Cristallisation et détermination structurale d’une enzyme : complexe de substrat par cristallographie sérielle dans une puce microfluidique polyvalente

Bonjour, et bienvenue à l’architecture de laboratoire et à la réactivité de l’ARN à l’Institut de biologie moléculaire et cellulaire de Strasbourg. La croissance de cristaux bien défracteurs est une étape cruciale dans toute étude cristallographique. Dans cette vidéo, nous démontrerons l’utilisation d’un nouvel outil microfluidique pour faire pousser les cristaux d’une biomolécule et déterminer sa structure 3D par diffraction in situ des rayons X.

Le dispositif microfluidique appelé ChipX présente plusieurs avantages. Il est conçu pour miniaturiser et faciliter les actifs de cristallisation par la méthode de contre-diffusion. Sa mise en place est facile et réalisée avec du matériel de laboratoire standard.

Il est également optimisé pour la caractérisation directe des cristaux cultivés dans la puce par cristallographie aux rayons X en série. ChipX élimine les étapes de traitement des cristaux et de cryo-refroidissement et préserve la qualité intrinsèque des cristaux analysés in situ et à température ambiante. ChipX a le format d’une diapositive microscope, 7,5 par 2,5 centimètres.

Il contient huit canaux microfluidiques utilisés comme chambres de cristallisation avec une section de 80 par 18 micromètres et une longueur de quatre centimètres. L’entrée sur le côté gauche permet l’injection manuelle de la solution de biomolécule qui remplira les huit canaux jusqu’aux réservoirs. Des solutions de cristallisation sont déposées dans ces réservoirs sur le côté droit.

La cristallisation est déclenchée par un phénomène appelé contre-diffusion. Lorsque l’agent cristallisant se diffuse dans la solution de biomolécule et crée une concentration et un gradient de saturation super. Les étiquettes et les bost le long des canaux aident à localiser les cristaux plus facilement.

La mise en place d’une puce nécessite de cinq à six microlitres de solution de biomolécule à une concentration typique de cinq à 10 milligrammes par millilitre. Une huile de paraffine microlitre, cinq microlitres de solution de cristallisation par réservoir et du ruban adhésif. Le chargement de ChipX est effectué manuellement avec une micropipette et des pointes standard.

Une solution d’échantillon bleu est utilisée dans cet exemple pour une meilleure visualisation du processus d’injection. Pour éviter les fuites, la pointe est insérée dans l’entrée de l’échantillon perpendiculairement à la puce. Un microlitre d’huile de paraffine est chargé après l’échantillon pour séparer les canaux les uns des autres.

L’entrée de l’échantillon est ensuite scellée avec du ruban adhésif. Les huit réservoirs sont chargés individuellement de cinq microlitres de solution d’agent cristallisant. Pour ce faire, la pointe de la pipette est placée près de l’extrémité du chenal à un angle d’environ 45 degrés.

Cela empêche la formation d’une bulle d’air entre l’échantillon et l’agent cristallisant. Les réservoirs peuvent être remplis de cocktails contenant divers tampons, polymères ou sels, et cetera, pour le dépistage ou l’optimisation. Les réservoirs sont scellés avec du ruban adhésif.

Comme démontré ici, la mise en place d’une puce est facile et ne prend que quelques minutes. Dans ChipX, la cristallisation se fait par contre-diffusion. Les agents cristallisants déposés dans les réservoirs se diffusent dans les canaux contenant la biomolécule.

Cela crée des gradients de concentration et de super saturation qui déclencheront la cristallisation. Ce sont des exemples de cristaux d’une enzyme obtenue à l’intérieur des canaux. Ils peuvent se développer pour remplir les canaux qui ont une section transversale de 80 par 80 micromètres.

Les cristaux sont facilement détectables dans ChipX par microscopie fluorescence utilisant la fluorescence naturelle des résidus de tryptophane sous la lumière UV, ou comme indiqué ici à l’aide d’une protéine étiquetée fluorescente. Cette section montre une analyse télégraphique chris effectuée à la source lumineuse suisse dans filaggrins Suisse. Les copeaux peuvent être transportés au synchrotron sans équipement supplémentaire ni soins spéciaux.

