Name: Préparation d’échantillons de plantes pour la mesure de la teneur en nucléosides/nucléotides avec une CLHP-MS/MS (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Apprenez une méthode CLHP-MS/MS pour quantifier les nucléosides et nucléotides dans les plantes. Cette approche précise permet d'analyser 10 à 20 échantillons en deux jours et s'applique à divers organismes.

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Ce travail a été soutenu financièrement par les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (KJQN202060), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31900907), la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (BK20190528), le Centre international pour le génie génétique et la biotechnologie (CRP/ CHN20-04_EC) à M.C., et les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (LGZD202004) à X.L.

1 Croissance des plantes et collecte des matériaux
<ol><li>Assurez-vous que les graines d’Arabidopsis sont stérilisées dans de l’éthanol à 70% pendant 10 min et semées sur les plaques de gélose, qui ont été préparées avec des nutriments Murashige et Skoog d’une demi-force.</li>
	<li>Incuber les plaques contenant des graines d’Arabidopsis sous l’obscurité à 4 °C pendant 48 h, puis les transférer dans une chambre de croissance contrôlée sous une lumière de 16 h de 55 μmol m-2 s-1 à 22 °C et 8 h d’obscurité à 20 °C.</li>
	<li>Récolter 100 mg de semis de 2 semaines (poids frais) et congeler dans de l’azote liquide pour l’extraction des métabolites. ATTENTION : Les chercheurs doivent porter de façon appropriée des gants, des lunettes de protection et un sarrau de laboratoire pour éviter la contamination des tissus humains pendant la collecte des matériaux.</li>
</ol>2 Extraction des nucléosides/nucléotides
<ol><li>Broyez 100 mg de tissus végétaux congelés avec 7-8 billes d’acier dans un broyeur de mélangeur pré-froid pendant 5 min à une fréquence de 60 Hz.</li>
	<li>Préparer la solution d’extraction, qui contient du méthanol, de l’acétonitrile et de l’eau dans un rapport de 2:2:1.</li>
	<li>Ressusciter les matériaux homogénéisés (y compris la plupart des métabolites mais pas les protéines) avec 1 mL de solution d’extraction.</li>
	<li>Centrifuger la solution obtenue à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.</li>
	<li>Transférer 0,5 mL de la suspension dans un nouveau tube de 1,5 mL et congeler dans l’azote liquide.</li>
	<li>Évaporer l’échantillon congelé dans un tenoir de congélation et le ressusciter dans 0,1 mL d’acétonitrile à 5 % et à 95 % d’eau.</li>
	<li>Centrifuger la solution obtenue (0,1 mL) à 40 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Chargez le surnageant dans un flacon pour la mesure LC-MS/MS.</li>
</ol>3 mesure LC-MS/MS
<ol><li>Préparer un tampon acétate d’ammonium de 10 mM en dissolvant 1,1 g d’acétate d’ammonium dans 2 L d’eau double désionisée (phase mobile A). Ajuster le pH à 9,5 par 10% d’acide d’ammonium et d’acétate.</li>
	<li>Préparer 2 L de méthanol ultrapure à 100% (phase mobile B1) pour la mesure des nucléosides. En outre, préparez 2 L d’acétonitrile ultrapur à 100% (phase mobile B2) pour la mesure des nucléotides.</li>
	<li>Injecter 0,02 mL d’extraction de métabolites pré-traités de chaque échantillon de l’étape 2.7 dans un système HPLC avec des pompes binaires (LC) couplées à un spectromètre de masse triple quadripôle (MS). ATTENTION: Le système HPLC utilise une colonne C18 (50 x 4,6 mm, granulométrie 5 μm; fonctionnant à 25 °C) tamponnant avec les phases mobiles A et B1(figure 1A)pour la séparation des nucléosides et utilise une colonne poreuse de carbone graphitique (PGC) (50 x 4,6 mm, granulométrie 5 μm; travaillant à 25 °C) avec les phases mobiles A et B2(figure 1B)pour la séparation des nucléotides. Chaque échantillon a été injecté trois fois pour la réplication technique.</li>
	<li>Programmez la méthode comme indiqué dans le tableau 1 pour la colonne C18 et la méthode comme indiqué dans le tableau 2 pour la colonne PGC. Régler un débit de 0,65 mL min-1. NOTA : Les transitions de masse(tableau 3)ont été surveillées par spectromètre de masse. Les conditions d’analyse du spectre de masse de huit nucléosides et de cinq nucléotides contenant des nucléotides canoniques et modifiés sont énumérées dans le tableau 3.</li>
	<li>Enregistrez les zones de crête de chaque composé cible (Figure 1).</li>
</ol>4 Génération des courbes d’étalonnage étalon
<ol><li>Regroupez six extractions d’échantillons, qui ont été produites conformément à la description de la section 2, et vortexez-les. Ensuite, aliquotez-le à six extractions (même volume) à nouveau pour obtenir chaque arrière-plan.</li>
	<li>Ajoutez six concentrations différentes de chaque étalon à ces six extractions, respectivement, et injectez-les une par une à l’étape 3.3.</li>
	<li>Enregistrer les zones de crête de chaque étalon à différentes concentrations au moyen des transitions massiques décrites aux étapes 3.4 et 3.5.</li>
	<li>Tracer la zone de pointe par rapport à la concentration nominale de chaque étalon pour générer une courbe à six points. NOTA : Les zones de crête des nucléosides/nucléotides enregistrées à l’étape 3.5 devraient se situer dans la plage des courbes d’étalonnage normalisées.</li>
	<li>Calculer l’équation d’une ligne droite pour chaque composé étalon : Y = aX + b</li>
</ol>5 Quantification des métabolites
<ol><li>Calculer le contenu des métabolites à l’aide de la zone de crête enregistrée à l’étape 3.5 et de l’équation de l’étape 4.5.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li>
<li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li>
<li>Witte, C. -P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+metabolism+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li>
<li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis%2C+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li>
<li>Chen, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li>
<li>Dahncke, K., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li>
<li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li>
<li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li>
<li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li>
<li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li>
<li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li>
<li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+nucleosides%2C+nucleobases%2C+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li>
<li>Zong, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li>
<li>Moravcová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+nucleobases%2C+nucleosides%2C+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides%2C+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li>
<li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Baccolini, C., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine%2C+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Les organismes contiennent divers nucléosides/nucléotides, y compris des nucléotides canoniques et aberrants. Cependant, l’origine et les paramètres métaboliques de ceux-ci, en particulier les nucléosides modifiés, sont encore obscurs. En outre, la compréhension actuelle de la fonction et de l’homéostasie du métabolisme des nucléosides/nucléotides reste à explorer et à élargir. Pour les étudier, il convient d’utiliser une méthode précise et de référence pour l’identification et la quantification de ces métabolites. Ici, ...

