Isolement et différenciation des préadipocytes primaires blancs et bruns de souris nouveau-nées

Ce protocole fournit une stratégie simple pour générer des modèles culturels cellulaires d’adipocytes blancs et bruns qui récapitulent fidèlement in vitro, la physiologie du tissu adipeux que nous avons in vivo. Ce protocole permet l’isolement simultané des préadipocytes blancs et bruns des souris nouveau-nées et les cellules que nous isolons utilisant cette méthode évaluent la capacité proliférative élevée et le potentiel de différenciation. Les cellules isolées à l’aide de cette approche reflètent mieux la complexité du tissu adipeux que les autres modèles de culture.

Et il peut être utilisé pour étudier plus précisément la fonction des adipocytes dans l’obésité et le diabète. Nous nous concentrons principalement sur la compréhension du dysfonctionnement du tissu adipeux dans l’obésité. Cependant, les cellules préparées avec cette méthode peuvent également être utilisées pour étudier des questions de base sur les cellules en biologie du développement.

La clé d’une expérience réussie est de déterminer comment identifier les dépôts adipeux blancs comme ces dépôts, qui sont petits, mais très riches et proliférant les préadipocytes peuvent être difficiles à distinguer chez les chiots. La démonstration visuelle illustre à quel point ce protocole est simple et permet de fournir des conseils pour localiser et disséquer les dépôts adipeux blancs et bruns. Voir l’isolement du dépôt est très utile.

Pour recueillir le tissu adipeux blanc sous-cutané, coupez la peau autour de l’abdomen d’un nouveau-né euthanasié et tirez doucement la peau sous les jambes. Sans collecter de tissu cutané, récoltez soigneusement le dépôt de graisse, qui apparaîtra comme un tissu clair ou blanc, mince et allongé attaché à l’intérieur de la peau ou au-dessus du quadriceps. Rincez le dépôt récolté en PBS et placez le tissu adipeux dans un tube de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de PBS et 200 microlitres de tampon d’isolement 2X sur de la glace.

Pour recueillir le tissu adipeux brun interscapulaire, tirez la peau des omoplates sur la tête et soulevez le tissu adipeux brun rouge profond situé entre les omoplates. Faites soigneusement des incisions tout autour de l’adipeux pour le détacher du corps et vérifier la consistance et la couleur du tissu. Après le rinçage, placez le tissu dans un deuxième tube de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de PBS et 200 microlitres de tampon d’isolement 2X sur de la glace.

Lorsque tous les dépôts ont été collectés, utilisez des ciseaux pour hacher doucement chaque dépôt quatre à six fois directement à l’intérieur des tubes et ajoutez 50 microlitres de collagénase 10X dans un tampon d’isolement 2X à chaque tube. Ensuite, inversez rapidement les tubes pour mélanger et placer les tissus dans un mélangeur à température contrôlée pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 1400 tours par minute. À la fin de la digestion, replacez les tubes sur de la glace et filtrez les tissus digestifs à travers des passoires cellulaires de 100 microns dans de nouveaux tubes de 50 millilitres.

Pour maximiser le rendement cellulaire, rincez chaque tube avec un millilitre de milieu d’isolement et filtrez ce lavage à travers la passoire. Diluer les solutions de tissu adipeux brun et blanc à deux millilitres de suspension tissulaire par puits et par dépôt dans un milieu d’isolement frais. Plaquez ensuite deux millilitres de suspension de tissu adipeux blanc à chacun des quatre à six puits et deux millilitres de suspension de tissu adipeux brun à chacun des deux à trois puits d’une plaque de six puits à travers un filtre de 100 microns par puits.

Lorsque toutes les cellules ont été plaquées, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 60 à 90 minutes. À la fin de l’incubation, lavez chaque puits avec deux millilitres de milieu sans sérum et agitez doucement la plaque pour détacher les cellules sanguines du fond des puits. Après trois lavages, ajoutez deux millilitres de milieu d’isolement frais aux puits et retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire.

Lorsque les cellules atteignent 80 à 90% de confluence, enrobez les nouvelles plaques de destination de gélatine stérile à 0,1% dans de l’eau distillée à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pendant que les plaques couvent, lavez les cellules avec du PBS avant de les traiter avec de la trypsine pendant trois minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules se sont détachées, pipettez la suspension cellulaire plusieurs fois pour maximiser la récupération des cellules et transférer les cellules dans un nouveau tube.

Lorsque toutes les cellules ont été collectées, lavez-les bien avec un millilitre de milieu d’isolement et tirez les lavages avec la suspension cellulaire. Recueillir les cellules par centrifugation et ressusciter la pastille dans trois à cinq millilitres de milieu d’isolement pour le comptage. Diluer les cellules à la concentration appropriée pour le placage dans un milieu d’isolement frais et laver les plaques recouvertes de gélatine avec du PBS pour éliminer tout excès de gélatine.

Ensemencez ensuite les cellules sur les plaques enrobées de gélatine et retournez les cellules à l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque les cellules atteignent la confluence, remplacez le milieu d’isolement par un milieu de différenciation. Si vous différeciez les préadipocytes bruns du tissu adipeux, ajoutez également une triiodothyronine nanomolaire.

Après 48 heures, rafraîchissez le milieu avec le volume approprié de milieu d’entretien par culture. À ce stade, l’accumulation de petites gouttelettes liquides dans les cellules devrait devenir visible sous microscopie à champ lumineux. Même après filtrage, certains débris cellulaires et cellules sanguines restent dans la suspension cellulaire.

Des lavages doux une heure après le placage élimineront les cellules non pertinentes, car les préadipocytes se fixent rapidement au fond du puits. Bien que les préadipocytes blancs et bruns isolés chez les nouveau-nés aient une capacité proliférative élevée, le rendement en préadipocytes blancs est généralement deux fois plus élevé que celui des préadipocytes bruns par dépôt. Par conséquent, si des cultures synchronisées sont souhaitées, cette densité de départ des préadipocytes blancs doit être calculée en conséquence.

À la fin de la différenciation, les cellules sembleront être chargées de gouttelettes lipidiques et exprimeront des marqueurs classiques d’adipocytes blancs et bruns, respectivement. Dans cette analyse comparative de la consommation d’oxygène dans un test d’effort mitochondrial des adipocytes blancs et bruns primaires dans des conditions basales, aussi bien qu’en réponse aux stimulateurs connus de la fonction mitochondrique, on peut observer ces capacités bioénergétiques spécifiques de chaque type de cellule. N’oubliez pas que nous isolons des cellules vivantes et que nous voulons les culturer pendant plusieurs jours.

Assurez-vous donc de maintenir des conditions stériles pendant l’isolement pour éviter la contamination, ce qui peut compromettre la culture suivante. Cette méthode génère des adipocytes entièrement matures qui peuvent être utilisés pour différentes applications, y compris des tests fonctionnels, des tests génétiques ou chimiques, ou le profilage omique pour étudier les mécanismes cellulaires autonomes qui ont un impact sur la fonction des adipocytes.