Entrons dans le hall de la source lumineuse suisse. Les électrons circulent dans l’anneau central et génèrent un large spectre d’ondes électromagnétiques, y compris des rayons X exploités à différentes lignes de faisceau. Cette vidéo a été enregistrée au X06, une ligne de faisceau dédiée à la cristallographie macro-moléculaire.

Le protocole peut passer d’une installation synchrotron à l’autre, mais le principe général demeure le même. ChipX est monté sur un support imprimé 3D. Ce support est ensuite fixé à l’aimant d’un goniomètre standard.

L’analyse en série cohérente recueillir des données à partir d’une série de cristaux cultivés dans la puce. Des listes de positions cristallines sont établies à l’aide des étiquettes et du bost le long des canaux de copeaux. Les chercheurs déplacent la puce pour centrer les cristaux dans le faisceau de rayons X symbolisé par la fenêtre jaune.

Une procédure de centrage rapide à l’aide du faisceau de rayons X est lancée. L’arrêt du faisceau monte en place et le détecteur se déplace vers l’échantillon. Le criblage de grille est effectué pour s’assurer que le cristal est aligné avec le faisceau.

La même procédure est répétée après la rotation de la puce de 30 degrés. La deuxième étape est importante parce que le matériau de la puce crée un effet de parallaxe qui conduit à un déplacement du maximum de diffraction par rapport à la position cristalline observée. Dès que le cristal est centré dans le faisceau, la collecte de données commence.

Cette séquence montre la collecte de données en temps réel. La puce tourne de 30 degrés. Pendant ce temps, les images de diffraction correspondantes sont collectées par le détecteur.

La caractérisation de ce cristal est complète. La puce traduite au cristal suivant dans le canal et toute la procédure est répétée. Notez que cette analyse est effectuée in situ sans manipulation directe du cristal et à température ambiante.

Les données recueillies sur une série de cristaux sont ensuite fusionnées pour obtenir un ensemble complet de données de diffraction qui est utilisé pour calculer une carte de densité électronique, affichée en bleu, et pour construire le modèle atomique. La procédure décrite dans cette vidéo a été appliquée dans le cadre de la caractérisation structurale de l’enzyme de modification de tRNA. L’enzyme cca-ajoutant de la bactérie adaptée au froid, Planococcus halocryophilus.

ChipX a été utilisé pour cristalliser l’enzyme par contre-diffusion en présence de sulfure d’ammonium comme agent cristallisant. Des cristaux by-pyramidaux sont apparus le long des canaux, après quelques jours d’incubation à 20 degrés Celsius. L’étiquetage fluorescent de la protéine a facilité l’identification des cristaux protéiques et leur discrimination à l’égard des cristaux de sel.

Une série de cristaux a été analysée in situ et à température ambiante. Leurs données de diffraction ont été fusionnées et ont mené à la structure cristalline de l’enzyme DPOE à une résolution de 2,5 angstrom. En outre, la diffusion de l’environnement dans les canaux de copeaux a été exploitée pour fournir un substrat à l’enzyme qui accumule les cristaux.

En l’espèce, un analogue CTP a été ajouté aux solutions du réservoir deux jours avant l’analyse du synchrotron. Cela a permis au composé de se diffuser et d’atteindre le site catalytique de l’enzyme. Comme on le voit dans la structure cristalline du complexe déterminée à une résolution de 2,3 angstrom.

Le protocole démontré dans cette vidéo est généralement applicable et a été testé sur une variété de biomolécules. Pour conclure ChipX est un outil de puce de laboratoire qui intègre toutes les étapes d’une étude cristallographique et vous permet de passer de la solution biomédicale à la structure cristalline dans un dispositif microfluidique unique. Merci d’avoir regardé cette vidéo.

et nous espérons vous avoir convaincu des avantages de l’utilisation de ChipX pour cristalliser et déterminer la structure cristalline de vos favoris par Biomolecule.