Les nucléosides/nucléotides sont des composants métaboliques centraux dans tous les organismes vivants, qui sont les précurseurs des acides nucléiques et de nombreux coenzymes, tels que le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), et importants dans la synthèse des macromolécules telles que les phospholipides, les glycolipides et les polysaccharides. Structurellement, le nucléoside contient une nucléobase, qui peut être une adénine, une guanine, un uracile, une cytosine ou une thymine, et une fraction sucrée, qui peut être un ribose ou un désoxyribose1,2. Les nucléotides ont jusqu’à trois groupes phosphates se liant à la position 5-carbone de la fraction sucre des nucléosides3. Le métabolisme des nucléotides chez les plantes est essentiel à la germination des graines et à la croissance des feuilles4,5,6. Pour mieux comprendre leurs rôles physiologiques dans le développement des plantes, il convient d’établir les méthodes de quantification absolue des différents nucléosides/nucléotides in vivo.
L’une des approches les plus couramment utilisées pour mesurer les nucléosides/nucléotides utilise une chromatographie liquide haute performance (CLHP) couplée à un détecteur ultraviolet-visible (UV-VIS)4,7,8,9,10,11. En 2013, à l’aide de la CLHP, Dahncke et Witte ont quantifié plusieurs types de nucléosides chez Arabidopsis thaliana7. Ils ont identifié une teneur améliorée en guanosine dans un mutant d’insertion d’ADN-T ciblant le gène de la guanosine désaminase par rapport à la plante de type sauvage. Un autre nucléoside de pyrimidine, la cytidine, a également été détecté quantitativement dans les plantes utilisant cette méthode, ce qui a entraîné l’identification d’un gène de la cytidine déaminase de bonne foi 4. Basée sur le détecteur UV, cette méthode, cependant, ne peut pas facilement distinguer les nucléosides qui ont des spectres et des temps de rétention similaires, par exemple, la guanosine ou la xanthosine. La limite de détection de la méthode HPLC est relativement élevée, par conséquent, elle est fréquemment utilisée pour la mesure de la teneur élevée en nucléosides in vivo, tels que la cytidine, l’uridine et la guanosine.
En outre, la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) peut également être utilisée dans la mesure nucléosidique. En bénéficiant, Hauck et. al. a détecté avec succès l’uridine et l’acide urique, qui est un métabolite en aval de la voie catabolique nucléosidique, dans les graines de A. thaliana12. Cependant, gc est normalement utilisé pour séparer les composés volatils, mais ne convient pas pour les substances thermolabiles. Par conséquent, une chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) est probablement une technique d’analyse plus appropriée et plus précise pour l’identification in vivo, la séparation et la quantification des nucléosides/nucléotides13,14. Plusieurs études antérieures ont rapporté qu’une colonne HILIC peut être utilisée pour la séparation des nucléosides et des nucléotides15,16 et des étalons internes marqués isotopiquement ont été utilisés pour la quantification du composé17. Cependant, les deux composants sont relativement coûteux, en particulier les normes commerciales étiquetées isotopiques. Ici, nous rapportons une approche LC-MS/MS économiquement applicable pour la mesure des nucléosides/nucléotides. Cette méthode a déjà été utilisée avec succès pour la quantification de divers nucléosides / nucléotides, y compris l’ATP, N6-méthyl-AMP, AMP, GMP, uridine, cytidine, et pseudouridine1,5,6,18, dans les plantes et la drosophile. D’ailleurs, la méthode que nous rapportons ici peut être employée dans d’autres organizations aussi bien.

