Name: Infection récurrente des voies urinaires à Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis Exposition à la vessie chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Découvrez un modèle murin d'infection urinaire récurrente par Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de résurgence bactérienne et les interactions urogénitales.

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Les auteurs remercient Lynne Foster pour son assistance technique dans les expériences d’infection, James Fitzpatrick du Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) pour l’accès au SEM, Scott Hultgren pour la souche UTI89kanR UPEC et David Hunstad pour la lecture critique du manuscrit.
Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE - 1143954), par le Center for Women’s Infectious Disease Research de la Washington University School of Medicine (Pilot Research Award to NMG), par l’American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) et #14POST20020011 (NMG), et par les National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) et NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, projet II PI:ALL) et K01 DK110225-01A1 (NMG). Certaines des études sur les animaux ont été réalisées dans une installation soutenue par la subvention C06 RR015502 du NCRR. Le Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; où sem a été effectué) et MSJ ont été soutenus par la Washington University School of Medicine, le Children’s Discovery Institute de l’Université de Washington et le St. Louis Children’s Hospital (CDI-CORE-2015-505), la Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) et le National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts lié à cette étude.

La première étape critique de ce modèle consiste à identifier les souris qui n’ont pas éliminé la bactériurie UPEC au cours de la phase primaire d’infection urinaire. Ces souris doivent être retirées de l’expérience car elles confondraient autrement les taux de bactériurie UPEC après l’exposition à G. vaginalis. Après l’inoculation initiale de l’UPEC, l’urine doit être prélevée chaque semaine pour surveiller la clairance bactérienne. Environ 65 à 80 % des souris C57BL/6 élimineront une infection par UTI89kanR dans les 4 semaines. D’autres souches de souris consanguines ont des propensions différentes pour le dégagement UPEC42,43 et la formation de réservoirs et peuvent donc ne pas convenir à ce modèle. Le deuxième point critique est que des études empiriques ont déterminé que deux inoculations séquentielles de G. vaginalis (soit 12 h ou 1 semaine d’intervalle) sont nécessaires pour déclencher une émergence significative du réservoir au-dessus de l’émergence spontanée de fond qui se produit chez les souris témoins exposées uniquement au PBS. D’autres durées entre les deux expositions séquentielles n’ont pas été testées, mais pourraient donner des résultats similaires. Il est important de noter qu’une réduction des titres de vessie UPEC n’a été observée que dans le modèle dans lequel les expositions à G. vaginalis ont été données à 1 semained’intervalle 39. Bien que plus de deux expositions puissent être administrées, les preuves empiriques suggèrent que le cathétérisme répété à lui seul augmente l’émergence, ce qui peut confondre l’interprétation des résultats ou nécessiter un plus grand nombre d’animaux pour distinguer les différences entre les groupes d’exposition et les témoins. Enfin, la méthode de fixation de la vessie in situ comporte plusieurs étapes critiques. Une certaine habileté est nécessaire pour s’assurer que le fixateur reste à l’intérieur des vessies serrées. Les vessies dégonflées seront plus difficiles à imager par SEM. Il est également essentiel d’être très doux lors de l’inoculation du fixateur dans la vessie, car gratter l’urothélium avec le cathéter contenant un fixateur peut induire une exfoliation urothéliale indépendamment de ce qui est déclenché par G. vaginalis. Toutes les concentrations mentionnées dans le cocktail fixateur sont des concentrations finales. Des rapports inappropriés de ceux-ci peuvent entraîner une fixation insuffisante et un gonflement ou un rétrécissement des cellules. Les fixateurs doivent être réchauffés à des températures physiologiques pour éviter les chocs thermiques dans les cellules et les tissus. Le réchauffement apporte également une légère amélioration du taux de diffusion des fixateurs à travers les membranes plasmiques. Bien que la coloration à l’osmium puisse souvent être omise pour les échantillons préparés pour l’analyse SEM, il s’agit d’une étape essentielle de ce protocole pour stabiliser les lipides et prévenir la fissuration des membranes cellulaires lors du séchage aux points critiques.
Ce protocole peut être modifié pour tester d’autres souches UPEC et/ou G. vaginalis pour leur capacité à former des réservoirs et à déclencher leur émergence, respectivement. D’autres facteurs expérimentaux peuvent également être ajoutés, tels que l’exposition à d’autres bactéries vaginales (par exemple, Lactobacillus crispatus PVAS100) ou G. vaginalis tué par la chaleur, dont aucun ne démontre une pathologie dans ce modèle39. Lors de la sélection d’autres souches bactériennes à tester, il est important de démontrer une croissance constante de sorte qu’une concentration d’inoculum standard puisse être utilisée dans toutes les expériences. La croissance de JCP8151BSmR a été optimisée dans une chambre anaérobie. Cette souche pourrait probablement être cultivée dans un système GasPak anaérobie, mais cela nécessiterait une optimisation pour assurer une croissance bactérienne robuste. Enfin, il peut être possible de modifier le timing de certaines étapes du modèle. Par exemple, l’urine peut être recueillie à des moments plus précoces pendant la phase de formation du réservoir UPEC pour surveiller les réponses de l’UFC ou de l’hôte. Un effet indésirable de la collecte d’échantillons d’urine à des moments précoces (3, 6, 12 hpi) sur la progression de l’infection ou l’établissement de réservoirs n’a pas été observé dans ce modèle. L’émergence de réservoirs UPEC a été signalée après deux doses de JCP8151BSmR administrées 12 h ou 1 semaine, mais d’autres intervalles de temps n’ont pas encore été testés. Il peut également être possible de réduire la durée totale du modèle en réduisant la phase de formation du réservoir UPEC à 2 semaines (au lieu de 4 semaines), car de nombreuses souris éliminent la bactériurie à ce moment-là. Des études antérieures portant sur l’émergence de l’UPEC après l’exposition de la vessie à des exfoliants chimiques ont utilisé une phase de formation de réservoir UPEC de 1 ou 2 semainesen phase 17,18. Cependant, la diminution du temps nécessaire à l’élimination de la bactériurie UPEC peut se faire au prix d’exiger que davantage d’animaux soient éliminés de l’expérience. Enfin, l’analyse SEM de la vessie peut être effectuée à des moments supplémentaires pour observer la durée de l’effet de G. vaginalis sur l’urothélium.
