Laser Doppler Perfusion Imaging dans l’hindlimb souris

L’ulcération de peau avec la guérison inadéquate de blessure est une cause principale d’amputation dans les patients humains. La guérison adéquate de blessure exige des niveaux plus élevés de profusion artérielle qui sont nécessaires pour maintenir la peau intacte, qui est compromise dans les patients présentant la maladie artérielle périphérique. Plusieurs autres affections rhumatismologiques et le diabète peuvent également conduire à une microcirculation cutanée perturbée et inadéquate pour guérir les blessures.

Beaucoup de patients diabétiques ont la maladie artérielle périphérique concomitante, les plaçant à un risque particulièrement élevé pour l’amputation. Laser Doppler perfusion imagerie ou LDPI est utilisé dans des situations cliniques pour évaluer la microcirculation de la peau ainsi que dans des situations de recherche pour évaluer le flux sanguin et la récupération du flux sanguin après ischémie postérieuse expérimentale, reperfusion ischémie et volets microchirurgiques. Le système LDPI projette un faisceau laser de faible puissance qui est dévié par un miroir à balayage pour se déplacer sur une région d’intérêt.

Cela diffère de la flowmétrie laser Doppler, qui fournit une mesure de perfusion pour la petite zone de tissu en contact direct avec la sonde flowmetry. Lorsque le faisceau laser interagit avec le sang en mouvement dans la microvasculature, il subit un changement de fréquence Doppler qui est photodétecté par le scanner et converti en unités de perfusion arbitraires. Étant donné que le LDPI est une technique basée sur la lumière, il est limité en termes de profondeur de pénétration à 0,3 à 1 millimètre, ce qui signifie que, pour la plupart, la perfusion cutanée est évaluée.

Le débit cutané peut être modifié par la température de la peau et le système nerveux sympathique, qui peut être affecté par divers agents anesthésiques. Les mesures du laser optique sont également affectées par les conditions d’éclairage ambiant, la pigmentation de la peau et peuvent être bloquées par la fourrure ou les cheveux. LDPI est la technique de recherche la plus couramment utilisée pour surveiller la récupération de la profusion après ischémie parce qu’elle n’est pas invasive, ne nécessite pas d’administration de contraste, et a des temps d’analyse rapide permettant la collecte de données sur plusieurs animaux.

Il est donc idéal d’aider à déterminer si les traitements destinés à l’artériogenèse thérapeutique ou à l’angiogenèse sont efficaces dans les modèles de petits animaux. La récupération du flux sanguin après ischémie postérieur mesurée par LDPI est bien corrélée avec le développement de l’artère collatérale lorsqu’elle est évaluée par d’autres moyens tels que la coulée de microfill ou micro CT. L’objectif de ce protocole est de démontrer l’évaluation de la perfusion postérieur à l’aide de LDPI. Réglez la hauteur du scanner de sorte que la distance au sujet de balayage est d’environ 30 centimètres.

Allumez l’imageur et lancez le logiciel associé. Ouvrez le programme de mesure. Si le logiciel communique correctement avec le scanner, le laser infrarouge allume l’avertissement.

Ajustez les paramètres du scanner pour qu’ils conviennent au matériau de fond et à la configuration de l’éclairage dans la pièce. Fixez le seuil d’arrière-plan en pointant le faisceau laser vers le matériau de fond noir et appuyez sur Auto BK Set. Mettre en place la chambre d’induction isoflurane avec un encavenir approprié des déchets de gaz.

Placer la chambre d’induction sur un coussin chauffant aidera à prévenir la perte de température de la souris pendant l’induction de l’anesthésie. Allumez la couverture homéothermique, qui est placée dans la zone de balayage sous une surface non réfléchissante. Dans ce cas, un tissu en néoprène noir.

La couverture homéothermique est réglée pour maintenir une température corporelle de 37 degrés Celsius. Placez la sonde de température et les lubrifiants afin qu’ils soient prêts pour l’insertion. Placez également le masque facial et le système de balayage de l’anesthésie dans la zone de balayage.

Anesthésier la souris à l’aide d’un vaporisateur d’isoflurane. Le taux d’oxygène est fixé à un litre par minute de débit. Et l’isoflurane est ajusté à 4% pour l’induction de l’anesthésie.

Le flux est activé à la chambre d’induction de l’anesthésie et le taux de respiration de la souris ralentira. Une anesthésie adéquate est obtenue lorsque la souris perd son réflexe de droitage. Transférer la souris à un cône de nez masque anesthésique avec charognard de gaz de déchets attachés et ajuster l’isoflurane à 1,5%Ce niveau d’anesthésie est généralement suffisant pour garder la souris couchée relativement immobile pendant le balayage, mais n’est pas destiné à fournir des niveaux chirurgicaux d’anesthésie.

Ainsi, la profondeur de l’anesthésie n’est pas vérifiée. Changer le niveau d’isoflurane provoque des changements dans la fréquence cardiaque, la respiration et la profusion cutanée. Ainsi, un pourcentage constant doit être utilisé tout au long de toute expérience de cours de temps et pour tous les sujets expérimentaux.