<table><tbody><tr><td>acétonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>adénosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251-1G</td><td></td></tr><tr><td>acétate d'ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73594-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01930-5G</td><td></td></tr><tr><td>CMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1006-500MG</td><td></td></tr><tr><td>cytidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C122106-1G</td><td></td></tr><tr><td>GMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8377-500MG</td><td></td></tr><tr><td>guanosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6752-1G</td><td></td></tr><tr><td>Colonne Hypercarb</td><td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td><td>35005-054630</td><td></td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57510-5G</td><td></td></tr><tr><td>inosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125-1G</td><td></td></tr><tr><td>méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>N1-méthyladénosine</td><td>Carbosynth</td><td>NM03697</td><td></td></tr><tr><td>O6-méthylganosine</td><td>Carbosynth</td><td>NM02922</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Murashige et Skoog</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0255.005</td><td></td></tr><tr><td>Colonne Polaris 5 C18A</td><td>Agilent Technologies</td><td>A2000050X046</td><td></td></tr><tr><td>pseudouridine</td><td>Carbosynth</td><td>NP11297</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6375-1G</td><td></td></tr><tr><td>uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation d’échantillons de plantes pour la mesure de la teneur en nucléosides/nucléotides avec une clhp-ms/ms

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Les nucléosides/nucléotides sont des blocs de construction d’acides nucléiques, de parties de cosubstrates et de coenzymes, de molécules de signalisation cellulaire et de vecteurs d’énergie, qui sont impliqués dans de nombreuses activités cellulaires. Ici, nous décrivons une méthode rapide et fiable pour la qualification absolue des teneurs en nucléosides / nucléotides dans les plantes. En bref, 100 mg de matériel végétal homogénéisé ont été extraits avec 1 mL de tampon d’extraction (méthanol, acétonitrile et eau dans un rapport de 2:2:1). Plus tard, l’échantillon a été concentré cinq fois dans un lyophilisateur, puis injecté dans une CLHP-MS/MS. Les nucléotides ont été séparés sur une colonne poreuse de carbone graphitique (PGC) et les nucléosides ont été séparés sur une colonne C18. Les transitions de masse de chaque nucléoside et nucléotide ont été surveillées par spectrométrie de masse. Les teneurs des nucléosides et des nucléotides ont été quantifiées par rapport à leurs étalons externes (ESTD). En utilisant cette méthode, les chercheurs peuvent donc facilement quantifier les nucléosides / nucléotides dans différentes plantes.

Ici, nous montrons l’identification et la quantification de N 1-méthyladénosine, un nucléoside modifié connu, dans des semis de type sauvage Arabidopsis (Col-0) âgés de 2 semaines à titre d’exemple. Le profil de spectrométrie de masse indiqueque les ions produits générés à partir de l’étalon N1-méthyladénosine sont de 150 m/z et 133 m/z(figure 2A),et le même profil est également observé dans l’extraction Col-0<strong class="xfig...

Une méthode précise et reproductible pour la quantification in vivo des nucléosides/nucléotides dans les plantes est décrite ici. Cette méthode utilise une CLHP-MS/MS.

