Name: Application des cellules souches embryonnaires haploïdes parthénogénétiques de souris comme substitut du sperme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Découvrez l'utilisation de cellules souches embryonnaires haploïdes parténogénétiques comme substitut du sperme pour créer des embryons semi-clonés chez la souris. Cette méthode facilite l'étude de l'empreinte génomique.

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Nous remercions le Dr Giulio Di Minin pour la dérivation des lignes phaESC et le Dr Remo Freimann pour l’opération de cytométrie du débit. Nous reconnaissons également Mme Michèle Schaffner et M. Thomas M. Hennek pour leur soutien technique au transfert d’embryons. Ces travaux ont été soutenus par la Fondation nationale suisse pour la science (31003A_152814/1).

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<li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice%3A+A+decision+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li>
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<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li>
<li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li>
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<li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li>
<li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li>
<li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li>
<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
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<li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li>
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<li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li>
<li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+genome%3A+role+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+Supplement%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le clonage des mammifères par transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) a été pionnier dans les années 199019,20,21. Ces développements ont suivi des études de clonage menées 30 ans plus tôt chez lesamphibiens 22. Ce retard considérable reflète la difficulté de l’embryologie et de l’empreinte génomique chez les mammifères. Le développement du SCNT mammifère est à la base de l’application de l’haESC pour remplacer le sperme, qui est détaillée dans ce protocole.
La synchronisation du cycle cellulaire est un facteur important pour le succès de SCNT23. C’est également le cas pour l’injection de haESC dans ce protocole. L’introduction d’un génome donneur dans un receveur nécessite l’appariement des phases du cycle cellulaire afin d’éviter la rupture chromosomique ou les aneuploïdes qui abrogeraient le développement embryonnaire. Le semi-clonage a la complexité supplémentaire que deux génomes et un cytoplaste doivent être compatibles. Un rapport précédent a démontré que l’injection d’haESCs androgènes arrêtés en phase M a donné de meilleurs taux de développement d’embryons semi-clonés que l’injection d’haESCs de phase G1 dans les ovocytes7. Ce rapport suggère la phase M comme point de synchronisation approprié pour le semi-clonage. En conséquence, les phaESCs ont été mitotically arrêtés dans la metaphase avec la mémécolcine et injectés dans l’ooplasme des ovocytes de MII, qui ont été naturellement arrêtés dans la métaphe II de méiose. Fait important, l’arrestation en phase M peut être réalisée dans les ESC de souris avec une efficacité élevée, offrant une excellente synchronisation entre les cycles cellulaires des donneurs et des receveurs.
Pendant la mitose, la membrane nucléaire se décompose et un fuseau se forme auquel les chromosomes répliqués s’attachent. Après l’injection de DKO-phaESCs de phase M, les chromatides sœurs sont séparés en un corps pseudo polaire et le zygote7 (Figure 3E). Par conséquent, un seul ensemble de chromosomes provenant d’un DKO-phaESC contribue à l’embryon semi-cloné. Il est essentiel que les chromatismes sœurs des chromosomes DKO-phaESC puissent être correctement séparés après injection. La membrane plasmatique d’un DKO-phaESC intact empêche la ségrégation dans un corps pseudo polaire. Nous avons en effet observé de rares cas où la membrane plasmatique des DKO-phaESCs n’a pas été rompue, et les embryons ont montré des DKO-phaESCs intacts dans l’ooplasme après injection (figure 3D). Par conséquent, il faut prendre soin d’enlever la membrane plasmatique des DKO-phaESCs par pipetting. Pendant l’injection, il est tout aussi important d’éviter la perturbation du fuseau méiotique de l’ovocyte, qui pourrait conduire à des défauts de ségrégation chromosomique et induire une aneuploïde ainsi.
Chez les mammifères, l’empreinte génomique limite l’application de phaESCs comme substitut du sperme. Les haESCs parthénogénétiques possèdent une configuration maternelle des empreintes génomiques, tandis que le sperme possède une configuration paternelle. Par conséquent, la génération de chiots à terme n’a pas eu lieu après l’injection de phaESCs de type sauvage comme remplacement du sperme. Pour surmonter cette limitation, les suppressions des DMR IG- et H19- sont conçues en phaESCs. La modification de l’expression imprimée aux loci maternelles Igf2-H19 et Gtl2-Dlk1 est suffisante pour modifier la configuration des empreintes génomiques pour permettre la génération de souris semi-clonées avec une fréquence de plus de 5,1 %, basée sur des embryons transférés à 2 cellules. Ces observations suggèrent que le ciblage de deux gènes imprimés transforme le génome des phaESCs en une configuration paternelle fonctionnelle qui peut remplacer le sperme chez la souris. Néanmoins, une modification génétique permanente des phaESCs est nécessaire pour cette stratégie. Comme stratégie alternative, l’haESC androgène peut être considéré. Les haESCs androgènes sont dérivés du génome du sperme et possèdent des empreintes paternelles. Il y a eu des rapports que les haESCs androgènes de wildtype ont contribué en tant que remplacement de sperme pour produire des chiots à terme à une fréquence entre 1.3% et 1.9% des embryonstransférés 4,7,24. Des chiots à terme ont également été obtenus en injectant des haESCs androgènes avec des suppressions de l’IG- et h19-DMRs à une fréquence de 20,2% des embryons transférés à 2 cellules24. L’efficacité accrue du semi-clonage à l’aide d’haESCs androgènes modifiés est probablement parce que les empreintes peuvent devenir instables dans la culture. Les défauts d’impression sont corrigés par les suppressions génétiques des DMR critiques.
Compte tenu de la difficulté d’introduire des modifications génétiques directement dans les génomes des ovocytes ou des spermatozoïdes, les hésics sont un outil précieux pour manipuler les génomes parentaux séparément. L’utilisation d’haESCs comme substitut du sperme offre un avantage remarquable pour l’édition du génome dans la lignée germinale de la souris. Une étude récente a combiné l’édition du génome à base de CRISPR/Cas9 avec l’application d’haESCs pour la caractérisation des régions d’impression qui sont critiques pour le développement embryonnaire12. Cette étude a analysé le rôle des Rasgrf1-DMR en combinaison avec le H19-et IG-DMRs dans le développement de souris bimaternales, et la fonction de 7 DMR différents dans le développement de souris bipaternales. La méthode de substitution des HAESCs au sperme a servi de base à des approches de dépistage génétique pour identifier les acides aminés clés dans la protéine MDN1 dans le développement primordial des cellules germinales et pour identifier les gènesdans le développement osseux 24,25,26. Les études sur l’empreinte génomique et le dépistage génétique afin d’identifier les facteurs clés du développement embryonnaire sont des approches considérables pour l’application des HAESCs comme génomes gametiques.

