Préparation d’échantillons pour le profilage métabolique à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI

La spectrométrie de masse MALDI Imaging est une avancée unique dans le domaine de la métabolomique qui nous permet de mesurer et de visualiser l’abondance et la distribution relatives des métabolites, qui sont indicatives des organismes et des conditions physiologiques et pathologiques. Le principal avantage de l’imagerie MALDI est sa capacité à détecter les métabolites dans le C2 sans avoir besoin de marquage. Pour faire la démonstration de la procédure, nous vous présentons Sami Sauma, un étudiant diplômé du laboratoire du Dr Patricia Casita.

Yuki Chen et Kelly Veerasammy, étudiantes chercheuses de mon laboratoire. Après la récolte, placez immédiatement le tissu dans un bateau à l’azote liquide, refroidi, en papier d’aluminium et une boîte en polystyrène. Enfermez le couvercle de la boîte en polystyrène pour congeler le mouchoir pendant 2 à 10 minutes, selon la taille du mouchoir.

Lorsque le tissu est suffisamment congelé, utilisez une pince pour retirer le bateau et transportez le tissu fixé dans la feuille sur de la glace sèche jusqu’au cryostat. Avant de sectionner le tissu, en prenant soin de ne pas respirer sur les lames. À l’aide de gants et d’un voltmètre réglé sur la résistance, testez la conductivité du nombre approprié de lames de verre recouvertes d’oxyde d’indium et d’étain compatibles MALDI pour l’analyse.

Après l’étiquetage, placez les lames sur une serviette en papier propre et un cryostat nettoyé à 70 % d’éthanol réglé à moins 20 degrés Celsius. Placez l’échantillon de tissu dans le cryostat et réglez la température de la chambre du cryostat et de la tête de l’échantillon, en fonction du type de tissu. Après avoir laissé le tissu s’équilibrer pendant 30 minutes, utilisez un composé d’enrobage de tissu cryogénique pour monter le tissu sur le mandrin.

Et placez et verrouillez une lame propre dans la platine, ajustez la position de la platine et l’angle de l’échantillon pour obtenir l’angle de coupe souhaité. Et sectionnez le tissu jusqu’à ce que la région d’intérêt soit révélée. Lorsque la région souhaitée a été atteinte, obtenez des sections de 10 à 12 microns d’épaisseur, à l’aide d’une brosse pré-refroidie pour collecter soigneusement, mais rapidement chaque section sur le côté étiqueté de chaque lame au fur et à mesure de leur acquisition.

Placez un doigt sous les glissières pour réchauffer les sections, afin d’assurer un montage sûr sur la glissière. Les sections deviendront transparentes en 5 à 10 secondes et deviendront opaques après environ 30 à 60 secondes. Lorsque toutes les sections ont été collectées, placez les lames dans le support de diapositives et transportez-les sur de la glace carbonique jusqu’à un désecrateur.

Alternativement, les lames peuvent être transportées dans une boîte à vide. Placez les lames dans un déshydratant et séchez-les sous vide pendant 45 à 60 minutes. Après séchage, si vous ne les utilisez pas immédiatement, placez les lames dans le transporteur de lames et remplissez le transporteur d’azote.

Fermez le support avec du parafilm et placez-le dans un sac zippé. Ensuite, placez le premier sac zippé dans un deuxième sac zippé étiqueté contenant un déshydratant pour un stockage à moins 80 degrés Celsius jusqu’à six mois. Après la déshydratation, utilisez un marqueur argenté à pointe grasse pour placer des marques X sur les espaces vides des lames à l’extérieur des sections de tissu et utilisez un marqueur noir à pointe fine pour placer un deuxième X noir sur chaque X argenté. Chargez une diapositive dans la cible métallique de la diapositive MALDI et placez un couvercle en plastique sur la lame.

Tracez le contour de l’emplacement de l’échantillon sur le couvercle en plastique et placez la lame et la cible MALDI sur la surface d’un scanner à plat. Prévisualisez ensuite la diapositive et sélectionnez la zone souhaitée. Numérisez la diapositive en échelle de gris 16 bits, en 2 400 points par pouce et enregistrez l’image pour une utilisation ultérieure.