D’autres techniques anesthésiques, telles que l’injection IP de kétamine xylazine peuvent également être utilisées, mais la même technique anesthésique doit être utilisée tout au long de toute étude de cours de temps que différents anesthésiques affectent profusion cutanée différemment. Si la région d’intérêt du plan à numériser est couverte de fourrure, utilisez une petite tondeuse électrique et/ou une crème depilatory pour enlever les cheveux de la région d’intérêt. Les crèmes depilatory devraient être complètement enlevées et la peau de souris séchée avant de numériser car la peau humide peut causer des réflexions du laser Insérer la sonde lubrifiée de température rectale associée à la couverture homéothermique dans le rectum de souris.

Equilibrer la température de la souris pour désirer la température de balayage, 37 degrés Celsius. Cela peut prendre jusqu’à cinq à dix minutes. Sélectionnez Configuration scanner accessible à partir du menu supérieur ou de l’icône Configuration scanner.

La zone d’analyse doit être ajustée en modifiant les coordonnées X et Y pour tenir compte de la région d’intérêt. La vitesse d’analyse dépendra de la résolution de l’analyse. Une résolution plus élevée se traduira par des temps d’analyse plus longs.

Pour la numérisation répétée, en se concentrant sur la profusion globale, par opposition à une résolution plus élevée se concentrant sur la perfusion anatomique, la vitesse de balayage la plus élevée de quatre millisecondes par pixel est suffisante. Si vous effectuez des analyses répétées, sélectionnez l’onglet Répéter et line scan. Le nombre d’analyses peut être modifié.

Dans ce cas, trois scans, ainsi que l’intervalle de répétition. Le temps minimum pour l’intervalle de répétition serait les temps de numérisation estimés indiqués dans la zone grisée à droite de la boîte, déterminés par la zone d’analyse et la résolution de balayage. L’ajout de quelques secondes permet à l’utilisateur de mettre en pause et potentiellement de repositionner la souris si nécessaire entre les analyses.

Le temps total d’analyse dans ce cas est de trois minutes et 21 secondes. Sélectionnez l’onglet Analyse d’image et sélectionnez le bouton Marque. Cela provoquera le laser pour décrire la zone de balayage.

Ajustez la position de la souris de sorte que la cible à numériser se trouve dans la zone marquée. Commencez la mesure répétée en sélectionnant l’icône Repeat Scanning et en appuyant sur le bouton Lecture pour lancer l’analyse. Une fenêtre contexturée confirmant la distance de balayage apparaîtra.

Cliquez sur OK pour commencer à numériser. Le balayage initial d’une souris avant l’induction de l’ischémie postérieur est montré en temps réel. Les deuxième et troisième balayages répétés sont accélérés à la vitesse de 16x.

La fenêtre principale affiche les résultats de l’analyse tel qu’il est généré par le logiciel. L’encart en bas à droite montre le laser scannant les pavés de souris. Pour le footpad ou le footpad et le balayage dorsal de veau, le positionnement enclin avec les limites postérieures étendues vers la queue fournit une région plus cohérente d’intérêt dans le positionnement de supination.

L’artère fémorale, l’artère saphenous et les garanties sont très proches de la surface ventrale de la cuisse et du veau. Ainsi, le positionnement supin est préférable si vous utilisez ces régions d’intérêt. Surveillez la souris pendant la numérisation du mouvement de la souris.

Si la souris se déplace suffisamment pour que les pieds ne soient plus dans la région de balayage au milieu d’un scan, redémarrez l’analyse. De petites variations dans la position du footpad de souris peuvent être prises en compte dans les logiciels d’analyse. En outre, surveillez la température de la souris pendant le processus de balayage car elle peut fluctuer même avec l’utilisation de la couverture homéothermique.

S’il y a trop de variation dans la température de la souris, cela peut entraîner des variations significatives entre les scans. En général, une plage de température de 36,8 à 37,2 donnera lieu à des données acceptables. Enregistrez l’analyse capturée sous la fenêtre Enregistrer comme avec un nom de fichier qui inclut l’identificateur de souris et le point de temps pour une analyse plus facile des données.

Entrez les détails de la souris et du point de temps si désiré dans la fenêtre Détails du sujet. Le balayage ventral d’arrière-point avec la souris dans la position de supination est montré ici après ajustement de la zone de balayage. Notez que la proposition avec la sulfpine de souris entraîne une partie variable du côté du pied étant scanné.

Retirez la sonde de température rectale et désinfectez-la avec 70% d’éthanol afin qu’elle soit prête pour la prochaine souris. Diminuer l’isoflurane à 0%La souris récupérera plus rapidement si elle continue à recevoir de l’oxygène, mais elle peut également être récupérée sans oxygène supplémentaire. Laissez la souris se remettre de l’anesthésie au point où elle affiche un réflexe de redressage en retournant de la position supine à la position couchée avant de la retourner à la cage.

La récupération peut être effectuée soit sur une couverture chauffante pour l’isoflurane, puisque la récupération est très rapide ou dans une cage de récupération chaude pour la kétamine xylazine. Ouvrez le logiciel d’examen d’imagerie. Une nouvelle fenêtre pour examiner les analyses s’ouvrira.

