliser les données en pourcentage de la valeur posologique nulle moyenne (moyenne des trois valeurs de dose nulle). Tracer les données sur l’axe des y: linéaire (% de viabilité cellulaire relative); axe des abscisses : log (concentration). Tracer chaque série comme une courbe individuelle (p. ex., les données triplées devraient avoir 3 courbes)</li>
</ol>

<ol><li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function%3A+a+novel+approach+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+%28MDM2+inhibitors%29+in+clinical+trials+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li>
<li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li>
<li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li>
<li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li>
<li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li>
<li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MDM2-p53+pathway+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li>
<li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li>
<li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li>
<li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li>
<li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li>
<li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+%5B4.4%5Dspirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).</li>
<li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Combinatorial+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li>
<li>MTT assay protocol. , Modified procedure from 
 .
 (2020).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La synthèse des composés spirocycliques était basée sur des recherches antérieures menées par ce laboratoire, mais avec quelques modifications (Figure 1)11,12. La progression de chaque étape de réaction a été surveillée par spectroscopie IR. L’ajout Michael du linker REM 1 avec furfurylamine a permis d’obtenir une liaison polymère 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1</sup...

L’inhibition à petite molécule de l’interaction de l’homologue E3 ubiquitine-ligase souris double minute 2 (MDM2) avec p53 est connue pour restaurer l’induction médiée par p53 de l’apoptosedes cellules tumorales 1,2,3. MDM2 est un régulateur négatif de la voie p53 et est souvent surexprimé dans les cellules cancéreuses 4,5,6,7,8,9. Des études cristallographiques et biochimiques récentes ont révélé que de petites molécules contenant un cadre spirocyclique peuvent inhiber efficacement les interactions MDM2-p5310. Le cadre spirocyclique (Figure 1, ombré en bleu) est considéré comme un motif privilégié car la dérivatisation de ce système d’anneaux orthogonaux rigides a conduit à la découverte de nouveaux médicaments thérapeutiques. L’accès à cette architecture intéressante pose un défi lors de l’utilisation des techniques traditionnelles de synthèse organique. Bien que les effets thérapeutiques des molécules spirocycliques dans les systèmes biologiques aient été étudiés, la synthèse de ces molécules est encore un processus lourd. Les produits secondaires indésirables, l’utilisation de conditions difficiles et les métaux de transition dangereux sont souvent problématiques.
L’utilisation potentielle du motif spirocyclique dans le développement de médicaments a conduit au développement d’un protocole utilisant la synthèse en phase solide pour générer une bibliothèque de molécules avec le motif en plus d’autres groupes fonctionnels interchangeables11,12. La séparation des produits et des réactifs entre les étapes pourrait être réalisée en utilisant simplement un agent de liaison REM fixé à une bille de résine et à un récipient filtrant en phase solide. Cela réduirait les étapes et augmenterait potentiellement les rendements. Cette approche synthétique pourrait produire un large éventail de candidats médicaments potentiels. Cependant, l’efficacité de ces molécules dans un système biologique nécessiterait des recherches plus approfondies.
Pour déterminer la cytotoxicité de ces composés spirocycliques, le test MTT13,14 a été utilisé. Cette méthode mesure la viabilité cellulaire et peut être utilisée pour déterminer indirectement la cytotoxicité cellulaire. Différentes concentrations d’inhibiteurs ont été ajoutées à des cellules cultivées dans une plaque de 96 puits, et la proportion de cellules vivantes a été mesurée par analyse colorimétrique de l’étendue de la réduction du MTT jaune par les déshydrogénases mitochondriales en composé formazan pourpre (Figure 2). L’activité est le plus souvent rapportée comme une valeur IC 50 - la concentration à laquelle la croissance cellulaire est inhibée de50% par rapport à un témoin non traité. Cet article décrit le protocole du test MTT et les résultats préliminaires de ces nouvelles molécules spirocycliques.