En ce qui concerne le dépannage, il y a quelques considérations importantes spécifiquement en ce qui concerne l’analyse SEM de la vessie. Selon le fond de souris utilisé et la quantité d’inflammation présente, certaines vessies présenteront des parois très minces. Ces vessies ont tendance à s’enrouler davantage pendant le séchage des points critiques et peuvent donner une forme de coquille de cauris. Si cela se produit, la meilleure méthode consiste à couper la vessie en forme de coquille en deux le long de l’interface recourbée, puis une deuxième fois pour enlever la majeure partie du tissu en surplomb. La coupe fonctionne mieux avec une lame de rasoir à double tranchant revêtue de PTFE. L’excès de graisse peut parfois se solubiliser pendant les étapes de coloration à l’osmium. Cela peut entraîner des gouttelettes de graisse insolubles indésirables qui peuvent ne pas se laver pendant les étapes de rinçage et de déshydratation et qui peuvent se déposer à la surface de la vessie lors du séchage ultérieur. Ces gouttelettes peuvent apparaître sous la forme de petites sphères ou de structures en forme de disque dispersées sur l’échantillon (Figure 4D). Cela peut être atténué en s’assurant que le plus de tissu adipeux possible est retiré autour de la vessie. Le platine peut être substitué au revêtement à l’iridium, mais les épaisseurs doivent être réduites au minimum pour réduire le masquage des détails structurels fins. L’utilisation d’une étape rotative pendant le revêtement est fortement recommandée.
Une limitation de ce modèle est qu’il nécessite un grand nombre de souris. Seulement 65 à 80 % des souris C57BL/6 élimineront leur bactériurie UPEC et conviendront à l’inoculation ultérieure de G. vaginalis ou de PBS (voir la figure 2C). Pour obtenir 10 à 12 souris par groupe (inoculation de G. vaginalis vs PBS), environ 30 souris doivent être initialement infectées par l’UPEC. En outre, de multiples expériences sont probablement nécessaires pour obtenir les répliques biologiques nécessaires pour détecter la signification statistique. Lorsque les expositions ont été séparées de 1 semaine, l’émergence de l’UPEC s’est produite chez 14 % des souris exposées au PBS (figure 3B). Ainsi, la détection d’une augmentation significative de l’INFECTION URINAIRE À L’UPEC chez les souris exposées à G. vaginalis par rapport aux témoins PBS (puissance à 0,8; alpha = 0,05 [unilatérale]) nécessite de tester un total cumulatif d’au moins 40 souris pour chaque groupe d’exposition. Une considération supplémentaire est que ces expériences sont coûteuses et nécessitent beaucoup de main-d’œuvre. Les souris doivent être surveillées chaque semaine pour la clairance UPEC et le cours temporel expérimental est de 4-5 semaines selon que G. vaginalis est administré deux fois dans un délai de 12 heures ou deux fois à 1 semaine d’intervalle. Le SEM est exigeant en main-d’œuvre et peut être coûteux, en fonction de la disponibilité du microscope et des frais de service. La préparation de la vessie entière pour le SEM fournit un matériel abondant pour l’analyse, mais l’inconvénient est que l’analyse de chaque vessie peut prendre beaucoup de temps. Ainsi, il est probable que seul un nombre limité de vessies peut être analysé par SEM par rapport au nombre plus élevé d’animaux utilisés pour les titres d’urine et de tissu. En outre, l’obtention d’images de haute qualité des surfaces incurvées des « tasses » de la vessie nécessite des compétences en raison des ombres qui peuvent entraver la visibilité. Bien que le SEM de la vessie soit un outil utile pour visualiser l’exfoliation urothéliale, cette méthode est en grande partie qualitative. Étant donné que l’échantillon est fixé dans une forme ronde et qu’en raison de l’utilisation de glutaraldéhyde dans le fixateur, il n’est pas possible de dépister les bactéries exprimant par fluorescence par microscopie optique. Les colorants immunocolorants et chimiques sont incompatibles avec ce processus en raison de l’utilisation de glutaraldéhyde qui réticule la plupart des antigènes et de l’osmium et qui masquera les sites antigéniques et assombrira les tissus. Cela dit, la technique SEM est utile pour les paramètres qui peuvent être évalués quantitativement sans l’utilisation de sondes supplémentaires, telles que la taille des cellules48,49.
Ce modèle offre plusieurs avantages au-delà des méthodes décrites précédemment. Il permet d’examiner les mécanismes de l’UPEC rUTI causés par l’émergence des réservoirs de la vessie, par opposition à la réintroduction dans la vessie à partir d’une source extérieure. D’autres modèles d’infection urinaire r due à l’émergence de réservoirs de la vessie utilisent des agents chimiques (sulfate de protamine ou chitosane) pour provoquer une exfoliation urothéliale17,18, qui ne serait pas un déclencheur de l’infection urinaire chez les femmes. G. vaginalis est une bactérie urogénitale répandue qui a été détectée dans l’urine recueillie directement de la vessie par cathétérisme ou aspiration suprapubienne chez certaines femmes23,26. Ce fait, associé à l’association connue entre la VB (dans laquelle G. vaginalis envahit le vagin) et l’infection urinaire, suggère que G. vaginalis est un déclencheur cliniquement plausible de l’infection urinaire. Enfin, la méthode de fixation in situ de la vessie préserve l’ultrastructure de la vessie et limite les dommages, en veillant à ce que les couches de la vessie ne se séparent pas les unes des autres. Les méthodes précédentes de visualisation de l’urothélium demandaient traditionnellement à l’utilisateur de récolter, de couper en deux, d’étirer et d’épingler la vessie de manière aseptique sur un plateau de dissection avant d’immerger la vessie étirée dans le fixateur48. Cette méthode donne un échantillon très plat mais n’assure pas un étirement uniforme ou naturel du tissu et peut entraîner des zones trop et sous étirées (entraînant un tissu très ridé) et peut provoquer une séparation de la couche de la vessie. De plus, ces manipulations physiques de la vessie pour étirer et épingler le tissu peuvent causer des dommages, y compris l’exfoliation urothéliale. Une autre méthode consiste à immerger les vessies intactes dans un fixateur avant de les incorporer dans de la paraffine et d’acquérir des sections minces avec un microtome. Les sections minces sont inestimables pour les expériences d’immunohistochimie visant à examiner la localisation des bactéries et des protéines hôtes, mais une section mince ne permet pas de visualiser la surface urothéliale. Cette méthode SEM permet d’examiner la surface de toute la vessie en même temps.
Comme décrit, les applications futures de ce modèle comprennent l’essai d’autres souches UPEC pour déterminer si elles forment des réservoirs intracellulaires et le test d’autres souches de G. vaginalis pour évaluer si elles provoquent une exfoliation et l’émergence UPEC pour provoquer une infection urinaire. D’autres souches de souris au-delà des souris C57BL /6 peuvent également être testées, bien que les souris ayant une forte propension à développer une cystite chronique (comme les souris sur le fond C3H) ne soient pas recommandées, car trop de souris devraient être éliminées de l’expérience. Un avantage supplémentaire des souris C57BL/6 est que de nombreuses souches génétiques knockout sont disponibles dans le commerce. De telles souches offrent l’occasion d’interroger les facteurs hôtes impliqués dans la formation et/ou l’émergence des réservoirs.

