Name: Reprogrammation directe des fibroblastes humains en myoblastes pour étudier les thérapies pour les troubles neuromusculaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Découvrez la reprogrammation directe des fibroblastes humains en myoblastes pour étudier les troubles neuromusculaires. Cette méthode rapide utilise des vecteurs viraux et facilite le test de thérapies personnalisées.

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Nous tenons à remercier le Dr Vincent Mouly d’avoir partagé ses connaissances dans le passé sur le modèle. Ces travaux ont été soutenus par le National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., et R.B.W.),les National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., et N.W.). N.W. a reçu le soutien de la Bourse de l’Université d’État de l’Ohio/Nationwide Children’s Hospital Muscle Group et de la Fondation Philippe. Ce travail a également été soutenu par des fonds discrétionnaires internes et une partie du travail de saut exon 2 a également été soutenue par CureDuchenne (K.M.F.) et l’Association Française Contre Les Myopathies. Numéro de la CISR : CISR #: IRB10-00358/ CR00005138 et IBCSC#: IBS00000123.

<ol><li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+down-regulates+the+myogenic+regulatory+factors+in+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts.</a> Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).</li>
<li>Pantic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+versatile+immortal+muscle+cell+models+from+healthy+and+myotonic+dystrophy+type+1+primary+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts.</a> Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).</li>
<li>Thorley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+characteristics+are+preserved+in+hTERT%2Fcdk4+human+myogenic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines.</a> Skeletal Muscle. 6 (1), 43(2016).</li>
<li>Chaouch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+skin+fibroblasts+expressing+conditional+MyoD+as+a+renewable+and+reliable+source+of+converted+human+muscle+cells+to+assess+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%3A+Validation+of+an+exon-skipping+approach+to+restore+dystrophin+in+duchen%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen.</a> Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).</li>
<li>Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+cell+and+animal+models+of+human+disease+by+genome+editing+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9.</a> The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).</li>
<li>Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-skipping+advances+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy.</a> Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).</li>
<li>Hwang, J., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+exon-skipping+therapies+using+antisense+oligonucleotides+and+genome+editing+for+the+treatment+of+various+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies.</a> Expert reviews in molecular medicine. 21, 5(2019).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Skipping+of+Single+Exon+Duplications+in+DMD+Patient-Derived+Cell+Lines+Using+an+Antisense+Oligonucleotide+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).</li>
<li>De Angelis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+snRNA+molecules+carrying+antisense+sequences+against+the+splice+junctions+of+exon+51+of+the+dystrophin+pre-mRNA+induce+exon+skipping+and+restoration+of+a+dystrophin+synthesis+in+%CE%9448-50+DMD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).</li>
<li>Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+alteration+of+pre-mRNA+splicing+patterns+by+modified+U7+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+from+a+DMD+exon+5+IRES+results+in+a+functional+dystrophin+isoform+that+attenuates+dystrophinopathy+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice.</a> Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).</li>
<li>Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+oxidative+phosphorylation+of+immortalization+with+the+telomerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene.</a> Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).</li>
<li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).</li>
</ol>

Nationwide Children’s Hospital a autorisé le programme de saut exon 2 décrit ci-dessus à Audentes Therapeutics. K.M.F. et N.W. ont reçu des redevances à la suite de cette licence.

Pour obtenir des lignes cellulaires FM de bonne qualité, certaines étapes sont critiques. Plus tôt la biopsie de la peau est traitée, plus les chances sont grandes d’obtenir des fibroblastes sains. Le nombre de cultures de passage de fibroblastes est également important. Les cellules primaires ont une capacité proliférative limitée et après de nombreux passages, elles entrent dans la sénescence réplicative. Ainsi, il est préférable d’avoir un stock de fibroblastes à un faible nombre de passage et de transformer les cellu...