<table><tbody><tr><td><CELLULES >FORTES</cellules ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COS-7 (ATCC CRL-1651)</td><td>Cellules rénales</td><td></td> de <td>singe vert africain</td></tr> <tr><td>CHEMICALS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Bromooctane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152951</td><td>Alkyl-halogénure</td></tr><tr><td>Allylbromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>337528</td><td>Alkyl-halogénure</td></tr><tr><td>Benzylbromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B17905</td><td>Alkyl-halogénure</td></tr><tr><td>Cisplatine</td><td>Cayman Chemical</td><td>13119</td><td>Contrôle de la cytotoxicité</td></tr><tr><td>Dichlorométhane (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td>Solvant</td></tr><tr><td>Diméthylformamide (DMF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>Solvant</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>Solvant</td></tr><tr><td>DMEM, à haute teneur en glucose, avec L-glutamine</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>Milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>FBS (sérum de veau fœtal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Furfurylamine</td><td>Acros Organics</td><td>119800050</td><td>réactif&nbsp ;</td></tr><tr><td>Iodométhane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td>Alkyl-halogénure</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Solvant</td></tr><tr><td>MTT ((3-(4,5-Diméthylthiazol-2-yl)-2,5-Diphényltétrazolium Bromure d’aluminium)</td><td>EMD Millipore</td><td>Calbiochem 475989-1GM</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507</td><td>Milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>REM Résine</td><td>Nova Biochem</td><td>8551010005</td><td>Support polymère ; 0,500 mmol/g de chargement</td></tr><tr><td>trans-&beta ;-nitrostyrène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N26806</td><td>Réactif nitro-oléfine</td></tr><tr><td>Toluène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>Solvant</td></tr><tr><td>triéthylamine (TEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td>Réactif pour la bêta-élimination</td></tr><tr><td>du chlorure de triméthylsilyle (TMSCl)</td><td>réactif 386529 Sigma-Aldrich</td><td></td><td> ; ATTENTION - très volatile ; crée HCl gaz</td></tr><tr><td><fort>VERRERIE/INSTRUMENTATION</FORT></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL récipient réactionnel en phase solide</td><td>Chemglass</td><td>CG-1861-02</td><td>Verrerie avec filtre</td></tr><tr><td>96 Lecteur de plaques de puits</td><td>Promega (Turner Biosystems)</td><td>9310-011</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>AVANCE III RMN</td><td>Spectromètre Bruker</td><td>N/A</td><td>Instrument ; 300 MHz ; Solvants : CDCl3 et CD3OH</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nicole iS5</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Wrist-Action Shaker</td><td>Burrell Scientific</td><td>757950819</td><td>Instrument</td></tr></tbody></table>

synthèse hétérocyclique spinocyclique fonctionnalisée et dosage de cytotoxicité

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Les hétérocycles spirocycliques ont récemment été rapportés dans la littérature comme étant des médicaments potentiels pour le traitement du cancer. La synthèse de ces nouveaux systèmes d’anneaux orthogonaux est difficile. Une méthodologie efficace pour synthétiser ces composés a récemment été publiée qui décrit la synthèse en phase solide en quatre étapes au lieu des cinq étapes précédemment rapportées. L’avantage de cette synthèse plus courte est l’élimination de l’utilisation de réactifs toxiques. La résine à base de linker Regenerating Michael (REM) à faible charge s’est avérée cruciale dans la synthèse, car les versions à charge élevée empêchaient l’ajout de réactifs contenant du phényle volumineux et des chaînes latérales aromatiques. Le test colorimétrique de bromure de 3-(4′,5′-diméthylthiazol-2′-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) a été utilisé pour examiner la cytotoxicité des concentrations micromolaires de ces nouvelles molécules spirocycliques in vitro. Le MTT est facilement disponible dans le commerce et produit des résultats relativement rapides et fiables, ce qui rend ce test idéal pour ces hétérocycles spirocycliques. Les structures des anneaux orthogonaux ainsi que la furfurylamine (un précurseur de la méthode de synthèse contenant un motif cyclique similaire à 5 membres) ont été testées.

Les oximes spirocycliques 6 et 7 ont été synthétisées à l’aide d’un protocole modifié (Figure 1). L’ajout Michael de furfurylamine à un agent de liaison REM 1b a permis d’obtenir une résine liée au polymère 2. La progression de la réaction a été surveillée par spectroscopie infrarouge (IR) en détectant la disparition de l’ester α,β-insaturé à 1722 cm-1 (Figure 3). La résine spirocyclique 4 a été formée à partir de 2 via un intermédiaire transitoire 3....

Ici, nous décrivons un essai biologique utilisant le bromure de 3-(4′,5′-diméthylthiazol-2′-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) pour tester les oximes spirocycliques précédemment synthétisés.