Les infections des voies urinaires (IVU) imposent un fardeau important en matière de soins de santé dans le monde entier, affectant la qualité de vie de millions de personnes chaque année, en particulier les femmes1. Escherichia coli uropathogène (UPEC) est la cause la plus fréquente d’infection urinaire1. De nombreux patients (environ 20 à 30%) qui développent une infection urinaire connaîtront une infection urinaire récurrente (rUTI) dans les 6 mois malgré la clairance de l’infection initiale médiée par les antibiotiques2. Malheureusement, jusqu’à 5% des femmes préménopausées souffrent de 3 rUTI ou plus chaque année 3,4. Les épisodes séquentiels d’infection urinaire r peuvent être causés par la persistance de la même souche UPEC du cas index 5,6,7,8. Les données provenant d’échantillons humains et de modèles murins suggèrent que l’infection urinaire r de même souche pourrait être causée par l’UPEC résidant dans des réservoirs de repos dans la vessie. Chez l’homme, des CEPU ont été détectés dans des cellules épithéliales et des biopsies de la vessie de patients atteints d’infection urinaire 9,10,11,12,13. Des études chez des souris C57BL/6 ont démontré que certaines souches d’UPEC peuvent établir des réservoirs intracellulaires au repos dans la vessie, tels que détectés par microscopie à fluorescence et par homogénéisation et culture de tissu vésical, qui sont maintenus pendant des mois après la résolution de la bactériurie 14,15,16. Le traitement de la vessie avec des agents qui induisent l’exfoliation de l’épithélium de la vessie (urothélium), par exemple le sulfate de protamine17 ou le chitosane18, déclenche l’émergence de l’UPEC des réservoirs pour provoquer une infection urinaire. Ces données suggèrent que chez les femmes hébergeant des réservoirs UPEC de la vessie d’une infection antérieure, les expositions à la vessie qui conduisent à l’exfoliation urothéliale peuvent déclencher une rUTI.
Il existe de plus en plus de preuves que le microbiote vaginal contribue à l’infection des voies urinaires19,20. Gardnerella vaginalis est un membre fréquent du microbiote vaginal et urinaire 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Dans le vagin, la présence de niveaux élevés de G. vaginalis est associée à une dysbiose microbienne connue sous le nom de vaginose bactérienne (BV), qui affecte environ 30% des femmes 30,31,32. Les femmes atteintes de VB courent un risque plus élevé d’infection urinaire que les femmes ayant une communauté vaginale dominée par Lactobacillus 33,34,35,36,37. Chez les modèles murins, G. vaginalis provoque une exfoliation épithéliale à la fois dans le vagin38 et dans la vessie39. Chez les souris C57BL/6 hébergeant des réservoirs vésicaux UPEC, deux expositions vésicales séquentielles à G. vaginalis - mais pas au PBS - entraînent une réémergence de l’UPEC des réservoirs pour provoquer une infection urinaire urinaire à l’UPEC. L’émergence est mise en évidence par l’apparition de titres UPEC dans l’urine de souris qui avaient précédemment résolu la bactériurie UPEC et une diminution subséquente des titres d’homogénat de la vessie UPEC au sacrifice par rapport aux animaux témoins exposés au PBS39. Fait intéressant, il n’y a pas de colonisation durable par G. vaginalis dans la vessie. Dans la grande majorité des cas, deux expositions courtes, chacune avec moins de 12 (h) de G. vaginalis viable dans l’urine, sont suffisantes pour provoquer une exfoliation urothéliale et favoriser l’infection urinaire.
Ce protocole décrit un modèle murin d’infection urinaire r causée par l’UPEC résidant dans les réservoirs intracellulaires de la vessie, en utilisant l’inoculation de la vessie de G. vaginalis pour déclencher la récidive. L’avancée obtenue par ce modèle est que G. vaginalis est un déclencheur biologique cliniquement pertinent de l’infection urinaire par rapport aux agents chimiques précédemment utilisés. De plus, la survie relativement courte de G. vaginalis dans les voies urinaires de la souris permet d’examiner l’impact des expositions microbiennes transitoires sur l’urothélium, comme cela pourrait se produire après une activité sexuelle. En plus de décrire le modèle rUTI, ce protocole décrit également des méthodes de cytologie urinaire et de fixation in situ de la vessie et d’imagerie de l’urothélium par microscopie électronique à balayage (MEB).
Ce protocole d’infection urinaire UPEC récurrente induite par G. vaginalis utilise la souche UPEC UTI89 portant une cassette de résistance à la kanamycine (UTI89kanR)40. Toutes les souches d’UPEC testées n’ont pas été en mesure de former des communautés bactériennes intracellulaires au cours de la phase d’infection aiguë chez les souris41 et on ne sait pas encore si toutes les souches d’UPEC ont la capacité de former des réservoirs intracellulaires latents. La formation de réservoirs doit être confirmée avant l’utilisation d’autres souches d’UPEC dans le modèle. Ce protocole utilise un isolat spontané de G. vaginalis résistant à la streptomycine, JCP8151BSmR38. L’induction de rUTI par JCP8151BSmR nécessite deux inoculations séquentielles de G. vaginalis , administrées soit à 12 h, soit à 7 jours (j) d’intervalle39. Il reste à déterminer si d’autres souches de G. vaginalis induisent ou non une exfoliation et/ou une infection urinaire urinaire à l’UPEC. Il est essentiel d’utiliser des souches UPEC et G. vaginalis présentant une résistance connue aux antibiotiques (telles que la kanamycine ou la spectinomycine pour l’UPEC et la streptomycine pour G. vaginalis), car des antibiotiques peuvent être ajoutés aux plaques d’agar pour prévenir la croissance du microbiote endogène de souris qui pourrait autrement interférer avec le dénombrement des unités formant des colonies (UFC) pour surveiller l’infection. Ceci est particulièrement important pour la culture d’échantillons d’urine, car l’urine de souris contient souvent d’autres bactéries qui peuvent proliférer sur les plaques de culture sans antibiotiques. L’origine de ces bactéries endogènes dans l’urine de souris est inconnue, mais reflète probablement des bactéries périurétrales et urogénitales détectées lors de la collecte d’urine.
G. vaginalis est une bactérie anaérobie facultative et, par conséquent, ce protocole décrit la croissance de G. vaginalis JCP8151BSmR dans une chambre anaérobie. Si une chambre anaérobie n’est pas disponible, d’autres méthodes pour maintenir les conditions de croissance anaérobie (comme une poche GasPak dans un récipient hermétique) peuvent être utilisées. Alternativement, certaines souches de G. vaginalis (y compris JCP8151BSmR) se développeront dans un incubateur de culture tissulaire standard (5% de CO2). Tout comme l’utilisation de souches de G. vaginalis autres que JCP8151BSmR nécessite des tests pour s’assurer que les bactéries se comportent de manière similaire dans ce modèle, l’évolution des conditions de croissance nécessite la détermination empirique des durées idéales de culture (sur plaques et dans les liquides) et des équivalents de densité optique (OD) 600 pour atteindre les concentrations d’inoculum viables souhaitées. De plus, on ne sait pas si les conditions de croissance influencent la pathobiologie de G. vaginalis.
Enfin, lorsqu’ils envisagent d’utiliser ce modèle, les chercheurs doivent savoir qu’il peut nécessiter un plus grand nombre d’animaux par groupe que les modèles murins UTI typiques. C’est en partie parce que l’induction de l’infection urinaire nécessite que les souris résolvent la bactériurie UPEC causée par l’infection initiale de la vessie. Ainsi, toute souris qui ne parvient pas à éliminer la bactériurie (un phénotype généralement révélateur d’une infection rénale en cours) n’est pas incluse dans la phase rUTI du protocole. Le nombre de souris nécessaires pour alimenter ces études est également influencé par le taux d’émergence « spontanée » de l’UPEC dans l’urine (12-14% en moyenne). Enfin, différentes souches de souris ont des propensions différentes à développer une bactériurie chronique par rapport à la formation de réservoir intracellulaire42,43. Si vous utilisez des souches de souris autres que C57BL/6 dans ce modèle, il faut confirmer que les animaux développent des réservoirs intracellulaires UPEC quiescents.