Chez les mammifères, les gamètes sont les seules cellules qui transmettent des informations génétiques à la prochaine génération. La fusion d’un ovocyte et d’un spermatozoon forme un zygote diploïde qui se développe en animal adulte. Les mutations dans les génomes gametiques sont ainsi héritées par la progéniture et conduisent à des variations génétiques chez lesespèces 1. L’introduction de mutations dans la lignée germinale a été appliquée pour produire des animaux génétiquement modifiés pour diverses études biologiques, y compris la caractérisation de la fonction génétique et la modélisation des maladies. Les ovocytes et le spermatozoa sont des cellules en phase terminale différenciées et hautement spécialisées qui ont cessé la prolifération. Par conséquent, la modification directe des gamètes est techniquement difficile, et des approches spécialisées ont été développées. Des modifications génétiques peuvent être introduites dans la lignée germinale de la souris par l’injection d’ESCs génétiquement modifiés dans les blastocystes, où ils s’intègrent dans l’embryon en développement et colonisent la lignée germinale. En outre, la modification génétique des zygotes à l’aide d’approches d’édition du génome, y compris le système CRISPR/Cas9, est devenue largementadoptée 2.
Récemment, une approche exceptionnelle a été signalée, qui applique haESCs comme un substitut à un génome gametic3,4,5,6,7,8. Les HAESCs sont des lignées de cellules souches dérivées de la masse cellulaire interne des blastocystes haploïdes parthénogénétiques ou androgènes et possèdent un seul ensemble de chromosomes4,7,9,10. Il a été démontré que les haESCs parthénogénétiques et androgènes peuvent contribuer au génome des souris semi-clonées après injection intracytoplasmique dans les ovocytes. Contrairement à d’autres approches, les génomes des HAESC peuvent être directement modifiés en culture en raison de leur capacité d’auto-renouvellement. L’introduction de modifications génétiques dans la lignée germinale en remplaçant le sperme par des haESCs est une méthode importante pour les études biologiques. Il prévoit la possibilité de culturer et de manipuler séparément le génome maternel ou paternel, qui sont dérivés des haESCs parthénogénétiques ou androgènes, respectivement. Les HAESC peuvent ensuite être utilisés comme remplacement du génome gametique, ce qui est particulièrement avantageux pour les études d’empreinte génomique, d’expression spécifique à l’allèle et de processus spécifiques aux parents.
Chez la souris, des informations génomiques maternelles et paternelles sont nécessaires pour le développement normal del’embryon 11. Par conséquent, les petits à terme n’ont pas pu être obtenus lorsque des haESCs parthénogénétiques de type sauvage (phaESCs) ont été injectés pour remplacer le génome du sperme5,8. Pour surmonter le bloc de développement, l’empreinte génomique du génome maternel des haESCs parthénogénétiques doit être corrigée à une configuration paternelle. Ceci peut être réalisé par la manipulation des régions différemment méthylées (DMRs). À ce jour, des suppressions ciblées du H19-DMR, gtl2-Dlk1 IG-DMR, et Rasgrf1-DMR ont été étudiées pour réprimer les gènes exprimés maternellement dans les phaESCs3,5,8,12. Ces études ont démontré que les suppressions du H19-DMR et de l’IG-DMRsont suffisantes pour convertir une mère en une configuration d’empreinte paternelle qui peut remplacer les chromosomes du sperme. L’injection intracytoplasmique de phaESCs qui transportent les deux suppressions de DMR dans les ovocytes a donné des chiots semi-clonés avec une fréquence entre 5,1% et 15,5% des embryons transférés à 2 cellules.
Ce protocole est basé sur l’application de phaESCs avec suppressions de H19-DMR et IG-DMR, que nous qualions de phaESCs à double KO (DKO-phaESCs). Nous fournissons des instructions détaillées pour la modification de l’empreinte génomique dans les phaESCs pour établir des lignées DKO-phaESC, pour l’injection de DKO-phaESCs dans les ovocytes comme un substitut à un génome de sperme, pour la culture d’embryons semi-clonés aux blastocystes, et pour l’obtention de souris semi-clonées. Ce protocole est une référence pour les chercheurs qui nécessitent une manipulation précise et directe du génome paternel et de la génération d’embryons et de souris semi-clonés.