Préparation d’échantillons de plantes pour la mesure de la teneur en nucléosides/nucléotides avec une CLHP-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

Les nucléosides et les nucléotides sont des composants métaboliques centraux dans tous les organismes vivants. Le métabolisme d’entre eux est nécessaire pour le développement cellulaire. Cette approche fournit un outil puissant pour la quantification de ces métabolites.Cette méthode permet une quantification rapide et précise des nucléosides et des nucléotides dans les plantes. Les prétr traitements complets des échantillons et les analyses LC-MS/MS prennent environ deux jours pour une série de 10 à 20 échantillons. Cette méthode peut être appliquée à toutes les plantes et même à d’autres organismes.Changhua Zhu, professeur agrégé du Laboratoire Chen, fera la démonstration de la procédure. Pour faire pousser les plantes, assurez-vous que les graines d’Arabidopsis sont stérilisées dans de l’éthanol à 70% pendant 10 minutes et semées sur des plaques de gélose avec 1/2 de force murashige et Skoog nutriments. Incuber les plaques dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 48 heures, puis les transférer dans une chambre de croissance contrôlée sous 16 heures de lumière à 22 degrés Celsius et huit heures d’obscurité à 20 degrés Celsius.Récoltez 100 milligrammes de semis de deux semaines et congelez-les dans de l’azote liquide pour l’extraction des métabolites. Broyer 100 milligrammes de tissus végétaux congelés avec sept à huit billes d’acier dans un mélangeur pré-refroidi pendant cinq minutes à une fréquence de 60 Hertz. Préparer la solution d’extraction, qui contient du méthanol, de l’acétonitrile et de l’eau dans un rapport de deux à deux pour un.Ressusciter les matériaux homogénéisés avec un millilitre de la solution d’extraction. Centrifuger la solution résultante à 12 000 XG pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis transférer 0,5 millilitres de la suspension dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et le congeler dans de l’azote liquide. Évaporer l’échantillon congelé dans un lyophilisateur et le remettre en suspension dans 0,5 millilitre d’acétonitr à 5 % et à 95 % d’eau.Centrifuger la solution obtenue à 4 000 XG pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Chargez le surnageant dans un flacon pour la mesure LC-MS/MS. Préparer un tampon acétate d’ammonium de 10 millimolaires en dissolvant 1,5 gramme d’acétate d’ammonium dans deux litres d’eau double désionisée.Ajuster le pH à 9,5 avec 10% d’ammonium et d’acétate d’acide. Préparez deux litres d’ultrapure 100% méthanol pour la mesure des nucléosides, puis préparez deux litres d’acétonitrile ultrapur pour la mesure des nucléotides. Injecter 0,02 millilitres de l’extraction de métabolite prétraité de chaque échantillon précédemment préparé dans un système HPLC avec des pompes binaires couplées à un spectromètre de masse triple quadruple.Pour générer les courbes d’étalonnage standard, regroupez six extractions d’échantillons et vortex le mélange, puis aliquotez-le à six extractions à nouveau pour obtenir chaque fond. Ajoutez six concentrations différentes de chaque étalon à ces six extractions respectivement et injectez-les une par une dans le système HPLC. Enregistrez les zones de pointe de chaque étalon à différentes concentrations via les transitions de masse.Ce protocole a été employé pour identifier et quantifier N1-methyladenosine, un nucléoside modifié connu, dans des semis de type sauvage d’Arabidopsis vieux de deux semaines. Le profil de spectrométrie de masse a indiqué que les ions produits générés à partir de la norme N1-méthyladénosine sont à des rapports de 150 et 133 MZ. Et le même profil a été observé dans l’extraction zéro colombie.En raison de la grande abondance de l’ion produit de 150 MZ, la transition de masse de 282,1 à 150 a été sélectionnée pour l’identification de la N1-méthyladénosine. Le temps de rétention du pic cible était de 7,05 minutes. Identique au temps de rétention de la norme N1-méthyladénosine.Une série de concentrations de normes de N1-méthyladénosine a été ajoutée dans six extractions d’échantillons. Les échantillons types ont été injectés dans la LC-MS/MS et les zones de pointe accrues de N1-méthyladénosine ont été tracées par rapport aux concentrations nominales des étalons. Les six extractions de fond égales sont importantes pour créer une courbe d’étalonnage précise et reproductible pour la quantification.Notre méthode peut être appliquée pour explorer les voies métaboliques chez les plantes. En comparant les profils de métabolite entre les mutants de type sauvage et de perte de fonction, le flux métabolique a pu être dessiné.