<table><tbody><tr><td>Aiguilles 30G x 1/2</td><td>BD</td><td>305106</td><td>pour cathéters</td></tr><tr><td>Pince droite 5 1/2" Hemostat</td><td>McKesson</td><td>487377</td><td>in situ fixation de la vessie</td></tr><tr><td>ACE 600 Revêtement par pulvérisation cathodique</td><td>Leica</td><td></td><td>SEM traitement d’échantillons</td></tr><tr><td>en aluminium</td><td>Ted Pella</td><td>16111</td><td>Traitement d’échantillons MEB</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>EMS</td><td>12340</td><td>in situ Fixation de la vessie</td></tr><tr><td>Adhésif Carbone conducteur Tab&nbsp ;</td><td>Ted Pella</td><td>16084-1</td><td>Traitement d’échantillons MEB</td></tr><tr><td>Peinture argentée conductrice</td><td>Ted Pella</td><td>16034</td><td>Traitement d’échantillons MEB</td></tr><tr><td>CPD 300 Séchoir à point critique</td> Traitement <td>d’échantillons</td><td>Leica</td><td></td> SEM</tr><tr><td>Clip métallique Cytofunnel Simport</td><td></td><td>M964B</td><td>Analyse d’urine</td></tr><tr><td>Ethanol</td> EMS <td>15050</td><td>Traitement d’échantillons MEB</td><td></td></tr><tr><td>Glucose& nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>pour NYCIII G. vaginalis milieu</td></tr><tr><td>de croissance glutaraldéhyde</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>in situ fixation de la vessie</td></tr><tr><td>Hema 3 kit de coloration</td><td>Fisher</td><td>23123869</td><td>cytospun analyse d’urine</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro&nbsp ;</td><td>25-060-Cl</td><td>pour NYCIII G. vaginalis milieu</td></tr><tr><td>de croissance iridium</td><td>Ted Pella</td><td>91120</td><td>MEB traitement d’échantillons</td></tr><tr><td>isofluorane</td><td></td><td></td><td>souris anesthésie</td></tr><tr><td>kanamycine</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>ajouter à l’UPEC LB plaques sélectives (50 ug/mL)</td></tr><tr><td>Gélose Luria-Bertani</td><td>BD</td><td>DF0445174</td><td>plaques</td></tr> <tr><td>de croissance UPECBouillon Luria-Bertani</td><td>BD</td><td>DF0446173</td><td>UPEC Milieux de croissance</td></tr><tr><td>Merlin FE-SEM</td><td>Zeiss</td><td></td> microscope <td>électronique à balayage</td></tr><tr><td>Milli-Q Purificateur d’eau Millipore</td><td></td><td>IQ-7000</td><td>MEB Traitement d’échantillons</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>pour NYCIII G. vaginalis milieux de croissance</td></tr><tr><td>Olympus Vanox AHBT3</td><td>microscope Olympus</td><td></td><td>cytospun</td></tr><tr><td>osmium tétroxyde</td><td>EMS</td><td>19170</td><td>MEB traitement</td></tr><tr><td>d’échantillons paraformaldéhyde</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>in situ fixation de vessie</td></tr><tr><td>tube en polyéthylène</td><td>Intramedic</td><td>427401</td><td>pour cathéters</td></tr><tr><td>Proteose Peptone #3&nbsp ;</td><td>Fisher&nbsp ;</td><td>DF-122-17-4</td><td>pour NYCIII G. vaginalis milieu de croissance</td></tr><tr><td>Lame de rasoir à double tranchant enduite de PTFE</td><td>vessies coupantes EMS</td><td></td><td>72000</td> pour MEB</tr><tr><td>Cytocentrifugeuse Shandon Thermo</td><td>Scientific</td><td>A78300002</td><td>cytospun Filtre à cyto-entonnoir</td></tr><tr><td>Shandon Simport</td><td></td><td>M965FWDV</td><td>cytospun analyse d’urine</td></tr><tr><td>Shandon Double cytofunnel</td><td>Simport</td><td>M964-1D</td><td>cytospun analyse d’urine</td></tr><tr><td>Shandon double cytolames (enrobées)</td><td>Thermo Scientific</td><td>5991055</td><td>cytospun analyse d’urine</td></tr><tr><td>cacodylate de sodium trihydraté</td><td>EMS</td><td>12310</td><td>in situ spectrophotomètre de fixation de la vessie</td></tr><tr><td></td><td>BioChrom</td><td>80-3000-45</td> mesurant la streptomycine <td>bactérienne OD600</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td>ajouter à G. vaginalis NYCIII plaques sélectives (1 mg/mL)</td></tr><tr><td>seringue à embout glissant de tuberculine</td><td>BD</td><td>309659</td><td>pour cathéters</td></tr><tr><td>Extrait de levure&nbsp ;</td><td>Fisher</td><td>DF0127-17-9</td><td>pour milieux de croissance NYCIII G. vaginalis</td></tr></tbody></table>