<table><tbody><tr><td>1,5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>12 puits Thermo</td><td>Scientific</td><td>150628</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>24 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>culture haESC</td></tr> 6 <tr><td>puits Thermo</td><td>Scientific</td><td>140675</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>fraction BSA</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>solution de démécolcine</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>DR4 souris</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>Milieu de congélation</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>culture HAEsc</td></tr><tr><td>Hepes solution</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>culture HAEcS</td></tr><tr><td>irradiée MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>culture HAE</td></tr>’<tr><td>LIF (facteur inhibiteur de leucémie)</td> <td>(Fait maison)</td><td>-</td><td>culture HAE’</td></tr>eC <tr><td>Réactif de lipofection</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>culture</td></tr> <tr>HAEChaESC<td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>piggyPlasmide porteur d’un transgène CAG-EGFP</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>piggyBac transposase plasmide</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>culture</td></tr> <tr>haESC<td>Plasmide pX330</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>pX458 plasmide</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>culture haESC</td></tr><tr><td>ADN polymérase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Génotypage</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Génotypage</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Génotypage</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Génotypage</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Génotypage</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Génotypage</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Génotypage</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Génotypage</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Génotypage</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Génotypage</td></tr><tr><td>Tube de 5 mL Falcon</td><td></td><td>352063</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>5 mL Tube avec capuchon de crépine</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>Calibre 30 Aiguille 1/2 pouce</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>B6D2F1 souris</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD santé animale</td><td>49451</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 UI</td><td>Boîte de superovulation</td></tr><tr><td>de 10 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Plaque à 4 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Tube de 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Boîte de 6 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Boîte à puits central</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Bascule numérique</td><td>Thermo Scientific</td> 88880020 <td>Manipulation d’embryons</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Capillaire en verre</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Manipulation d’embryons</td></tr><tr><td>Chlorure de strontium</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Seringue</td></tr><tr><td>de manipulation d’embryons 5ml</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Cappilaire en verre borosilicaté</td><td>Produit scientifique</td><td>GB100T-8P</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>CellTram 4r Huile</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Pipette de maintien</td><td>BioMedical</td> <td>Instruments-Microinjection</td><td></td></tr> <tr><td>Microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microforge</td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Pipette de micro-injection</td><td>BioMedical</td><td></td> <td>Instruments-Micro-injection</td></tr><tr><td>Microlaoder tips</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Bras micromanipulateurs</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Filtre seringue</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Microinjection</td></tr></tbody></table>

application des cellules souches embryonnaires haploïdes parthénogénétiques de souris comme substitut du sperme