Les modèles cellulaires obtenus directement à partir de tissus humains sont utiles pour modéliser de nombreux troubles génétiques humains, avec l’avantage d’avoir le contexte génomique original et, dans de nombreux cas, de reproduire les mêmes caractéristiques moléculaires et cellulaires observées chez les patients. Dans le domaine des troubles neuromusculaires, les biopsies musculaires ont été une grande source de myoblastes humains et ont contribué à l’élucidation des mécanismes pathologiques. En outre, ils sont un outil important pour les tests in vivo des médicaments et des thérapies géniques. D’une part, la dérivation des myoblastes à partir de fragments musculaires est relativement facile. D’autre part, la culture et le maintien des myoblastes primaires sont difficiles, en raison de leur taux de prolifération limité et de leur sénescence réplicative in vitro1. Une alternative pour ces limitations est d’immortaliser les myoblastes avec l’insertion de la télomérase humaine (hTERT) et / ou kinase dépendante de la cycline 4 (CDK4) gènes2,3, avec la préservation des caractéristiques musculaires squelettiques4. Néanmoins, l’obtention des myoblastes primaires dépend toujours de la biopsie de muscle, une procédure chirurgicale avec des inconvénients aux patients, qui, dans beaucoup de cas, ont leurs muscles dans la dégénérescence avancée. Ainsi, le muscle de ces patients est composé d’une proportion significative de tissu fibrotique et/ou adipeux et donne moins de cellules musculaires, nécessitant la purification des cellules précédemment à l’immortalisation.
Contrairement aux biopsies musculaires, les biopsies cutanées sont plus accessibles et moins nocives pour les patients. Les fibroblastes primaires peuvent être dérivés de fragments de peau in vitro. Bien que les fibroblastes ne soient pas principalement affectés par des mutations causant des désordres neuromusculaires, ils peuvent être transdifferentiated dans les myoblastes. Ceci peut être réalisé par l’insertion du gène Myod, un facteur de transcription réglementaire myogénique5. Dans ce manuscrit, nous décrivons le protocole d’obtention des myoblastes transdifferentiated, de l’établissement des cultures de fibroblastes à l’obtention des myotubes différenciés (un résumé représentatif de la méthode est représenté dans la figure 1).
L’essai préclinique des stratégies thérapeutiques dépend des modèles cellulaires et animaux portant des mutations semblables aux mutations trouvées dans les patients humains. Bien que le développement de modèles animaux soit devenu plus réalisable avec l’avancée des technologies d’édition génétique telles que CRISPR/Cas96,il reste difficile et coûteux. Ainsi, les lignées cellulaires dérivées du patient sont une option accessible pour avoir des modèles, couvrant le large spectre de mutations de maladies telles que la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’obtention et la création de modèles cellulaires sont cruciales pour le développement de thérapies personnalisées pour de telles pathologies.
Parmi les thérapies personnalisées qui ont été étudiées, les stratégies de saut d’exon sont l’une des prometteuses pour différentes dystrophiesmusculaires 7,8. Cette stratégie consiste à produire une protéine plus courte mais fonctionnelle. Ceci est effectué en cachant la définition d’exon à l’épissage, excluant ainsi l’exon muté du messager final. Il s’agit d’une technologie très prometteuse qui a été approuvé par la FDA pour le DMD. Ainsi, nous décrivons également dans ce protocole, des méthodes pour transfecter des myoblastes avec deux technologies liées de saut d’exon différentes : oligonucleotides antisens (AON) et virus U7snRNA-adeno-associés (AAV). La transfection AON est un bon outil pour le criblage initial de plusieurs séquences conçues pour favoriser le saut d’exon9. Toutefois, l’activité des OPN est transitoire. Afin d’obtenir une expression soutenue des séquences antisens, nous avons également exploré de petits ARN nucléaires (ARNR) combinés à l’AAV, permettant la localisation et l’inclusion nucléaires dans les machines d’épissage10. U7 est un ARNR impliqué dans le traitement de l’ARNm histone qui peut être conçu pour lier les protéines qui vont le rediriger vers le spliceosome et livrer des séquences antisens11. L’utilisation de snARN U7 modifiés en combinaison avec des vecteurs AAV surmonte les limites des ANO, ce qui entraîne une expression continue des ANO et une meilleure transduction des tissus d’intérêt12. Nous utilisons des cellules dérivées de patients atteints de DMD pour ce protocole pour illustrer la stratégie d’exon-saut.