Pour appliquer une matrice sur les lames, allumez une unité de pulvérisation matricielle automatique, en vous assurant que la vanne est positionnée à charge, et lancez le logiciel du pulvérisateur. Vérifiez que le ventilateur d’extraction fonctionne correctement et vérifiez sous l’onglet communications que le système communique correctement. Démarrez la pompe à solvant à 100 microlitres par minute avec une contre-pression d’environ 500 livres par pouce carré.

Et réglez le réservoir d’azote à 30 livres par pouce carré pour commencer le flux d’air comprimé vers le pulvérisateur matriciel. Ajustez le régulateur de pression à l’avant du pulvérisateur à 10 livres par pouce carré et réglez la température de la buse du pulvérisateur comme vous le souhaitez. Avec la valve et la position de charge, utilisez la seringue pour rincer la boucle avec sept millilitres de méthanol à 70 % avant de remplir la boucle avec six millilitres par matrice.

Placez une glissière en verre vierge dans le support et le pulvérisateur, en collant les deux extrémités pour éviter tout mouvement et vérifiez que le débit et la température sont stables. Appuyez sur start pour régler la température de la buse et pour ajuster le débit de la pompe, en fonction de la méthode sélectionnée. Basculez la vanne de la charge à la pulvérisation et cliquez sur continuer.

Laissez le système s’exécuter jusqu’à la fin - effectué. Lorsque le dépôt est terminé, basculez la vanne de pulvérisation à charge et cliquez sur continuer. Examinez le modèle de codage matriciel au microscope.

Si une couche uniforme de cristal à matrice fine est observée, déposez la matrice sur les lames d’échantillon appropriées, comme cela vient d’être démontré. Lorsque toutes les lames ont été traitées, nettoyez le système selon les instructions du fabricant pour éviter l’obstruction de la buse du pulvérisateur. Ici, des images de sortie de l’analyse des données d’imagerie MALDI MS des spectres de décharge de masse sélectionnés à tous les intervalles de 100 Dalton, dépeignant clairement l’utilité pour l’identification des spectres allant des métabolites de petites molécules aux lipides de haut poids moléculaire, sont présentées.

Chaque route représente des cartes thermiques ioniques respectives contenant des informations spatiales et spectrales d’une espèce de métabolite spécifique dans trois tissus collectés aux jours 1, 21 et 60 postnatals. L’une des forces de la méthodologie MALDI MSI est la capacité de discerner la spécificité de certaines espèces identifiées par le rapport masse/charge à des étapes de développement ou à des structures anatomiques spécifiques. Dans cette analyse, on a observé que certains métabolites étaient enrichis chez les nouveau-nés du premier jour postnatal ou chez les adultes du 60e jour postnatal, ou qu’ils étaient uniformément répartis entre les âges testés.

D’autres espèces moléculaires ont été observées comme étant spécifiquement enrichies en matière grise, en substance blanche ou en liquide céphalo-rachidien et ventricules. La distribution spatiale des métabolites représentatifs, y compris l’hypoxanthine, l’acide glutamique, l’acide N-acétyl aspartique, l’acide arachidonique et plusieurs lipides, a également été analysée. Pour maintenir la fidélité des stata métaboliques, une dissection appropriée de l’échantillon, le stockage et la section cyro sont essentiels pour prévenir les changements métaboliques artificiels.

Après avoir effectué votre expérience MALDI, vous voudrez peut-être vérifier l’identité des métabolites que vous avez trouvés. Cela peut être réalisé par micro-extraction et chromatographie liquide en tandem MS. MALDI MS Imaging facilite l’enquête basée sur la métabolomique avec une résolution spatiale et offre aux chercheurs la possibilité de déterminer les données métaboliques sur un support quantitatif et visuel. On s’intéresse beaucoup récemment à l’effet de l’alimentation dans les troubles neurodégénératifs, à la relation entre le microbiome intestinal et le cerveau.

C’est pourquoi l’étude du métabolisme en neurosciences a pris une importance considérable, du développement neurologique à la neurodégénérescence. Le fait principal de l’interaction intestin-cerveau. Et c’est dans ce contexte que l’idée de l’installation MALDI Imaging peut vraiment fournir des technologies exceptionnelles pour visualiser l’effet qu’une manipulation spécifique pourrait avoir sur le cerveau.