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Dans les organismes ayant une reproduction sexuelle, les cellules germinales sont la source de cellules totipotentes qui se développent en nouveaux individus. Chez la souris, la fécondation d’un ovocyte par un spermatozoon crée un zygote totipotent. Récemment, plusieurs publications ont rapporté que les cellules souches embryonnaires haploïdes (HAESCs) peuvent remplacer les génomes gametiques et contribuer aux embryons, qui se développent en souris. Ici, nous présentons un protocole pour appliquer les haESCs parthénogénétiques comme substitut du sperme pour construire des embryons par injection intracytoplasmique dans les ovocytes. Ce protocole consiste en des étapes de préparation des HAESCs comme substitut du sperme, pour l’injection de chromosomes haESC dans les ovocytes, et pour la culture d’embryons semi-clonés. Les embryons peuvent donner des souris semi-clonées fertiles après le transfert d’embryons. L’utilisation des haESCs comme substitut de sperme facilite l’édition du génome dans la lignée germinale, les études sur le développement embryonnaire et l’étude de l’empreinte génomique.

Cet article vise à démontrer l’utilisation de cellules souches embryonnaires haploïdes parthénogénétiques comme substitut au sperme pour la construction d’embryons semi-clonés.

Application des cellules souches embryonnaires haploïdes parthénogénétiques de souris comme substitut du sperme

