Marquage covalent avec diéthylpyrocarbonate pour l’étude de la structure d’ordre supérieur des protéines par spectrométrie de masse

La caractérisation d’une structure protéique est essentielle pour comprendre sa fonction. La spectrométrie de masse est apparue comme un outil puissant à cette fin, en particulier pour les systèmes protéiques difficiles à étudier par des méthodes traditionnelles. Pour étudier une structure protéique par spécification de masse, des réactions chimiques spécifiques sont réalisées en solution qui codent une information structurelle protéique dans sa masse.

Une approche particulièrement efficace consiste à utiliser des réactifs qui modifient de manière covalente la résolution des chaînes latérales d’acides aminés accessibles. Ces réactions conduisent à des augmentations de masse qui peuvent être localisées avec une résolution de niveau de résidus lorsqu’elles sont combinées avec la digestion protéolytique et la spectrométrie de masse en tandem. Ici, nous avons décrit les protocoles associés à l’utilisation du pyrocarbonate de diéthyle ou du DEPC comme réactif d’étiquetage covalent ainsi que la détection des spécifications de masse.

DEPC est une molécule hautement électrophile capable de étiqueter jusqu’à 30% des résidus dans la protéine moyenne, offrant ainsi une excellente résolution structurelle. DEPC a été utilisé avec succès avec des spécifications de masse pour obtenir des informations structurelles pour de nombreuses protéines différentes. Commencez par préparer une solution tamponnée de votre protéine d’intérêt à une concentration de l’ordre de dizaines de micromolaires.

Nous utilisons couramment un tampon MOPS à pH 10 millimolaire de 7,4. Alternativement, une solution protéique existante peut être un échange tampon en MOPS ou un autre tampon si l’échantillon d’origine contient un tampon qui a des groupes fonctionnels nucléophiles. Il est nécessaire que le tampon n’ait pas de groupes fonctionnels nucléophiles car ils interféreront avec la réaction de la protéine DEPC.

Dans un autre microtube, préparer une solution mère de 100 millimolaires de DEPC dans de l’acétonitrile sec. La préparation de la solution mère dans de l’acétonitrile sec est nécessaire pour prévenir l’hydrolyse du DEPC. Dans un nouveau microtube, préparer la solution d’un imidazole molaire dans de l’eau de qualité HPLC.

Dans un nouveau microtube, mélanger le tampon MOPS et la solution de protéines. À la protéine et au tampon, ajoutez une partie aliquote de la solution mère de DEPC en vous assurant qu’elle est correctement mélangée avant de placer le mélange réactionnel dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant une minute. Le volume de la solution mère de DEPC utilisée doit être choisi en fonction du rapport de concentration en protéines DEPC final souhaité.

Il n’y a pas un seul ensemble de concentrations de DEPC et de protéines qui fonctionnera avec chaque protéine, bien que la concentration optimale de DEPC puisse être estimée en fonction du nombre de résidus d’histidine et de lysine accessibles aux solvants présents dans la protéine. Il convient de noter que le volume d’acétonitrile ajouté, qui est effectivement le volume de la solution de DEPC ajoutée ne doit pas dépasser 1% du volume total de réaction afin d’éviter une perturbation de la structure protéique au cours de la réaction. Le temps de réaction dépend en fin de compte de l’utilisateur, bien qu’une réaction d’une minute dans la condition d’exemple minimise le sur-étiquetage de la protéine et l’hydrolyse du DEPC.

Après une minute s’est écoulée, étanchez la réaction en ajoutant l’imidazole pour récupérer le reste sur le DEPC réagi. S’assurer que la concentration finale d’imidazole est 50 fois la concentration de DEPC. Pour identifier les résidus qui ont été modifiés par DEPC, la protéine doit être digérée protéolytiquement en fragments peptidiques.

Pour la digestion, choisissez des conditions qui se prêtent aux protéines d’intérêt. Les étapes courantes décrites ici impliquent le dépliage des protéines, puis la réduction et l’alkylation des liaisons disulfures afin que l’efficacité de la digestion puisse être améliorée. D’après notre expérience, le dépliage de la protéine avec un démentissant et de la chaleur avant la digestion améliore l’efficacité de la digestion.

Pendant le dépliage des protéines, comparez les solutions de PTCE et d’iodoacétamide dans un tampon de digestion approprié. Le PTCE doit être utilisé comme agent réducteur au lieu du dithiothreitol ou de la TNT, car la TNT peut réagir avec les résidus modifiés par le DEPC. L’alkylation des fichiers résultants après réduction est essentielle pour éviter le brouillage de l’étiquette dans lequel les fichiers libres et la protéine réagissent avec des acides aminés modifiés.

Une fois l’étape de dépliage terminée, réduisez les liaisons disulfures en ajoutant du PTCE au mélange réactionnel et laissez-le réagir pendant trois minutes à température ambiante. Après réduction, ajoutez l’iodoacétamide au mélange réactionnel, laissez-le réagir pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Obtenu ici en plaçant le mélange réactionnel dans une boîte.

La concentration finale d’iodoacétamide doit être le double de la concentration utilisée pour le PTCE ou 80 fois la concentration en protéines ou la liaison disulfure. Préparez l’enzyme d’intérêt, généralement la trypsine ou la chymotrypsine selon les spécifications du fabricant. Après avoir préparé l’enzyme de choix, commencez la digestion et incuber le mélange réactionnel à 37 degrés Celsius.

