Ensemencement de cellules par étapes sur des échafaudages tessellés pour étudier les vaisseaux sanguins en germination

Notre protocole permet aux chercheurs d’étudier le processus de formation du réseau de vaisseaux d’une manière claire et facilement traçable, ouvrant les portes à de nouvelles études et faisant la lumière sur le comportement des vaisseaux sanguins. Cette technique présente la possibilité de créer des réseaux vasculaires hautement organisés et reproductibles avec une réponse à l’environnement environnant. Les cellules endothéliales de patients souffrant d’une maladie vasculaire peuvent être récupérées en utilisant ce système, ce qui permet de recréer la maladie vasculaire et de trouver un traitement approprié.

La méthode proposée peut être étendue pour étudier le comportement du réseau vasculaire lorsqu’il est associé à différents types de cellules, permettant d’observer l’interaction des vaisseaux en développement avec un type de tissu spécifique. Commencez par submerger les échafaudages dans de l’éthanol à 70% pendant au moins 15 minutes, puis lavez-les deux fois dans du PBS. Mélanger 1,5 microlitres de solution mère de fibronectine avec 28,5 microlitres de PBS par échafaudage à ensemencer.

Préparer une dilution de fibronectine à utiliser pour tous les échafaudages afin d’éviter les erreurs de pipetage. Placez les échafaudages épars sur une surface hydrophobe et couvrez chaque échafaudage de 30 microlitres de dilution de la fibronectine. Remplacez le couvercle de la plaque et placez les échafaudages recouverts de fibronectine dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius et 100% d’humidité pendant au moins une heure.

Après incubation, rincez légèrement les échafaudages dans du PBS pour éliminer les restes de fibronectine. Les échafaudages peuvent être conservés en PBS à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Préparer la cellule endothéliale ou le milieu EC en mélangeant le milieu basal avec les composants du kit de milieu correspondant, y compris une solution antibiotique, fbs, et suppléments de croissance de cellules endothéliales comme indiqué par le fabricant.

Rendre la suspension de cellules endothéliales microvasculaires adipeuses humaines en milieu EC avec une concentration de quatre millions de cellules par millilitre. À l’aide de pinces, placez un échafaudage enduit de fibronectine par puits dans une plaque de 24 puits non TC. Couvrez chaque échafaudage avec 25 gouttelettes de microlittre de la suspension cellulaire, en vous assurant de ne pas laisser la suspension s’écouler loin de l’échafaudage.

Mettez le couvercle sur l’assiette et placez-le dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 100% d’humidité pendant 60 à 90 minutes. Après l’incubation, remplissez chaque puits de 700 microlitres de milieu EC. Incuber les échafaudages endothélialisés jusqu’à ce que la confluence EC puisse être observée en utilisant la microscopie fluorescente ou pendant trois jours.

Changez le support tous les deux jours. Préparer le milieu DPSC en mélangeant 500 millilitres de DMEM à faible teneur en glucose, 57,5 millilitres de FBS, 5,75 millilitres d’acides aminés non essentiels, 5,75 millilitres de GlutaMAX et 5,75 millilitres de solution pénicilline-streptomycine-nystatine. Transférer les échafaudages endothélialisés dans une nouvelle plaque de 24 puits non TC.

Jetez tous les supports de la plaque de courant à l’aide d’une pipette ou d’une aspiration sous vide, en prenant soin de ne pas appliquer de vide directement sur l’échafaudage. Placez un échafaudage au centre de chaque puits, puis séchez la zone environnante avec un vide lumineux. Diluer les solutions de stock de thrombine et de fibrinogène avec pbs à une concentration finale de cinq unités par millilitre et de 15 milligrammes par millilitre respectivement.

Préparer une suspension de huit millions de DPSC par millilitre dans la dilution de thrombine et distribuer 12,5 microlitres de la suspension dans des microtubes individuels par échafaudage à ensemencer. Réglez une pipette de cinq à 50 microlitres sur 12,5 microlitres et remplissez-la avec une solution de fibrinogène. Sans enlever la pointe, réglez la pipette sur 25 microlitres.

Le matériau dans la pointe doit se lever et laisser un volume vide. Appuyez lentement sur le bouton du piston jusqu’à ce que le liquide atteigne l’ouverture de la pointe, mais ne fuit pas. Maintenez le piston dans cette position et mettez la pointe dans l’un des tubes microcentrifuge contenant les cellules en suspension de thrombine, en vous assurant que la pointe est en contact avec le liquide.

Relâchez doucement le bouton du piston et tirez la suspension de la cellule dans la pointe. Mélangez soigneusement les deux matériaux, en évitant la formation de bulles. Distribuez rapidement les matériaux mélangés sur un échafaudage endothélialisé.

Répétez les étapes précédentes pour chaque échafaudage, en vous assurant de changer les conseils entre les utilisations pour éviter la formation inattendue de gel de fibrine dans la pointe. Remplacez le couvercle de la plaque et incuber les échafaudages à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 100% d’humidité pendant 30 minutes. Après l’incubation, remplissez chaque puits d’un millilitre de DPSC un à un et de milieu EC.

Culture pendant une semaine, en changeant le médium tous les deux jours. À différents moments de la culture, retirez le milieu du puits et imagez les constructions à l’aide d’un microscope confocal pour étudier le développement vasculaire ou tout autre paramètre d’intérêt. Ce protocole permet la fabrication d’échafaudages pavés en photorésine SU-8.

Des échafaudages avec des géométries de compartiment distinctes et des caractéristiques très précises et reproductibles ont été obtenus. Avec l’ensemencement simultané traditionnel des cellules endothéliales et des cellules de support, les cellules ont été homogènement distribuées au-dessus de l’échafaudage ayant pour résultat des réseaux vasculaires imprévisibles et désorganisés. À l’inverse, l’ensemencement progressif de cellules a eu comme conséquence des réseaux vasculaires fortement organisés.

Lors de l’utilisation de cellules endothéliales fluorescentes, les vaisseaux peuvent être esthétiés en temps réel. La protéine fluorescente rouge exprimant les cellules endothéliales ont été cultivées sur des échafaudages hexagonaux et essouppiées. Les cellules de soutien ont été ajoutées au premier jour et les réseaux vasculaires ont été entifiés tous les deux jours pour quantifier le développement de navire.

Pour chaque point temporel, de larges images de l’ensemble de l’échafaudage ont été prises. La croissance des navires a été quantifiée en tant que longueur et superficie totales des navires. Un time-lapse confocal de formation image a été exécuté pour permettre le suivi simple de navire utilisant les cellules endothéliales multicolores.

La trajectoire du navire a été générée à partir du laps de temps, ce qui a permis d’observer la migration du navire. On a observé la maturation de navire par la présence de l’actine de muscle lisse et des cellules de support. Pour les compartiments circulaires, hexagonaux et carrés, les cellules se multiplient et s’organisent en structures.

Par jour sept, toutes les formes ont montré un réseau vasculaire riche et complexe. Des images plus élevées de grossissement ont indiqué une actine plus dense de muscle lisse et une présence de cellules de support Co-localisée avec les navires formés, démontrant le recrutement et la différentiation de cellules d’appui entourant les structures vasculaires. Cette technique peut être utilisée pour étudier le comportement des réseaux vasculaires tridimensionnels lorsqu’ils sont exposés à différentes conditions, telles que des inhibiteurs cellulaires spécifiques ou en présence de types cellulaires supplémentaires.