Name: Laser Doppler Perfusion Imaging dans l’hindlimb souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Découvrez l'imagerie Laser Doppler pour mesurer la perfusion sanguine dans l'hindlimb de souris. Cette technique non invasive évalue la microcirculation cutanée et facilite l'étude de la cicatrisation des plaies.

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Ces travaux ont été réalisés avec l’utilisation d’installations et de ressources au VA Puget Sound Health Care Center. L’œuvre est celle de l’auteur et ne reflète pas nécessairement la position ou la politique du ministère des Anciens Combattants ou du gouvernement des États-Unis. Le Dr Tang est actuellement financé par l’intermédiaire de l’AV (Merit 5 I01 BX004975-02).

Les expériences sur les animaux ont été réalisées selon un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Washington.
1. Préparation du scanner
<ol><li>Ajustez la hauteur du scanner de sorte que la distance avec le sujet numérisé est d’environ 30 cm.</li>
	<li>Allumez l’imageur et lancez le logiciel associé.</li>
	<li>Ouvrez le programme de mesure. Si le logiciel communique correctement avec le scanner, le laser infrarouge allume l’avertissement apparaîtra.</li>
	<li>Calibrer la machine avec des normes fournies par le fabricant (non indiquées dans la vidéo et dépendra du modèle spécifique de machine utilisée).</li>
	<li>Ajustez les paramètres du scanner pour qu’ils conviennent au matériau de fond et à la configuration de l’éclairage dans la pièce.<ol>
<li>Définissez les niveaux de gain DC FLUX et CONC, selon les instructions du fabricant (non indiquées dans la vidéo).</li>
		<li>Définissez le seuil d’arrière-plan en pointant le faisceau laser vers le matériau de fond noir, et appuyez sur Auto BK Set.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation de pré-balayage de souris
<ol><li>Mettre en place la chambre d’induction isoflurane avec le collecte approprié du gaz de déchets. REMARQUE : Placer la chambre d’induction sur un coussin chauffant aidera à prévenir la perte de température de la souris pendant l’induction de l’anesthésie.</li>
	<li>Allumez la couverture homéothermique, qui est placée dans la zone de balayage sous une surface non réflexive (dans ce cas un tissu en néoprène noir). Réglez la couverture homéothermique pour maintenir une température corporelle de 37 °C.</li>
	<li>Placez la sonde de température pour la couverture homéothermique et le lubrifiant afin qu’ils soient prêts pour l’insertion.</li>
	<li>Placez le masque d’anesthésie et le système de balayage dans la zone de balayage.</li>
	<li>Anesthésier la souris à l’aide d’un vaporisateur d’isoflurane. Réglez le taux d’oxygène à 1 L/min de débit et ajustez l’isoflurane à 4% pour l’induction d’anesthésie. Allumez le flux vers la chambre d’induction de l’anesthésie, et le taux de respiration de la souris ralentira. Une anesthésie adéquate est obtenue lorsque la souris perd son réflexe de droitage.</li>
	<li>Transférer la souris dans un masque anesthésique/cône nasal avec un charognard à gaz de déchets attaché et ajuster l’isoflurane à 1,5 %. REMARQUE: Ce niveau d’anesthésie est généralement suffisant pour garder la souris couchée relativement immobile pendant le balayage, mais n’est pas destiné à fournir des niveaux chirurgicaux d’anesthésie, de sorte que la profondeur de l’anesthésie n’est pas vérifiée. Changer le niveau d’isoflurane provoque des changements dans le rythme cardiaque, la respiration et la perfusion cutanée, de sorte qu’un pourcentage constant doit être utilisé tout au long de toute expérience de cours de temps et pour tous les sujets expérimentaux. D’autres techniques anesthésiques telles que l’injection IP de kétamine xylazine peuvent également être utilisées, mais la même technique anesthésique doit être utilisée tout au long de n’importe quelle étude de cours de temps que différents anesthésiques affectent la perfusion cutanée différemment.</li>
	<li>(Facultatif selon la zone de numérisation) Si la région d’intérêt prévue à numériser est couverte de fourrure, utilisez une petite tondeuse électrique ou une crème depilatory pour enlever les cheveux de la région d’intérêt. REMARQUE : La crème depilatory doit être complètement enlevée, et la peau de souris séchée avant balayage.</li>
	<li>Placez la souris dans la position de balayage appropriée sur la surface noire non réflective qui recouvre la couverture homéothermique, confirmant que les deux limites postérieures demeurent sur la source de chaleur tout au long de l’équilibrage et de la numérisation (figure 1). REMARQUE : Il est important de maintenir les deux pieds sur la couverture homéothermique afin d’éviter les variations régionales de température.</li>
	<li>Insérez la sonde de température rectale lubrifiée associée à la couverture homéothermique.</li>