<table><tbody><tr><td>Antenne de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % de trypsine-EDTA, rouge de phénol</td><td>Thermo Fisher</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>10X Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 12 puits</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>20X Tampon de transfert</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>20X Tris-acétate SDS tampon courant</td><td>Thermo Fisher</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>3-8 % Tris-Acétate</td><td>gel Thermo Fisher</td><td>EA0378BOX</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 flasque</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimicotique 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-myosine chaîne lourde, anticorps anti-sarcomère</td><td>Etudes développementales Banque d’hybridomes</td><td>MF20 surnageant</td><td>Dilution 1:50</td></tr><tr><td>Antioxydant</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>BCA Dosage des protéines</td><td>Thermo Fisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3571</td><td>Dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Millipore Sigma</td><td>300410250MG</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Glycémie élevée, supplément GlutaMAX, Pyruvate</td><td>Thermo Fisher</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I set (250U)</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de doxycycline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2653-5</td><td></td></tr><tr><td>Dup2 amorces humaines</td><td>Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'Rv_5</td><td>' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'Dystrophine</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>anticorps Abcam</td><td>ab15277</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>Dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Halt Cocktail inhibiteur de protéase 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>Thermo Fisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD chèvre anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Li-Cor</td><td>926-68071</td><td>Dilution 1:5000</td></tr><tr><td>Lab-Tek II CC2 système de lames à chambre</td><td>Thermo Fisher</td><td>15852</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli</td><td>Bioworld</td><td>105700201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Réactif de transfection</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrice membranaire GFR</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>Conteneur de congélation Mr. Frosty Thermo</td><td>Fisher</td><td>51000001</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique 0,45 & micro ; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle du sérum de chèvre normal</td><td>Thermo Fisher</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td><td>Li-Cor</td><td>927-40003</td><td>Buffer de blocage pour Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Master mix PCR</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0172</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la phosphatase</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32957</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Revert 700 Coloration protéique totale pour la normalisation Western Blot</td><td>Li-Cor</td><td>926-11021</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrateur-25</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels</td><td>Aspen Surgical</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>Skeletal Muscle Cell Differentiation</td> medium <td>Promocell</td><td>C23061</td><td></td></tr><tr><td>Muscle squelettique Muscle Cell</td><td>Stem</td><td>C23060</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reactive</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur ultra basse température</td><td>Thermo Scientific</td><td>7402</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield support de montage anti-décoloration</td><td>Vector Labs</td><td>H1000</td><td></td></tr></tbody></table>

reprogrammation directe des fibroblastes humains en myoblastes pour étudier les thérapies pour les troubles neuromusculaires

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Les investigations sur la pathophysiologie et les cibles thérapeutiques dans les dystrophies musculaires ont été entravées par la capacité proliférative limitée des myoblastes humains. Plusieurs modèles muraux ont été créés, mais ils ne représentent pas vraiment la physiopathologie humaine de la maladie ou ne sont pas représentatifs du large spectre de mutations trouvées chez l’homme. L’immortalisation des myoblastes primaires humains est une alternative à cette limitation; cependant, il est toujours dépendant des biopsies musculaires, qui sont invasives et pas facilement disponibles. En revanche, les biopsies cutanées sont plus faciles à obtenir et moins invasives pour les patients. Les fibroblastes dérivés de biopsies cutanées peuvent être immortalisés et transdifférenciés en myoblastes, fournissant une source de cellules avec un excellent potentiel myogénique. Ici, nous décrivons une méthode de reprogrammation rapide et directe du fibroblaste en lignée myogénique. Les fibroblastes sont transduced avec deux lentivirus : hTERT pour immortaliser la culture primaire et un MYODtet-inducible, qui sur l’addition de la doxycycline, induit la conversion des fibroblastes en myoblastes et puis myotubes mûrs, qui expriment des marqueurs tardifs de différenciation. Ce protocole de transdifferentiation rapide représente un outil puissant pour étudier les mécanismes pathologiques et étudier les biothérapies innovantes basées sur les gènes ou pharmacologiques pour les troubles neuromusculaires.

Ce protocole montre comment établir des cultures fibroblastes dérivées de la peau humaine et les convertir en myoblastes, puis en myotubes différenciés. Ce type de lignée cellulaire est extrêmement utile pour l’étude des troubles neuromusculaires et les tests in vitro de thérapies potentielles.
Une représentation schématique de la conversion fibroblaste est indiquée dans la figure 1. La figure 2A montre un fragment de peau et...

Ce protocole décrit la conversion des fibroblastes cutanés en myoblastes et leur différenciation en myotubes. Les lignées cellulaires sont dérivées de patients atteints de troubles neuromusculaires et peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes pathologiques et tester des stratégies thérapeutiques.