infection récurrente des voies urinaires à escherichia coli déclenchée par gardnerella vaginalis exposition à la vessie chez la souris

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Les infections urinaires récurrentes (rUTI) causées par Escherichia coli uropathogène (UPEC) sont courantes et coûteuses. Des articles précédents décrivant des modèles d’infection urinaire chez des souris mâles et femelles ont illustré les procédures d’inoculation bactérienne et de dénombrement dans l’urine et les tissus. Au cours d’une infection initiale de la vessie chez des souris C57BL/6, l’UPEC établit des réservoirs latents à l’intérieur des cellules épithéliales de la vessie qui persistent après la clairance de la bactériurie UPEC. Ce modèle s’appuie sur ces études pour examiner les infections urinaires causées par l’émergence de l’UPEC à partir de réservoirs de vessie latente. La bactérie urogénitale Gardnerella vaginalis est utilisée comme déclencheur de l’infection urinaire dans ce modèle, car elle est fréquemment présente dans les voies urogénitales des femmes, en particulier dans le contexte de la dysbiose vaginale associée à une infection urinaire. En outre, une méthode de fixation in situ de la vessie suivie d’une analyse par microscopie électronique à balayage (MEB) du tissu vésical est également décrite, avec une application potentielle à d’autres études impliquant la vessie.

