Application des cellules souches embryonnaires haploïdes parthénogénétiques de souris comme substitut du sperme

Ce protocole date faussement la modification de l’empreinte génomique dans les cellules souches embryonnaires de souris haploïdes, comme celle de notre sujet due à de faux spermatozoïdes, permettant la génération d’embryons cultivés à la maison chez la souris. La modification génétique d’un gamète nécessite généralement des techniques difficiles. En utilisant cette méthodologie, les gamètes parentaux peuvent être manipulés dans des cellules souches embryonnaires hybrides pour une introduction ultérieure chez la souris comme option de remplacement des spermatozoïdes.

Comme cette méthode permet de modifier artificiellement et spécifiquement un gamète paternel chez les embryons, elle est particulièrement applicable à l’étude de l’empreinte génomique et de la cautérisation. La démonstration de cette procédure sera faite par Charles Etienne Dumeau, un embryologiste de souris de mon laboratoire. Pour préparer les pipettes de maintien et de micro-injection pour l’expérience, utilisez d’abord un extracteur de micropipettes pour tirer des capillaires en verre borosilicaté de forme allongée et de conicité progressive.

Pour préparer le maintien des pipettes, positionnez un capillaire tiré d’un diamètre extérieur de 60 à 100 micromètres dans une micro forge sur la perle de verre sur le filament. Allumez le filament et abaissez le capillaire jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la bille. Lorsque le capillaire s’est attaché à la perle, coupez le filament et rétractez le capillaire, ce qui provoque la rupture du capillaire avec une extrémité droite.

Ensuite, positionnez l’embout capillaire cassé horizontalement à côté de la perle de verre sur le filament et chauffez le filament pour faire fondre l’extrémité jusqu’à ce que le diamètre intérieur de l’embout capillaire atteigne 10 à 20 micromètres de diamètre. Positionnez ensuite le capillaire au-dessus de la bille de verre à environ un millimètre de la pointe et chauffez le filament pour permettre au capillaire d’être plié à un angle de 20 degrés. Pour préparer une pipette de micro-injection, positionnez un capillaire tiré d’un diamètre extérieur d’environ six micromètres au-dessus de la bille de verre sur le filament chauffé et abaissez le capillaire jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la bille.

Une fois le capillaire attaché, coupez le filament et rétractez le capillaire. Le capillaire se brisera avec une extrémité droite. Déplacez ensuite le capillaire sur la perle de verre à environ un millimètre de l’extrémité du capillaire et chauffez le filament pour permettre au capillaire d’être plié à un angle de 20 degrés.

Pour effectuer une injection intracytoplasmique, placez cinq gouttes d’un microlitre de solution PVP et 20 gouttes d’un microlitre de milieu M2 sur le couvercle renversé d’une boîte de 10 centimètres et couvrez les gouttes d’huile minérale. Placez le plat sur la scène et installez une pipette de maintien sur le micromanipulateur. À l’aide d’une pointe de micro-chargeur, remplissez la pipette de micro-injection d’huile fluorocarbonée et montez la pipette sur l’actionneur piézoélectrique.

En observant au microscope, abaissez la pipette de micro-injection dans une goutte de solution PVP. Lorsque la pipette est immergée, pipette de haut en bas plusieurs fois pour enrober le verre avec le PVP. Chargez un petit volume de solution PVP dans la pipette de micro-injection.

Immergez les pipettes de micro-injection et de maintien dans le milieu M2 et concentrez-vous sur la pipette au bas de la goutte. Transférez environ deux microlitres de la suspension de cellules ES parthogène à double knock-out dans la goutte moyenne M2 et utilisez une pipette buccale pour transférer 10 ovocytes M2 dans la même goutte. Faites pivoter un ovocyte et appliquez une pression négative à travers la pipette de retenue pour maintenir l’ovocyte de sorte que l’espace périvitellin fasse face à la pipette de micro-injection, en veillant à ce que la plaque métaphasée deux ne soit pas positionnée sur le chemin de la pipette de micro-injection.

Aspirez une cellule ES parthogène à double knock-out dans l’extrémité de la pipette de micro-injection et confirmez la rupture de la membrane cellulaire. Appliquez une légère pression négative sur la pipette de micro-injection et délivrez quatre impulsions piézoélectriques tout en poussant la pointe de la pipette de micro-injection vers l’espace périvitellin pour percer la zone pellucide. Pénétrez l’ovocyte avec une pipette de micro-injection de sorte que l’oolemma s’étire du côté opposé et appliquez une impulsion piézoélectrique pour percer l’oolemme, en vous assurant que l’oolemma il se détend le long de la tige de la pipette de micro-injection.

Injectez dans l’ovoplasme la cellule ES parthogène à double knock-out avec un volume minimal de milieu et retirez la pipette de micro-injection en douceur de l’ovocyte. Libérez l’ovocyte injecté de la pipette de retenue et déplacez-le sur le côté de la micro-goutte pour un prélèvement ultérieur. Lorsque tous les ovocytes ont été injectés, transférez les ovocytes dans une boîte centrale préchauffée contenant du milieu KSOM et incubez la boîte à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure avant l’activation.

L’analyse du contenu en ADN de cette lignée cellulaire ES parthogène représentative à double knock-out, porteuse du transgène CAG/EGFP par cytométrie en flux, illustre la distribution des cellules haploïdes et diploïdes aux phases G0, G1, S et G2 M. Un génotypage peut être effectué pour confirmer l’absence d’allèles de type sauvage au niveau des régions H19 et intergéniques différentiellement méthylées. Un transgène CAG/EGFP peut être introduit dans des cellules ES pathogènes à double knock-out pour étudier leur contribution aux embryons semi-clonés par la visualisation de la fluorescence verte au microscope.

L’analyse par cytométrie en flux montre que deux populations correspondant à la phase G2 M ont arrêté les cellules haploïdes et diploïdes après traitement par démuculcène. L’absence d’un pic haploïde 1N indique que le cycle de repos de la cellule était en grande partie terminé. Après l’injection, l’expression de l’EGFP est rarement détectée dans les embryons semi-clonés construits.

comme le cytoplasme des cellules ES parthogènes à double knockout se disperse dans le grand cytoplasme de l’ovocyte. Six heures après l’activation, jusqu’à trois globules polaires peuvent être observés au microscope. Le premier et le deuxième globule polaire de l’ovocyte et un pseudo globule polaire de l’ESC haploïde.

Pour démontrer leur capacité de développement, des embryons semi-clonés peuvent être cultivés jusqu’au stade de blastocytes. De plus, des souris femelles nées à terme peuvent être obtenues à partir d’embryons semi-clonés au stade de deux cellules transférés dans les oviductes de femelles receveuses. Lors de la micro-injection, il est important de rompre la membrane plasmique des cellules souches embryonnaires haploïdes lorsqu’elle apparaît pour empêcher la ségrégation chromosomique lorsque l’ovocyte est activé.

Au lieu de cellules ES haploïdes parthénogénétiques, des cellules ES haploïdes androgènes peuvent également être utilisées. Ce qui permet de sélectionner le gamète maternel ou paternel comme substitut des spermatozoïdes en fonction de l’objectif de l’étude.