Reprogrammation directe des fibroblastes humains en myoblastes pour étudier les thérapies pour les troubles neuromusculaires

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Bonjour à tous. Je m’appelle Nicolas Wein. Je suis chercheur principal au Nationwide Children’s Hospital de Columbus, ohio.Et aujourd’hui, nous allons vous montrer une vidéo sur la façon de prendre une biopsie de la peau et de la convertir en myoblastes et myotube. C’est un outil très utile pour étudier le désordre neuromusculaire. En outre, c’est une technologie beaucoup plus rapide par rapport à IPSC parce que nous utilisons deux types différents de virus pour lutter directement contre ce type de cellule.Cette vidéo démontre le protocole pour établir des cultures fibroblastes dérivées de la peau humaine, la conversion en myoblastes, puis des myotubes différenciés. Une biopsie de peau est transférée à la culture cellulaire pour dériver des fibroblastes cutanés. Les lentivirus porteurs de gènes hTERT et MYOD sont utilisés pour transduire ces fibroblastes.Sur l’addition du milieu de croissance de myoblaste complété avec la doxycycline, le gène de MYOD est exprimé, induisant la conversion des fibroblastes dans les myoblastes. Ensuite, le milieu est commuté à un milieu de différenciation, également complété par la doxycycline. Puis les myoblastes fusionnent les uns avec les autres, formant des myotubes multinucléés.Aspirez le média du tube et rincez la biopsie avec 10 millilitres, un x PBS à température ambiante, trois fois. Après le troisième lavage, laisser le PBS dans le tube. Verser le PBS et la biopsie de la peau sur un plat carré de 10 centimètres.À l’aide de scalpels stériles, couper la biopsie en morceaux aussi petits que possible. À l’aide d’une pipette, transférer un morceau de peau individuel sur un plat stérile de 10 centimètres carrés. Aspirer l’excès de PBS autour de chaque pièce.Veillez à ne pas aspirer la pièce elle-même. Couvrir partiellement la vaisselle avec le couvercle et laisser sécher les morceaux de biopsie de la peau pendant cinq à 20 minutes. Ne laissez pas sécher les morceaux trop longtemps.Une fois les morceaux secs, inclinez le plat à un angle de 45 degrés et ajoutez lentement 12 millilitres de milieu fibreux au coin du plat. Abaissez le plat, en distribuant soigneusement les supports afin que les pièces ne soient pas soulevées par les médias. Placer les plats dans l’incubateur.Remplacez les médias en cinq à sept jours, et une fois par semaine par la suite. Graines fibroblastes primaires à 30% de la confluence et deux puits d’une plaque de puits 12, environ 20.000 cellules par puits, afin d’avoir environ 50% de la confluence le lendemain. Pour la transduction lentiviral, ajouter deux à 5 milliards de génomes viraux de hTERP Puromycin Lentivirus et 400 microlitres de milieu fibroblaste.Ajouter le mélange de lentivirus à un puits. Au deuxième puits, ajouter seulement 400 microlitres de milieu fibroblaste. Le lendemain, ajouter un millilitre de médias.Un ou deux jours plus tard, transférer les cellules dans une plaque de six puits et les cultiver jusqu’à atteindre 60 à 70% de confluence. Compléter le milieu fibroblaste avec un microgramme par millilitre de puromycine et ajouter deux millilitres à chaque puits. Gardez les cellules sous sélection jusqu’à ce que toutes les cellules du puits de contrôle soient mortes pendant au moins 12 jours, changeant les médias tous les deux à trois jours.Graphique de graine H exprimant des fibroblastes à 30% confluent dans trois puits de la plaque de puits 12 pour avoir environ 50% de confluence le lendemain. Pour la transduction lentivirale, mélanger deux à cinq milliards de génomes viraux du lentivirus MYOD Hygromycin B et 400 microlitres de milieu fibroblaste et ajouter à deux puits. Ajouter un millilitre de milieu le lendemain.Un ou deux jours plus tard transférer les cellules dans une plaque de six puits et se développer jusqu’à 60 à 70% confluent. Compléter les supports de croissance avec 400 microgrammes par millilitre d’Hygromycine B.Ajouter deux millilitres à chaque puits. Gardez les cellules sous sélection jusqu’à ce que toutes les cellules des puits de contrôle soient mortes, prenant généralement au moins 12 jours, changeant les médias tous les deux à trois jours.Pour l’induction des myoblastes, cultiver des fibroblastes jusqu’à ce qu’ils soient 70% confluents. Ajouter huit microgrammes par millilitre de Doxycycline au milieu de croissance du myoblaste. Toujours utiliser des aliquots frais de Doxycycline et moyen.Le support doit être préparé juste avant tout changement médiatique. En outre, la Doxycycline ne doit pas être recongelée. Aspirer le milieu fibroblaste et rincer les cellules avec PBS.Ajouter 10 millilitres de médias myoblastes