Après l’inoculation, les titres UPEC sont détectables dans l’urine (Figure 2B). Le fait de ne pas plaquer les échantillons d’urine sur des milieux sélectifs contenant de la kanamycine entraînera probablement une prolifération de microbiote endogène de souris contaminant l’urine. Le niveau de bactériurie UPEC sera probablement élevé le jour 1 et pourrait augmenter au cours de la première semaine avant de diminuer à des moments ultérieurs (Figure 2C). Environ 65 à 80 % des souris n’auront pas d’ECI détectable dans l’urine de 28 dpi (Figure 2C, cercle vert). Ces souris peuvent être utilisées dans les étapes suivantes du modèle. Les souris qui restent bactériides (Figure 2C, ellipse rouge) doivent être éliminées de l’expérience.
Deux expositions séquentielles à G. vaginalis à 12 h (figure 3A) ou à 1 semaine d’intervalle (figure 3B) entraînent l’émergence d’UPEC à partir de réservoirs intracellulaires pour provoquer une bactériurie récurrente. Le niveau de bactériurie UPEC (test de Mann-Whitney) et la fraction de souris présentant upEC rUTI (test exact de Fisher) sont significativement plus élevés chez les souris exposées à G. vaginalis par rapport au groupe témoin PBS. L’analyse cytologique de l’urine détecte les PMN dans l’urine de souris exposées à G. vaginalis qui présentaient une émergence UPEC (Figure 3C). Dans le modèle avec deux expositions données à 1 semaine d’intervalle, les titres UPEC dans le tissu vésical sont plus faibles chez les souris exposées à G. vaginalis que chez les souris PBS (Figure 3D), probablement en raison de l’émergence d’UPEC dans les réservoirs et de la clairance ultérieure.
La visualisation du tissu vésical fixé in situ par SEM révèle de grandes cellules urothéliales parapluie superficielles tapissant la surface de la vessie chez des souris témoins exposées uniquement au PBS (Figure 4A). L’exfoliation urothéliale est mise en évidence par une perte de cellules parapluie superficielles, révélant des cellules épithéliales transitionnelles sous-jacentes plus petites chez des souris exposées à G. vaginalis (Figure 4B). Tôt après l’inoculation d’UPEC lors de l’établissement de réservoirs intracellulaires, les UPEC sont visibles sur l’urothélium et s’infiltrent dans les cellules exfoliantes (Figure 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> Graphique 2. Surveillance des titres UPEC dans l’urine pendant la phase 1 (formation du réservoir). (A) Schéma du placage des unités formant des colonies (UFC). (B) Image représentative des titres UPEC dans l’urine sur LB+kanamycine. Les cercles noirs indiquent les taches d’échantillon d’urine qui doivent être comptées pour calculer l’UFC / mL. (C) Évolution temporelle de la bactériurie UPEC chez les souris C57BL/6. Chaque ligne représente une souris individuelle, traçant les titres d’urine UPEC au fil du temps. La ligne pointillée indique la limite de détection (1000 UFC/mL). L’ellipse rouge indique quatre souris (sur 20) qui n’ont pas réussi à résoudre la bactériurie UPEC et ne seraient donc pas utilisées pour le modèle rUTI induit par G. vaginalis. Inversement, le cercle vert indique les souris qui ont résolu la bactériurie UPEC et sont passées aux phases suivantes. D) Tableau des données utilisées pour générer un graphique dans le panneau C. Jaune, UFC détectable; vert, pas d’UFC. (E) Randomisation des souris en groupes d’exposition en fonction du moment où l’UFC UPEC n’a plus été détectée dans l’urine (« Jour résolu »). Les numéros de souris dans la colonne de gauche du panneau D sont les mêmes que ceux indiqués dans le panneau E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> Graphique 3. G. vaginalis déclenche UPEC rUTI. Titres UPEC dans l’urine après deux expositions séquentielles des voies urinaires au PBS (cercles) ou à G. vaginalis (Gvag; carrés) à 12 h (A) ou 1 semaine (B) d’intervalle. Chaque symbole représente une souris individuelle. Les UPEC CFU/mL les plus élevés détectés chez chaque souris entre 1 et 3 j après la deuxième exposition sont tracés. Les souris sans bactériurie détectable sont tracées à la limite de détection (ligne pointillée). (C) Analyse cytologique urinaire montrant des cellules UPEC (pointes de flèches) et polymorphonucléaires (PMN) (flèches). Barre d’échelle = 20 μm. (D) Titres UPEC dans les tissus vésicaux prélevés 3 d à la suite de deux expositions séquentielles aux voies urinaires séparées de 1 semaine. Chaque symbole représente une souris différente et les zéros sont tracés à la limite de détection (ligne pointillée). Dans A, B et D, les boîtes sont au premier et au troisième quartile avec la médiane marquée et les moustaches de min à max. Tests de Mann-Whitney U * P &lt; 0,05; ** P &lt; 0,01; P &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> Graphique 4. Analyse SEM des vessies fixées in situ. Les vessies ont été prélevées sur des souris 3 h après deux expositions (à 12 h d’intervalle) au PBS (A) ou à G. vaginalis (C). Les lignes pointillées illustrent une seule cellule épithéliale urinaire, qui est plus petite dans les vessies exposées à G. vaginalis parce que les grandes cellules superficielles se sont exfoliées, révélant l’épithélium transitionnel sous-jacent. (B) Vessie collectée 6 h après l’inoculation initiale avec UPEC, au cours de la phase 1 du modèle, montrant une exfoliation urothéliale et une UPEC extracellulaire. (D) Exemple de gouttelettes de graisse insolubles présentes à la surface de la vessie. Les barres d’échelle sont de 20 μm dans les images principales et de 2 μm dans l’encart. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Un modèle murin d’inoculation transurétrale d’E. coli uropathogène (UPEC) pour établir des réservoirs de vessie intracellulaire latents et une exposition ultérieure de la vessie à G. vaginalis pour induire une infection urinaire UPEC récurrente est démontré. Le dénombrement des bactéries, la cytologie de l’urine et la fixation et le traitement in situ de la vessie pour la microscopie électronique à balayage sont également démontrés.