Allez dans le menu Fichier, Ouvrez et localisez le fichier enregistré. Sélectionnez l’icône ROI à partir de la barre d’outils. Sélectionnez l’icône Ajouter polygone.

Tracez une zone autour de la région d’intérêt à l’aide de la souris. Une fois terminé, retournez à la barre d’outils et sélectionnez l’icône Statistiques. Cela permettra de mettre en place une fenêtre montrant les statistiques de la région d’intérêt.

Lors de l’examen des données, les valeurs moyennes de l’unité de profusion, ou PU, ne varient pas de plus de 100 à 150 UDI par rapport aux scans répétés pour chaque footpad. Il s’agit d’un balayage acceptable et indique que la souris a été bien calibrée pendant l’analyse. Les valeurs moyennes de PU avec variation supérieure à 100 à 150 UI, ce qui correspond à plus de 10 % de la perfusion moyenne d’un tapis de souris non actionné au cours des balayages répétés, indiqueraient que la souris n’était pas bien calibrée et qu’une analyse répétée est fortement suggérée.

Effectuer une analyse rapide immédiatement après la fin de l’analyse permet d’effectuer une analyse répétée pendant que la souris est encore anesthésiée et d’éviter de perdre un point de données qui pourrait se produire si les analyses sont analysées à une date ultérieure et qu’une analyse est jugée inacceptable en raison d’une variation significative entre les analyses répétées. Les résultats sont exprimés comme un rapport de profusion chirurgicale d’arrière-limite sur la perfusion postérieure de contrôle pendant que les souris d’abord vasodilate et développent alors leurs garanties intrinsèques, la récupération de flux sanguin par LDPI devrait être vue au-dessus d’un cours postopératoire de temps. Le degré de récupération dépend de la souche de la souris et de la gravité du modèle d’ischémie postérieur.

Ce chiffre montre une expérience de cours de temps terminée sur 28 jours où LDPI a été utilisé pour mesurer la récupération du flux sanguin footpad au fil du temps après ligature artérielle fémorale et P27 KO et sauvage type C57Bl/6 souris. Les deux KO P27 chez les souris de type sauvage avaient altéré la récupération du flux sanguin lorsqu’elles étaient traitées avec de la doxycycline orale, un inhibiteur généralisé des métalloprotéines de matrice, suggérant que l’activité de MMP facilite l’artériogenèse. La configuration du gain et le seuil d’arrière-plan doivent être maintenus constants pendant toute l’expérience de cours de temps.

Si le seuil d’arrière-plan est fixé trop bas, la numérisation du matériau d’arrière-plan se traduira par de faibles valeurs de profusion. Il en résultera que les valeurs de profusion de fond seront moyennes dans la région d’intérêt pendant la sélection des polygones. Pour éliminer ce problème, le seuil d’arrière-plan peut être ajusté dans la fenêtre configuration du scanner sous l’onglet Général.

Dans ce cas, l’augmentation du seuil de fond à 118 unités de profusion entraîne l’arrière-plan gris qui ne sera inclus dans aucune analyse. La palette ou l’échelle de couleur de l’image de flux peut être ajustée à la fois dans le logiciel de mesure et le logiciel d’examen d’image. Toutes les valeurs de profusion supérieures à la valeur maximale sur l’échelle seront affichées comme la couleur de profusion la plus élevée.

Dans ce cas, rouge. L’augmentation de la plage dynamique, par exemple, en changeant l’échelle pour varier de zéro à 1500, rendra la variation de balayage répétée plus évidente à l’œil que les zones mesurant entre 1000 à 1500 unités de profusion seront maintenant affichés en utilisant le gradient de couleur plutôt que tous étant montrés comme rouge. L’analyse montrée ici a été obtenue chez une souris dont la température corporelle centrale était initialement inférieure à 36,8 au début de l’analyse répétée, puis a augmenté au cours des balayages répétés.

Notez que la profusion moyenne du footpad de contrôle a été plus effectée par la température corporelle centrale plus froide que le footpad ischémique. Un seul balayage de la température corporelle plus fraîche aurait eu comme conséquence un rapport plus élevé de profusion étant enregistré pour ce point de données. La variation de la pigmentation de la peau de souris, comme on peut le voir chez les souris C57Bl/6, peut rendre difficile l’analyse de la zone de balayage inférieure à la valeur du seuil de fond, ce qui rendra difficile l’analyse des régions d’intérêt contenant des zones pigmentées.

Les pavés de souris en général n’ont pas d’hyperpigmentation, ce qui en fait la zone la plus pratique pour scanner cette souche de souris. Si le chercheur souhaite étudier l’embryon ventral, une souche de souris blanche doit être sélectionnée. LDPI est une méthode efficace, facilement exécutée, et reproductible pour mesurer la profusion cutanée d’hindlimb comme reflet de la perfusion artérielle globale.

Une technique cohérente est nécessaire lors de l’utilisation de LDPI pour obtenir des données fiables.