complétés. Deux à trois jours plus tard, les cellules sont confluentes à 90 à 95 % et leur morphologie aura changé. Aspirer le média de croissance du myoblaste et rincer la surface cellulaire avec PBS.Ajouter 10 millilitres de média de différenciation qui a été complété par huit microgrammes par millilitre de Doxycycline fraîche. Continuez à changer les médias tous les deux ou trois jours jusqu’à ce que des myotubes soient formés. Sept à dix jours après l’initiation de la différenciation myotube, les cellules doivent être entièrement différenciées, mais cela varie d’une lignée cellulaire à l’autre.Les premiers fibroblastes peuvent émerger cinq jours après que les morceaux de peau ont été en culture. Dans l’image B, les fibroblastes sont confluents et prêts à être transférés dans des flacons carrés de 75 centimètres pour une prolifération ultérieure. Il est important de congeler plusieurs flacons de fibroblastes à faible nombre de passage que les cellules primaires entrent dans la sénescence réplicative.Une fois que les lignées cellulaires FM sont établies pour la conversion des fibroblastes en myotubes, les fibroblastes doivent proliférer jusqu’à 70% confluent comme le montre l’image A.Il est important de ne pas dépasser 80% de confluence, car une densité élevée peut nuire à la différenciation. Après l’ajout de Doxycycline au milieu, dans les deux à quatre jours les cellules deviennent myoblastes, caractérisées par une morphologie allongée et une orientation parallèle comme on le voit dans l’image B.Les myotubes différenciés sont montrés dans l’image C.Le temps de fusion et de différenciation des myotubes peut varier de sept à 21 jours selon le génotype cellulaire. Les cellules doivent être collectées ou fixées avant de se détacher.Le début du détachement peut être observé par la couleur et la luminosité des bords du myotube, comme le soulignent les flèches de cette image. Par immunofluorescence, l’expression de protéines musculaires matures spécifiques confirme la conversion réussie des fibroblastes en myotubes. Dans ces images, trois cellules différentes sont montrées.Le degré de différenciation varie d’une cellule à l’autre, et peut ou non être réalisé par la mutation primaire car c’est le cas des cellules dans les figures B et C.Une validation supplémentaire du modèle a été confirmée par RNAseq. Comme le montre cette intrigue, il y a plus de 12 000 gènes exprimés différemment détectés dans les myotubes FM par rapport à celui du muscle squelettique. La corrélation significative entre les deux transcriptomes soutient que les cellules FM ont un profil d’expression spécifique au muscle démontrant qu’ils sont un substitut utile et fiable pour les lignées cellulaires dérivées des muscles.Pour illustrer l’utilité de ce modèle in vitro, nous avons utilisé l’une des duplications exoniques les plus courantes dans le gène DMD. La duplication d’Exon deux conduit à la perturbation du cadre de lecture DMD, et son saut peut soit conduire à la restauration de ce cadre de lecture ou l’utilisation du site d’entrée interne ribosome. Cette thérapie a déjà été validée avec des études in vivo Figure A, nous avons démontré la preuve de concept par l’analyse RTPCR de cette lignée cellulaire mutée particulière, avec et sans traitement par saut d’exon.La tache occidentale dans la figure B démontre que la protéine fonctionnelle de dystrophine est exprimée dans les cellules traitées. En comparant l’efficacité de cette thérapie aux modèles in vivo, les résultats soutiennent la fiabilité de la technique de différenciation cellulaire et soutiennent son utilisation pour tester diverses thérapies géniques spécifiques à la mutation. Avant les études cliniques nécessaires pour tester l’efficacité du soutien thérapeutique officiel sur les troubles neuromusculaires, en fonction de la capacité des modèles animaux et cellulaires.Le développement de modèles animaux, bien qu’il soit plus facile de nos jours, n’est pas une option réalisable pour chaque mutation spécifique. La génération de myoblastes à travers des cellules IPS dérivées de fibroblastes cutatiques est une alternative, mais c’est une technique qui prend beaucoup de temps. Ainsi, cette procédure est une alternative simple à la génération IPS qui permet la conversion directe des fibroblastes en myoblastes.Il facilite l’accès aux modèles cellulaires humains en évitant l’application plus invasive de biopsies musculaires En conclusion, cette conversion directe des fibroblastes en myoblastes est un outil puissant pour tester les thérapies pour les troubles neuromusculaires dans un contexte spécifique de limitation.

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JoVE Journal

Genetics

Génétique

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