Utilisation de Grafix pour la détection des interacteurs transitoires des sous-complexes de Spliceosomes de Saccharomyces cerevisiae

La méthode de fixation par gradient, dans laquelle une centrifugation par gradient de glycérol est effectuée en présence d’un agent de réticulation, permet d’identifier les interactions entre les protéines qui se lient transitoirement à des complexes multi-sous-unités. L’utilisation de réactifs de fixation dans le gradient de glycérol stabilise la liaison des facteurs lâches, sans formation de précipités, permettant l’identification des interactions de protéines spécifiques avec des semi-complexes épissés. La démonstration du protocole final aide les nouveaux utilisateurs à apprendre des informations qui peuvent être difficiles à comprendre à partir d’un texte écrit seul.

Pour la préparation de l’extrait total de levure, cultivez les cellules de levure en exprimant l’un des facteurs d’épissage fusionnés à l’étiquette de robinet et un litre de milieu de glucose Y et B complété par les acides aminés appropriés ou les bases nucléiques. Lorsque la culture atteint une densité optique de 600 nanomètres de un, collectez les cellules de levure par centrifugation dans trois bouteilles de centrifugeuse de 500 millilitres, et lavez les cellules deux fois dans 10 millilitres d’eau froide stérile par lavage. Après le deuxième lavage, remettez les cellules en suspension dans un dixième du volume cellulaire du tampon froid A et congelez 50 gouttes d’un microlitre de suspension de cellules de levure dans de l’azote liquide.

Après la congélation, broyez les granulés de cellules congelées en six cycles à 20 hertz pendant trois minutes dans un broyeur à boulets, en immergeant le récipient de cellules congelées dans de l’azote liquide à la fin de chaque cycle. Après le dernier cycle, placez les tubes contenant les extraits dans de l’eau à température ambiante en secouant de temps en temps. Une fois fondus, centrifuger pour recueillir les extraits.

Et quantifier la protéine qui a éliminé les surnageants par la méthode BCA. Ensuite, congelez rapidement les aliquotes des extraits dans de l’azote liquide pour un stockage à moins 80 degrés Celsius. Pour préparer un gradient de glycérol, ajoutez une concentration finale de 0,1 % de l’agent de réticulation glutaraldéhyde à une solution de glycérol et de tampon A à 30 %, et mélangez pour homogénéiser.

Ajoutez six millilitres de solution froide de glycérol à 10 % et de tampon A dans un tube à centrifuger de 12 millilitres et utilisez une seringue à gradient master équipée d’une longue aiguille pour superposer la solution de glutaraldéhyde à 30 % de glycérol au fond du tube. Utilisez un appareil maître de gradient pour créer un gradient linéaire de glycérol selon les spécifications du fabricant. Superposez soigneusement 200 microlitres d’un coussin de glycérol à 7 % et tamponnez A au sommet du gradient avant d’ajouter environ deux milligrammes d’extrait cellulaire au sommet du tube.

Après la génération du gradient de glycérol, placez l’échantillon dans un rotor à godet pivotant pré-refroidi et collectez l’extrait par centrifugation. Séparez l’échantillon de chaque tube d’échantillon de 12 millilitres en fractions de 24 500 microlitres et utilisez une pompe péristaltique pour pousser une solution de glycérol à 40 % à travers le gradient de 10 à 30 % entre le tube et la collecte des fractions. Ensuite, chargez 50 microlitres de chaque fraction directement sur les membranes de nitrocellulose sur un dot blot, suivi de l’ajout d’un tampon de blocage, et utilisez un anticorps primaire contre le CBP pour détecter la protéine sur l’immuno-blot, et un anticorps secondaire approprié si nécessaire.

En l’absence de réticulant, CWC 24 est concentré entre les fractions cinq et 13, ce qui correspond à des complexes d’environ 80 à 200 mégadaltons. En présence de l’agent de réticulation, cependant, la position de CWC 24 sur le gradient est décalée vers les fractions au bas du gradient correspondant à des complexes plus grands. En comparant la sédimentation de la CWC 24 à celle de la sous-unité snRNP U5, Prp8, et de la sous-unité NTC, Prp19, on constate que la CWC 24 est concentrée dans les mêmes fractions.

Mais, parce qu’il s’associe transitoirement à l’épissage, il est également présent dans les fractions plus légères. Il est intéressant de noter que les fractions 11 et 12 sont celles dans lesquelles Prp8 et 19 commencent à se concentrer, ce qui suggère qu’il s’agit de la partie du gradient où le complexe B Act commence à se sédimenter. L’analyse par transfert Western des fractions 11 et 12 révèle que les signaux Prp8 et 19 sont des frottis qui pénètrent à peine dans un gel d’acrylamide à 8 %, ce qui montre qu’ils font effectivement partie de grands complexes.

CWC 24 est également présent dans la fraction 12, mais à une concentration beaucoup plus faible, ce qui correspond à sa liaison transitoire au complexe B Act. Pris ensemble, ces résultats montrent que le glutaraldéhyde peut être utilisé comme réticulant pour stabiliser la liaison des facteurs transitoires aux sous-complexes d’épissage. Cette méthode peut être appliquée à l’étude de tout complexe de sous-unités motrices dynamiques qui s’associe transitoirement à certaines de leurs composantes, comme l’épissage.