Infection récurrente des voies urinaires à Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis Exposition à la vessie chez la souris

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Les infections récurrentes des voies urinaires sont un grave problème de santé. Ce protocole nous aidera à comprendre comment les expositions de courte durée aux bactéries urogénitales entraînent des dommages à la vessie et déclenchent des infections urinaires récurrentes dues à E. Coli. L’un des avantages de ce modèle est que l’exfoliation de la vessie et les infections urinaires récurrentes sont déclenchées par la bactérie urogénitale Gardnerella vaginalis, qui est souvent abondante chez les femmes qui souffrent d’infections urinaires récurrentes.Commencez par faire passer la souche G. vaginalis d’un stock de congélation à moins 80 degrés Celsius dans une chambre anaérobie. Étalez la bactérie sur une plaque NYCIII sans antibiotiques. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius en anaérobie pendant 24 heures.Dans la chambre anaérobie, inoculez cinq millilitres de milieu anaérobie NYCIII avec une boucle d’un microlitre remplie de cellules de la plaque NYCIII et incubez la culture statiquement à 37 degrés Celsius dans des conditions anaérobies pendant 18 heures. N’incluez pas d’antibiotiques dans le milieu de croissance. Déterminer la DO 600 de la culture à l’aide d’un spectrophotomètre.Ensuite, centrifugez-le à 9 600 fois G pendant une minute et aspirez le support. Remettre en suspension la pastille bactérienne dans le PBS à la concentration souhaitée et diluer et mettre l’inoculum en plaques en série. Ajoutez 10 microlitres d’urine à 90 microlitres de PBS dans une cassette de cytoentonnoir avec un filtre attaché.Placez les cassettes dans la cytocentrifugeuse à l’aide d’une lame et faites-les tourner à 600 à 800 fois G pendant six minutes avec une forte accélération. Après avoir retiré les lames et les avoir laissées sécher pendant la nuit, colorez-les avec un kit de coloration hématologique et analysez-les par microscopie optique pour détecter la présence de PMN et de cellules épithéliales. Une fois la seringue à tige glissante à la tuberculine avec le fixateur, fixez un cathéter à l’extrémité, biseau tourné vers l’opposé des marques de la seringue.Coupez l’excédent de tube à un à deux millimètres de l’extrémité de l’aiguille, en prenant soin de ne pas exposer la pointe de l’aiguille. Agitez la seringue pour éliminer les bulles et poussez le piston pour évacuer l’air. Après avoir anesthésié et sacrifié la souris, une fois les pattes sécurisées, ouvrez la région pelvienne de la souris avec une pince et une paire de ciseaux chirurgicaux pour exposer la vessie.Repoussez soigneusement la graisse adjacente, mais laissez la vessie en place. Tenez la seringue avec la main dominante avec l’aiguille pointée vers le bas. Trempez l’extrémité du cathéter dans un lubrifiant stérile et positionnez l’extrémité du cathéter sur l’ouverture urétrale, en tenant le corps de la seringue à un angle de 30 à 45 degrés sur le corps de la souris.Appliquez une pression vers le bas avec un léger mouvement dans le sens des aiguilles d’une montre et insérez doucement le cathéter dans l’urètre Lorsque l’extrémité du cathéter entre, articulez la seringue vers la queue de la souris tout en continuant à faire glisser le cathéter plus loin dans l’urètre jusqu’à ce que le corps de la seringue soit parallèle à la surface de travail. Toute la tige de l’aiguille du cathéter doit pénétrer dans la souris, en positionnant l’extrémité du cathéter dans la lumière de la vessie. Administrez lentement 50 à 80 microlitres de fixateur, ce qui fait gonfler la vessie comme un ballon.Gardez le cathéter en place et soulevez légèrement la seringue en inclinant l’extrémité vers le haut. De l’autre main, ouvrez un hémostat et glissez une broche sous l’aiguille du cathéter à l’intersection de l’urètre. Fermez partiellement l’hémostat jusqu’à ce qu’il entre en contact avec l’aiguille.Faites glisser doucement l’aiguille du cathéter hors de la vessie tout en serrant et en verrouillant complètement l’hémostat pour éviter la perte du fixateur. Saisissez l’hémostat de manière à ce qu’il soit parallèle à la surface de travail avec la vessie reposant sur le dessus. Soulevez doucement et coupez soigneusement sous l’hémostat pour retirer la vessie avec l’hémostat toujours attaché.Placez la vessie et l’hémostat attaché dans un tube Falcon contenant un fixateur réchauffé. Assurez-vous que la vessie est complètement immergée dans le liquide et qu’elle n’est pas pressée contre les parois du tube. Afin d’imager la vessie par microscopie électronique à balayage, coupez sagittairement en deux avec une lame de rasoir ou un scalpel propre à double face et faites une deuxième incision tangentielle à l’hémostat pour libérer la vessie.Il en résulte deux demi-ventoules. S’il reste des coussinets graisseux à l’extérieur de la vessie, retirez-les délicatement. Rincez les moitiés de la vessie trois fois dans un tampon de cacodylate de sodium.Tetremper le tissu avec du tétroxyde d’osmium à 1 % dans un tampon cacodylate de 0,15 molaire pendant une heure à température ambiante. Effectuez cette étape avec le récipient de coloration enveloppé dans du papier d’aluminium pour maintenir un environnement sombre. Après la coloration, rincez les moitiés de la vessie trois fois dans de l’eau ultra-pure.Si de l’huile osmosée est visible à la surface de l’eau, aspirez-la ou évacuez-la pour éviter toute contamination pendant les étapes de séchage. Après avoir déshydraté le tissu, bisesct les moitiés de la vessie avec un rasoir propre à double face pour générer quatre morceaux au total. Après l’inoculation, les titres d’UPEC sont détectables dans l’urine.Le taux de bactériurie UPEC est élevé le premier jour et peut augmenter au cours de la première semaine avant de diminuer à des moments ultérieurs. Environ 65 à 80 % des souris n’auront pas d’UPEC détectable dans l’urine 28 jours après l’inoculation. Ces souris peuvent être utilisées dans les étapes suivantes du modèle.Les souris qui restent bactériuriques doivent être éliminées de l’expérience. Deux expositions séquentielles à G. vaginalis, administrées à 12 heures ou à une semaine d’intervalle, entraînent l’émergence d’UPEC à partir des réservoirs intracellulaires pour provoquer une bactériurie récurrente. L’analyse cytologique de l’urine peut être utilisée pour détecter les cellules polymorphonucléaires dans l’urine de souris exposées à G. Vaginalis avec une émergence UPEC affichée.Dans le modèle avec deux expositions administrées à une semaine d’intervalle, les titres d’UPEC dans le tissu de la vessie sont plus faibles chez les souris exposées à G. vaginalis par rapport au PBS, probablement en raison de l’émergence d’UPEC à partir des réservoirs et de l’élimination ultérieure. La visualisation in situ du tissu de la vessie fixe par MEB révèle de grandes cellules urothéliales parapluies superficielles tapissant la surface de la vessie chez les souris témoins exposées uniquement au PBS. L’exfoliation urothéliale est mise en évidence par une perte de cellules parapluie superficielles, révélant un épithélium transitionnel sous-jacent plus petit chez les souris exposées à G. vaginalis.Peu de temps après l’inoculation de l’UPEC, lors de l’établissement des réservoirs intracellulaires, les cellules bactériennes sont visibles sur l’urothélium et s’enfilent des cellules exfoliantes. Les méthodes décrites ici ouvrent la voie à de futures études visant à étudier l’effet d’autres souches de Gardnerella ou d’autres espèces urogénitales sur E. coli.