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Ce protocole date faussement la modification de l’empreinte génomique dans les cellules souches embryonnaires de souris haploïdes, comme celle de notre sujet due à de faux spermatozoïdes, permettant la génération d’embryons cultivés à la maison chez la souris. La modification génétique d’un gamète nécessite généralement des techniques difficiles. En utilisant cette méthodologie, les gamètes parentaux peuvent être manipulés dans des cellules souches embryonnaires hybrides pour une introduction ultérieure chez la souris comme option de remplacement des spermatozoïdes.Comme cette méthode permet de modifier artificiellement et spécifiquement un gamète paternel chez les embryons, elle est particulièrement applicable à l’étude de l’empreinte génomique et de la cautérisation. La démonstration de cette procédure sera faite par Charles Etienne Dumeau, un embryologiste de souris de mon laboratoire. Pour préparer les pipettes de maintien et de micro-injection pour l’expérience, utilisez d’abord un extracteur de micropipettes pour tirer des capillaires en verre borosilicaté de forme allongée et de conicité progressive.Pour préparer le maintien des pipettes, positionnez un capillaire tiré d’un diamètre extérieur de 60 à 100 micromètres dans une micro forge sur la perle de verre sur le filament. Allumez le filament et abaissez le capillaire jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la bille. Lorsque le capillaire s’est attaché à la perle, coupez le filament et rétractez le capillaire, ce qui provoque la rupture du capillaire avec une extrémité droite.Ensuite, positionnez l’embout capillaire cassé horizontalement à côté de la perle de verre sur le filament et chauffez le filament pour faire fondre l’extrémité jusqu’à ce que le diamètre intérieur de l’embout capillaire atteigne 10 à 20 micromètres de diamètre. Positionnez ensuite le capillaire au-dessus de la bille de verre à environ un millimètre de la pointe et chauffez le filament pour permettre au capillaire d’être plié à un angle de 20 degrés. Pour préparer une pipette de micro-injection, positionnez un capillaire tiré d’un diamètre extérieur d’environ six micromètres au-dessus de la bille de verre sur le filament chauffé et abaissez le capillaire jusqu’à ce qu’il entre en contact avec la bille.Une fois le capillaire attaché, coupez le filament et rétractez le capillaire. Le capillaire se brisera avec une extrémité droite. Déplacez ensuite le capillaire sur la perle de verre à environ un millimètre de l’extrémité du capillaire et chauffez le filament pour permettre au capillaire d’être plié à un angle de 20 degrés.Pour effectuer une injection intracytoplasmique, placez cinq gouttes d’un microlitre de solution PVP et 20 gouttes d’un microlitre de milieu M2 sur le couvercle renversé d’une boîte de 10 centimètres et couvrez les gouttes d’huile minérale. Placez le plat sur la scène et installez une pipette de maintien sur le micromanipulateur. À l’aide d’une pointe de micro-chargeur, remplissez la pipette de micro-injection d’huile fluorocarbonée et montez la pipette sur l’actionneur piézoélectrique.En observant au microscope, abaissez la pipette de micro-injection dans une goutte de solution PVP. Lorsque la pipette est immergée, pipette de haut en bas plusieurs fois pour enrober le verre avec le PVP. Chargez un petit volume de solution PVP dans la pipette de micro-injection.Immergez les pipettes de micro-injection et de maintien dans le milieu M2 et concentrez-vous sur la pipette au bas de la goutte. Transférez environ deux microlitres de la suspension de cellules ES parthogène à double knock-out dans la goutte moyenne M2 et utilisez une pipette buccale pour transférer 10 ovocytes M2 dans la même goutte. Faites pivoter un ovocyte et appliquez une pression négative à travers la pipette de retenue pour maintenir l’ovocyte de sorte que l’espace périvitellin fasse face à la pipette de micro-injection, en veillant à ce que la plaque métaphasée deux ne soit pas positionnée sur le chemin de la pipette de micro-injection.Aspirez une cellule ES parthogène à double knock-out dans l’extrémité de la pipette de micro-injection et confirmez la rupture de la membrane cellulaire. Appliquez une légère pression négative sur la pipette de micro-injection et délivrez quatre impulsions piézoélectriques tout en poussant la pointe de la pipette de micro-injection vers l’espace périvitellin pour percer la zone pellucide. Pénétrez l’ovocyte avec une pipette de micro-injection de sorte que l’oolemma s’étire du côté opposé et appliquez une impulsion piézoélectrique pour percer l’oolemme, en vous assurant que l’oolemma il se détend le long de la tige de la pipette de micro-injection.Injectez dans l’ovoplasme la cellule ES parthogène à double knock-out avec un volume minimal de milieu et retirez la pipette de micro-injection en douceur de l’ovocyte. Libérez l’ovocyte injecté de la pipette de retenue et déplacez-le sur le côté de la micro-goutte pour un prélèvement ultérieur. Lorsque tous les ovocytes ont été injectés, transférez les ovocytes dans une boîte centrale préchauffée contenant du milieu KSOM et incubez la boîte à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure avant l’activation.L’analyse du contenu en ADN de cette lignée cellulaire ES parthogène représentative à double knock-out, porteuse du transgène CAG/EGFP par cytométrie en flux, illustre la distribution des cellules haploïdes et diploïdes aux phases G0, G1, S et G2 M. Un génotypage peut être effectué pour confirmer l’absence d’allèles de type sauvage au niveau des régions H19 et intergéniques différentiellement méthylées. Un transgène CAG/EGFP peut être introduit dans des cellules ES pathogènes à double knock-out pour étudier leur contribution aux embryons semi-clonés par la visualisation de la fluorescence verte au microscope.L’analyse par cytométrie en flux montre que deux populations correspondant à la phase G2 M ont arrêté les cellules haploïdes et diploïdes après traitement par démuculcène. L’absence d’un pic haploïde 1N indique que le cycle de repos de la cellule était en grande partie terminé. Après l’injection, l’expression de l’EGFP est rarement détectée dans les embryons semi-clonés construits.comme le cytoplasme des cellules ES parthogènes à double knockout se disperse dans le grand cytoplasme de l’ovocyte. Six heures après l’activation, jusqu’à trois globules polaires peuvent être observés au microscope. Le premier et le deuxième globule polaire de l’ovocyte et un pseudo globule polaire de l’ESC haploïde.Pour démontrer leur capacité de développement, des embryons semi-clonés peuvent être cultivés jusqu’au stade de blastocytes. De plus, des souris femelles nées à terme peuvent être obtenues à partir d’embryons semi-clonés au stade de deux cellules transférés dans les oviductes de femelles receveuses. Lors de la micro-injection, il est important de rompre la membrane plasmique des cellules souches embryonnaires haploïdes lorsqu’elle apparaît pour empêcher la ségrégation chromosomique lorsque l’ovocyte est activé.Au lieu de cellules ES haploïdes parthénogénétiques, des cellules ES haploïdes androgènes peuvent également être utilisées. Ce qui permet de sélectionner le gamète maternel ou paternel comme substitut des spermatozoïdes en fonction de l’objectif de l’étude.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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Découvrez l'utilisation de cellules souches embryonnaires haploïdes parténogénétiques comme substitut du sperme pour créer des embryons semi-clonés chez la souris. Cette méthode facilite l'étude de l'empreinte génomique.

Application des cellules souches embryonnaires haploïdes parthénogénétiques de souris comme substitut du sperme

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