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Radical basé sur la chimie biomimétique a été appliquée à la construction-up bibliothèques nécessaires pour le développement de biomarqueurs.

Radicaux libres en biologie chimique: de Comportement chimique au développement de biomarqueurs

Le protocole décrit ici vise à expliquer et abréger les nombreux obstacles sur le chemin de la route complexe menant à nucléosides triphosphates modifiés. Par conséquent, ce protocole facilite à la fois la synthèse de ces éléments constitutifs activés et leur disponibilité pour les applications pratiques.

Nucléosidiques Triphosphates - de la synthèse à caractérisation biochimique

La biomasse végétale offre une ressource renouvelable pour plusieurs produits, y compris le carburant, l'alimentation, la nourriture et une variété de matériaux. Dans cet article, nous étudions les propriétés de l'arbre de tabac (Nicotiana glauca) et de peupliers de sources appropriées pour un pipeline de bioraffinerie.

Transcription et profilage des métabolites pour l&#39;évaluation des arbres tabac et le peuplier comme matière première pour l&#39;industrie de la bioéconomie

Le protocole décrit ici représente une méthode simple et reproductible qui utilise la chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) pour mesurer le métabolisme des purines sur des cellules de leucémie lymphoïde chronique (LLC) cultivées dans différentes conditions.

base HPLC-Assay pour surveiller extracellulaires Nucleotide / nucléosidiques Métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines

Les auteurs décrivent un protocole pour identifier des protéines de liaison à l’ARN et de cartographier leurs régions de liaison à l’ARN dans des cellules vivantes psoralen médiée par les UV et spectrométrie de masse.

Préparation de l’échantillon d’Identification basé sur la spectrométrie de masse des régions de liaison à l’ARN

Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.

Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

Nous présentons ici un protocole pour une purification efficace seule étape de l’humain sans balise active dix-onze translocation-2 (TET2) 5-méthylcytosine dioxygénase utilisant la chromatographie échangeuse d’ions et son dosage à l’aide d’une masse en tandem par chromatographie liquide spectrométrie (LC-MS/MS)-approche de base.

Purification efficace et LC-MS/MS-based test développement pour dix-onze Translocation-2 5-méthylcytosine Dioxygenase

Nous décrivons ici les méthodes de quantification sensible et précise des lésions 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-désoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-étheno-2 '-désoxyadénosine (1,n6-Dado) et 1,n2- étheno-2 '-désoxyguanosine (1,N-2dguo) dans l’ADN. Les méthodes ont été appliquées à l’évaluation des effets des particules fines ambiantes (PM2,5) dans les tissus (poumons, foie et rein) des souris A/J exposées.

Quantification de trois lésions de l’ADN par spectrométrie de masse et évaluation de leurs niveaux dans les tissus de souris exposés à des particules fines ambiantes

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour une méthode de séquençage basée sur la LC-MS qui peut être utilisée comme méthode directe pour séquencer l’ARN court (&lt;35 nt par exécution) sans intermédiaire d’ADNc, et comme méthode générale pour séquencer différentes modifications nucléotidiques dans une seule étude avec une précision de base unique.

2D-HELS MS Seq : une méthode générale basée sur LC-MS pour le séquençage direct et de novo de mélanges d’ARN avec différentes modifications nucléotidiques

Dans ce protocole, nous présentons un flux de travail optimisé, qui combine une préparation efficace et rapide des échantillons de nombreux échantillons. En outre, nous fournissons un guide étape par étape pour réduire les variations analytiques pour l’évaluation à haut débit des études GWAS métaboliques.

Études d’association multi-omiques à grande échelle à l’échelle du génome (Mo-GWAS): Lignes directrices pour la préparation et la normalisation des échantillons

Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN représentent une couche de régulation de la traduction sous-étudiée qui a récemment été liée à la plasticité du système nerveux central. Ici, la préparation des échantillons et l’approche de chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem sont décrites pour la caractérisation simultanée de nombreuses modifications de l’ARN dans des neurones uniques.

Caractérisation des modifications de l’ARN dans des neurones uniques à l’aide de la spectrométrie de masse

Apprenez une méthode CLHP-MS/MS pour quantifier les nucléosides et nucléotides dans les plantes. Cette approche précise permet d'analyser 10 à 20 échantillons en deux jours et s'applique à divers organismes.

Préparation d’échantillons de plantes pour la mesure de la teneur en nucléosides/nucléotides avec une CLHP-MS/MS

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