Un rapport protéine/enzyme de 10:1 avec une digestion de trois heures utilisant des enzymes immobilisées est typiquement un bon choix pour des protéines marqués de DEPC. Après la digestion, l’échantillon doit être immédiatement analysé par LC-MS/MS ou congelé avec de l’azote liquide afin de minimiser la dégradation de l’échantillon et la perte sur l’étiquette. Les paramètres LC-MS/MS standard pour la protéomique ascendante peuvent être utilisés pour identifier les sites marqués sur les fragments peptidiques protéolytiques.

La phase stationnaire C18 en phase inverse doit être utilisée pour obtenir la meilleure séparation des peptides. D’après notre expérience, le LC capillaire fournit des informations quantitatives plus fiables sur les niveaux de modification que le nano LC en raison des quantités d’échantillons plus élevées utilisées. Une phase mobile LC typique qui est utilisée pour séparer les peptides marqués par DEPC est composée de deux solvants.

Le solvant A est de l’eau avec de l’acide formique à 0,1% et le solvant B est un acétonitrile à 0,1% d’acide formique. Une élution de gradient est utilisée et le temps de séparation peut être optimisé en fonction de la complexité de l’échantillon. Un spectromètre de masse capable de faire de la LC-MS et de la MS/MS en ligne est nécessaire pour identifier les sites de modification de DEPC sur les peptides.

Dans nos expériences, nous avons utilisé avec succès plusieurs types de spectromètres de masse. Nous avons constaté qu’un Thermo Orbitrap Fusion fournit d’excellents résultats, bien que tout spectromètre de masse capable d’effectuer automatiquement MS / MS de nombreux peptides au cours d’une analyse LC-MS devrait convenir. Les conditions HPLC et les paramètres spectrométriques de masse doivent être réglés correctement avant la mesure.

Si l’échantillon a été congelé à l’éclair, il doit être décongelé juste avant l’analyse. Faites de votre mieux pour minimiser le temps entre la préparation de l’échantillon et l’injection de CLHP. Chargez et injectez l’échantillon de protéines étiquetées digérées dans le système LC et commencez l’acquisition LC-MS /MS ou l’identification du site de l’étiquette DEPC et la quantification de la zone de pointe, plusieurs méthodes existent.

Sur les instruments Thermo Fisher, excalibur ou protéome découvreur peut-être utilisé. Définissez les paramètres appropriés pour l’identification des peptides dans un programme. L’addition et la carbamidométhylation de DEPC sont incluses en tant que modifications variables facilitant les résidus ou allouées.

Les zones de pic chromatographique des versions modifiées et non modifiées des peptides sont utilisées pour déterminer les pourcentages de modification du niveau de résidus. L’étiquetage DEPC avec détection de la SEP est également un outil précieux pour caractériser les changements structurels d’ordre supérieur des protéines. À partir de notre étude, l’étiquetage covalent DEPC peut identifier des régions protéiques spécifiques qui subissent des changements structurels lors du stress thermique et oxydatif.

Dans la figure, les changements significatifs dans les pourcentages de modification sont indiqués en bleu pour la diminution de l’étiquetage et en rouge pour l’augmentation de l’étiquetage, tandis que les résidus sans changements significatifs d’étiquetage sont indiqués en vert pâle. Par exemple, après que la bêta-2 microglobuline est exposée au stress thermique, de nombreux résidus qui subissent des diminutions significatives des étendues de marquage, N-terminus, sérine 28, histidine 31, sérine 33, sérine 55, sérine 57, et lysine 58 sont plus proches qu’un côté de la protéine suggérant que cette région de la protéine subit un changement de confirmation ou peut-être négocie l’agrégation. Après que la protéine soit exposée au stress oxydatif, différents résidus avec une diminution du étiquetage, la sérine 11, l’histidine 13, la lysine 19, la lysine 41 et la lysine 94 d’un cluster sur une autre phase de la protéine indiquant que le changement de confirmation induit par l’oxydation se produit ailleurs.

Cette étude a des implications importantes pour les thérapies protéiques, qui sont actuellement le segment du marché pharmaceutique qui connaît la croissance la plus rapide. D’autres travaux de notre groupe ont également montré que la spécification de masse de marquage covalent DEPC peut détecter et identifier les sites des changements confirmationnels dans les thérapies d’anticorps monoclonal stressés. Comme vous pouvez le voir, l’étiquetage covalent avec DEPC est simple à mettre en œuvre expérimentalement, mais peut fournir des informations structurelles précieuses pour les protéines.

La résolution structurelle fournie par la spécification de masse de marquage DEPC est modeste par rapport aux techniques comme la cristallographie aux rayons X et la RMN, mais elle se compare à presque toutes les protéines, quelle que soit sa taille ou sa capacité à être cristallisée. Depc covalent marquage de masse spec fonctionne également avec des mélanges de protéines et peut travailler avec des types d’échantillons très compliqués, tels que le lysat cellulaire et les cellules haCat. Après avoir regardé cette vidéo, nous sommes convaincus que vous trouverez le étiquetage DEPC un outil utile pour caractériser la structure des protéines.