Synthèse hétérocyclique spinocyclique fonctionnalisée et dosage de cytotoxicité

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Ce protocole utilise une méthode recyclable et modifiée pour produire des composés spirocycliques. Le test MTT permet de répondre à la question relative à la cytotoxicité de ces nouvelles molécules. Cette technique produit de nouvelles molécules modifiables à l’aide d’un matériau de départ régénérant.Le test MTT fournit des résultats biologiques relativement rapides et faciles à analyser Commencez par effectuer une synthèse en phase solide des hétérocycles spirocycliques six et sept, comme démontré précédemment. Préparer 20 millilitres d’une solution de MTT de cinq milligrammes par millilitre en utilisant du PBS stérile comme diluant. Filtrer et conserver la solution à moins 20 degrés Celsius.Ensuite, préparez une dilution univoque de la solution de MTT dans DMEM. Préparer un millilitre chacun de solutions mères dans des tubes microcentrifugés de 1,5 millilitre de composés d’essai dans du DMSO. Conservez-les à moins 20 degrés Celsius.Préparer 200 microlitres par dose des solutions de travail des composés d’essai en diluant les concentrations des stocks. Un à 1000 dans le milieu libre de sérum. Dans les graines de culture tissulaire, sept cellules COS en milieu complet sur une culture tissulaire à fond plat ont traité 96 plaques de puits à une concentration de 4 000 cellules par 200 microlitres par puits.Utilisation d’un pipeter multicanal. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, aspirez le surnageant des puits à l’aide d’une pipette de pâturage en verre fixée à une pompe à vide.Doser les cellules en trois exemplaires avec les composés d’essai en utilisant les solutions de travail préalablement préparées. Retournez ensuite les cellules dans l’incubateur. Après 24 heures, aspirez le surnageant des puits et ajoutez 200 microlitres de solution MTT à chaque puits.Incuber l’assiette pendant quatre heures. Aspirer doucement le surnageant des puits sans déranger les cristaux de formazane pourpre. Ajouter 200 microlitres de DMSO à chaque puits pour dissoudre les cristaux.Incuber ensuite la plaque à température ambiante pendant 15 minutes. Mesurez l’absorbance de chaque puits à 590 ou 600 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques à 96 puits. Utilisez des puits sans cellules comme fond et faites la moyenne de la valeur d’absorbance.Les veines Spirocycliques six et sept ont été synthétisées à l’aide d’un protocole modifié. La progression de la réaction a été surveillée en détectant la disparition de l’esther alpha bêta insaturé par spectroscopie infrarouge. Le test MTT a été utilisé pour déterminer la viabilité cellulaire.Le cisplatine, connu pour induire la mort cellulaire à des concentrations élevées, a servi de témoin positif. Comme prévu, plus la concentration de cisplatine est élevée, plus la viabilité cellulaire est faible. Le test MTT a ensuite été utilisé pour tester les composés spirocycliques six et sept et la furfurylamine.La furfurylamine et la veine de gox spirocyclique six ont montré une cytotoxicité similaire. Cependant, la toxicité du composé spirocyclique sept était sensiblement supérieure à celle de la furfurylamine et du six. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que la N-alkylation réalisée à l’aide d’halogénures d’acyle volumineux s’est avérée réduire le taux d’élimination bêta, réduisant ainsi le rendement du produit.

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De nouvelles voies pour la synthèse des hétérocycles contenant de l’azote utilisant la cercosporine comme photocatalyste sans métal ont été développées.

Cercosporin-Photocatalyzé [4+1]- et [4+2]-Annulations d’Azoalkenes dans des conditions douces

La réaction de condensation de Claisen-Schmidt est une méthodologie importante pour la génération de composés aromatiques bicycliques conjugués pontés par la méthine. En utilisant une variante à médiation de base de la réaction aldol, une gamme de molécules fluorescentes et/ou biologiquement pertinentes peut être accessible par une approche synthétique généralement peu coûteuse et opérationnellement simple.

Synthèse de fluorophores de pyrazole, d’imidazole et de dipyrrinone isoindolone dépendant du pH à l’aide d’une approche de condensation de Claisen-Schmidt

Les composés thiophénésulfonamides sont des inhibiteurs puissants et spécifiques des régulateurs de détection du quorum Vibrio LuxR/HapR qui bloquent leur activité in vivo, empêchant ainsi la transcription des gènes de virulence, de motilité et de biofilms. Ce protocole détaille comment ces composés sont synthétisés, modélisés in silico et testés in vivo pour leur activité contre LuxR/HapR.

Synthèse et dosage d’inhibiteurs de détection du quorum de Vibrio

Nous présentons ici un protocole pour la conception guidée par la structure de l’interaction de liaison protéine-ligand entre la sanglifehrine A et la cyclophiline A/Ganoderiol-F, essentielle à la découverte de nouveaux médicaments. La stabilité du complexe ligand-récepteur a été évaluée à l’aide de simulations de dynamique moléculaire.

Conception et développement guidés par la structure de nouveaux inhibiteurs de la cyclophiline A et dérivés du ganoderiol-F : une approche in-silico

Ce protocole introduit une méthodologie de dépistage fluorométrique optimisée pour identifier les inhibiteurs naturels de produits et petites molécules de la synthèse protéique. Sa praticité le rend adapté à la fois à l’enseignement de premier cycle en techniques de découverte de médicaments et à la mise en œuvre dans des campagnes de chimie médicinale.

Un protocole basé sur la fluorescence pour le dépistage préliminaire des inhibiteurs de synthèse protéique provenant de sources naturelles

Ici, nous présentons un protocole permettant d’identifier les candidats potentiels à la tuberculose par dépistage phénotypique, englobant la synthèse chimique d’un composé de 4-aminoquinoline, la détermination de sa concentration inhibitrice minimale contre Mycobacterium tuberculosis, et l’évaluation de sa cytotoxicité dans les lignées cellulaires de mammifères.

Identification des candidats potentiels contre la tuberculose : guide étape par étape pour la synthèse, la détermination de la CMI et l’évaluation de la cytotoxicité chez les cellules de mammifères

Découvrez la synthèse en phase solide d'oximes spirocycliques et leur évaluation cytotoxique par dosage MTT sur cellules COS7. Cette méthode avance la recherche en développement de nouveaux agents anticancéreux.

Synthèse hétérocyclique spinocyclique fonctionnalisée et dosage de cytotoxicité

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