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Immunologie et infection

Cette vidéo va montrer des méthodes pour induire des infections de souris transurethrally des voies urinaires et de quantifier l'ampleur des infections résultant.

Induction transurétrale d&#39;infection des voies urinaires souris

Source : O’Brien, V. P., et al., Infection urinaire récurrente d’Escherichia coli déclenchée par l’exposition à la vessie vaginale à Gardnerella vaginalis chez la souris. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo démontre l’utilisation de la microscopie électronique à balayage pour visualiser la colonisation bactérienne et les interactions hôte-pathogène dans l’épithélium de la vessie d’un modèle murin pré-infecté.

Préparation du tissu de vessie de souris pour la visualisation d’une infection bactérienne

Source : O’Brien, V.P. et al. Infection urinaire récurrente d’Escherichia coli déclenchée par l’exposition à la vessie vaginale à Gardnerella vaginalis chez la souris. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre la préparation d’un inoculum de Gardnerella vaginalis pour établir un modèle murin d’infection urinaire récurrente.

Préparation de l’inoculum de Gardnerella vaginalis pour modéliser les infections urinaires récurrentes chez la souris

Source : Conover, M. S., et al., J. Établissement et caractérisation des infections urinaires et de la maladie des urines dans un modèle murin. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre la procédure pour assembler et implanter un cathéter transurétral chez une souris femelle, suivie d’une inoculation bactérienne pour établir une infection urinaire associée au cathéter et étudier les interactions hôte-pathogène médiées par biofilm.

Infection urinaire associée au cathéter dans un modèle murin

Source : Conover, M. S. et al., Établissement et caractérisation des infections urinaires et de la CAUTI dans un modèle murin. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo montre la détection de communautés bactériennes intracellulaires (IBC) dans le tissu vésique de souris infecté par Escherichia coli exprimant β-galactosidase. Après fixation tissulaire, perméabilisation et coloration avec X-gal, les CCI apparaissent sous forme de points bleus sous un microscope disséquant, confirmant l’invasion bactérienne...

Visualisation des communautés bactériennes intracellulaires dans une vessie de souris infectée

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique d’administration intravésicale de bactéries uropathogènes pour générer un modèle d’infection urinaire chez la souris. Ce modèle peut être utilisé pour comprendre la propagation de l’infection bactérienne uropathogène dans le système urinaire et les mécanismes qui déterminent la susceptibilité aux infections urinaires.

Génération d’un modèle d’infection des voies urinaires : une technique pour administrer des bactéries uropathogènes chez la souris afin de développer un modèle d’infection des voies urinaires

Cette vidéo démontre l’établissement d’une infection uropathogène à Escherichia coli dans une vessie de souris femelle par instillation d’un cathéter transurétral. Les bactéries injectées réussissent à établir une infection des voies urinaires dans la vessie, fournissant une plate-forme précieuse pour l’étude des maladies associées aux soins de santé liées aux voies urinaires.

Cathétérisme transurétral et inoculation bactérienne pour générer un modèle d’infection des voies urinaires chez des souris mâles

Etablissement d’un modèle d’infection urinaire chez des souris femelles

La capacité à modéliser les infections des voies urinaires (IVU) est cruciale pour pouvoir comprendre la pathogenèse bactérienne et favoriser le développement de nouvelles thérapies. L’objectif de ce travail est de démontrer des modèles murins d’infections urinaires expérimentales et d’infections urinaires associées à un cathéter qui récapitulent et prédisent les résultats observés chez l’homme.

Création et caractérisation de l&#39;UTI et Cauti dans un modèle de souris

Le modèle établi de cathétérisme transuréthrale de la souris permet l’étude des pathologies de la vessie, y compris les infections urinaires, mais ne peut être effectué chez les femelles. Un nouveau modèle de mâle instillation transurétrale, présenté ici, permettra des recherches dans une région marquée par fortes différences cliniques et épidémiologiques entre les sexes.

Infection des voies urinaires chez un modèle Animal petit : cathétérisme transuréthrale de souris mâles et femelles

La naissance prématurée (accouchement &lt; 37 semaines) est un problème de santé mondial urgent, avec des options de prévention et de traitement sous-optimales. Nous présentons un modèle murin d’accouchement prématuré induit par une infection bactérienne vaginale ascendante et décrivons comment analyser la morbidité et la mortalité néonatales qui en résultent.

Modélisation de l’infection vaginale ascendante, de l’accouchement prématuré et de la morbidité néonatale chez la souris

Découvrez un modèle murin d'infection urinaire récurrente par Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de résurgence bactérienne et les interactions urogénitales.

Infection récurrente des voies urinaires à Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis Exposition à la vessie chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal

Infection récurrente des voies urinaires à Escherichia coli déclenchée par Gardnerella vaginalis Exposition à la vessie chez la souris

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