CRISPR/Cas9 Édition du gène C. elegans rbm-3.2 à l’aide du marqueur de criblage co-CRISPR dpy-10 et des complexes de ribonucléoprotéines assemblés.

Cette technique est bénéfique pour introduire des mutations précises dans C. elegans par édition du génome CRISPR/Cas9 dans un court laps de temps. Cette technique fournit une manière efficace et rationalisée d’éditer le génome de C. elegans, car l’utilisation d’un marqueur Co-CRISPR améliore considérablement la probabilité d’identifier les vers modifiés positivement. Assurez-vous de vous entraîner à effectuer les micro-injections et d’injecter les deux bras gonades d’autant de vers que possible pour augmenter les chances d’obtenir les modifications souhaitées.

Amy Smith, Mary Bergwell, Danita Mathew, Ellie Smith et Carter Dierlam, qui sont tous des étudiants de premier cycle de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour préparer les jeunes vers adultes à l’injection, prélevez C. elegans aux stades L2 et L3 sur une pelouse bactérienne fraîche sur une plaque MYOB et incubez la plaque à 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, préparer le mélange d’injection comme indiqué dans le tableau dans des tubes stériles sans nucléases et mélanger par pipetage.

Incuber le mélange d’injection à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour assembler les complexes ribonucléoprotéiques avant de faire tourner le mélange par centrifugation. Ensuite, utilisez un microscope de dissection pour choisir environ 30 jeunes vers adultes avec moins de 10 embryons dans l’utérus, et injectez les deux bras gonadiques de chaque ver avec quelques picolitres de mélange d’injection par bras. Après la micro-injection, à l’aide d’un appareil de récupération, pipeter doucement à la bouche les vers injectés à partir du tampon d’injection sur une plaque MYOB de 60 millimètres ensemencée d’OP50 E.coli

Laissez les vers injectés récupérer pendant une heure à température ambiante. À la fin de la période de récupération, utilisez un pic en fil de platine pour transférer chaque ver injecté sur une plaque de gélose MYOB de 35 millimètres et laissez les vers pondre à 20 degrés Celsius. Après 24 heures, transférez les vers injectés sur de nouvelles plaques individuelles de 35 millimètres.

Pendant trois à quatre jours après l’injection, utilisez un microscope à dissection pour identifier les plaques dont la descendance F1 présente des phénotypes de rouleaux, comme l’indique le corps de l’animal tournant autour de son axe long lorsque les animaux se déplacent dans un motif circulaire, et des phénotypes trapus, comme en témoigne une physiologie plus courte et plus robuste que celle des animaux témoins au même stade de développement. Transférez 50 à 100 vers à rouleaux F1 dans leurs propres assiettes individuelles et laissez les vers pondre des œufs pendant un à deux jours. Après un à deux jours de production de vis sans fin F2, transférez chaque mère de rouleau F1 d’une plaque numérotée dans son tube PCR numéroté correspondant contenant 2,5 microlitres de tampon de lyse complété par une dilution de 1:100 de 20 milligrammes par millilitre de protéinase K.Congelez les tubes à moins 30 degrés Celsius pendant 20 minutes avant de lyser les vers dans un thermocycleur, comme indiqué.

À la fin du cycle, ajoutez 12,5 microlitres de mélange PCR 2X contenant des désoxynucléosides triphosphates, de l’ADN polymérase, du chlorure de magnésium et un colorant de chargement, un microlitre d’amorce directe de 10 micromolaires, un microlitre d’amorce inverse de 10 micromolaires et suffisamment d’eau stérile pour porter le mélange réactionnel à 25 microlitres par échantillon de ver lysé. Ensuite, analysez les échantillons sur le thermocycleur comme indiqué. Pour détecter les modifications de moins de 50 paires de bases, transférez 10 microlitres de chaque réaction PCR dans un nouveau tube et ajoutez cinq microlitres du mélange principal de digestion de restriction dans chaque tube.

Incuber les réactions de digestion à 37 degrés Celsius pendant deux heures. À la fin de l’incubation, chauffez et activez les digestions avec une incubation de 10 à 15 minutes à 65 degrés Celsius. Ensuite, chargez toute la réaction de chaque tube dans un seul puits d’un gel d’agarose de 1 à 2 % et faites fonctionner le gel à 110 milliampères jusqu’à ce que la séparation de bande soit correcte

À la fin de la course, visualisez les gels d’agarose sous la lumière UV pour détecter la taille des bandes d’ADN. Les vers modifiés positivement afficheront une bande supplémentaire d’ADN à la taille attendue en raison de l’édition à l’aide du modèle de réparation, portant le site de restriction au locus souhaité dans le génome du ver. Choisissez huit à 12 vers F2 non roulants de type sauvage dans les plaques de vers à rouleaux F1 respectifs et laissez les vers pondre des œufs et produire une progéniture pendant un à deux jours.

Ensuite, identifiez les lignées de vers homozygotes comme démontré pour les vers édités positivement et analysez les résultats de séquençage à l’aide d’un logiciel d’analyse de séquences pour confirmer la présence de l’édition selon les protocoles standard. Ici, l’ADN génomique et l’ARN CRISPR conçu et le modèle de réparation pour le gène rbm-3.2 de C. elegans peuvent être observés. Dans cette analyse représentative, sept des 73 vers F1 se sont avérés positifs pour l’édition.

Les vers non édités présentaient un fragment d’ADN unique de 445 paires de bases lors de la digestion EcoRI, tandis que les vers porteurs d’un codon d’arrêt prématuré dans le gène rbm-3.2 présentaient deux fragments à 265 et 166 paires de bases lors de la digestion EcoRI. Des vers hétérozygotes modifiés ont montré trois fragments lors de la digestion EcoRI. Six des 12 vers F2 des hétérozygotes F1 positifs identifiés se sont révélés homozygotes pour l’édition d’intérêt.

L’ADN génomique d’une lignée de vers modifiée homozygote identifiée a ensuite pu être utilisé pour mettre en place une réaction de séquençage de l’ADN, qui a confirmé la présence de l’édition dans son état homozygote. Assurez-vous que les réactifs d’édition et les amorces de criblage sont correctement conçus et que le mélange d’injection est correctement préparé. Une micro-injection précise est également essentielle.

À la suite de cette procédure, une validation phénotypique de l’édition, le cas échéant, et une analyse de l’expression des gènes et des protéines peuvent être effectuées pour vérifier l’exactitude de l’édition du génome.