	<li>Equilibrer la température de la souris à la température de balayage désirée (37 °C); environ 5-10 minutes.</li>
	<li>Sélectionnez Configuration scanner, qui peut être consulté à partir du menu supérieur ou à partir de l’icône de configuration du scanner. Ajustez la zone d’analyse en modifiant les coordonnées X-Y pour tenir compte de la région d’intérêt. La vitesse d’analyse dépendra de la résolution de l’analyse. Une résolution plus élevée se traduira par des temps d’analyse plus longs. Pour la numérisation répétée se concentrant sur la perfusion globale, par opposition à une résolution plus élevée se concentrant sur la perfusion anatomique, une vitesse de balayage de 4 ms/pixel est adéquate. REMARQUE : Une résolution plus élevée et un scan unique devraient être envisagés si le chercheur tente d’étudier directement la circulation collatérale en développement (mieux ci-contre la cuisse ventrale et le mollet où elle est plus proche de la peau). L’analyse répétée à une résolution/vitesse inférieure (p. ex., 4 ms/pixel) est suffisante pour évaluer la perfusion globale jusqu’à l’organe final du tapis de souris. Le logiciel affiché dans la vidéo charge automatiquement le modèle précédemment utilisé pour la zone de numérisation, la vitesse et la résolution lors du redémarrage, ou il peut être récupéré à partir d’un fichier stocké si différentes régions d’intérêt sont utilisées pour diverses expériences.</li>
	<li>Si vous effectuez des analyses répétées, sélectionnez l’onglet Répéter et line scan. Le nombre d’analyses peut être modifié (dans ce cas 3 scans) ainsi que l’intervalle de répétition. Le temps minimum pour l’intervalle de répétition serait le temps de numérisation estimé, qui est indiqué dans la zone grisée à droite de la boîte déterminée par la zone d’analyse et la résolution de balayage. L’ajout de quelques secondes permet à l’utilisateur de mettre en pause et potentiellement de repositionner la souris si nécessaire entre les analyses.</li>
</ol>3. Numérisation
<ol><li>Sélectionnez l’onglet Analyse d’image et sélectionnez le bouton Marque. Le laser se déplacera pour décrire la zone de balayage. Ajustez la position de la souris de sorte que la cible à numériser se trouve dans la zone marquée. REMARQUE : Pour le footpad ou le footpad et le calf scanning, le positionnement couché avec les limites postérieures étendues fournit une région d’intérêt plus cohérente que le positionnement supiné. L’artère fémorale et l’artère et les collatéraux saphenous sont très proches de la surface ventrale de la cuisse et du veau, ainsi le positionnement de supine est préféré si utilisant ces régions d’intérêt.</li>
	<li>Commencez la mesure répétée en sélectionnant l’icône De numérisation répétée et appuyez sur le bouton Lecture pour lancer l’analyse.</li>
	<li>Confirmez la distance de numérisation dans la fenêtre contexturée et cliquez sur OK pour commencer à numériser.</li>
	<li>Surveillez la souris pendant la numérisation du mouvement de la souris; si la souris se déplace suffisamment pour que les pattes postérieures ne soient plus dans la région de balayage au milieu d’une analyse, redémarrez l’analyse. De petites variations de la position du hindpaw de souris peuvent être prises en compte dans le logiciel d’analyse.</li>
	<li>Surveillez la température de la souris pendant le processus de balayage car elle peut fluctuer même avec l’utilisation de la couverture homéothermique. S’il y a trop de variation dans la température de la souris, cela peut entraîner des variations significatives entre les scans. En général, une plage de température de 36,8-37,2 °C donnera lieu à des données acceptables.</li>
	<li>Enregistrez l’analyse capturée sous l’enregistrer comme fenêtre avec un nom de fichier qui inclut l’identificateur de souris et le point de temps pour faciliter l’analyse des données. Entrez les détails de la souris et du point de temps si désiré dans la fenêtre de détails du sujet.</li>
	<li>Éteignez l’isoflurane et retirez la sonde de température rectale.</li>
	<li>Désinfectez la sonde de température rectale avec 70% d’éthanol afin qu’elle soit prête à être utilisé chez la souris suivante.</li>
	<li>Laissez la souris se remettre de l’anesthésie au point où elle affiche un réflexe de redressage en retournant de la position supine à la position couchée avant de la retourner à la cage. REMARQUE : La récupération peut être effectuée soit sur une couverture chauffante pour l’isoflurane puisque la récupération est très rapide, soit dans une cage de récupération réchauffée pour la kétamine/xylazine.</li>
</ol>4. Capture des données LDPI (Figure 3)
<ol><li>Ouvrez le logiciel d’examen d’imagerie.</li>
	<li>Allez au menu du fichier, ouvrez et localisez le fichier enregistré.</li>
	<li>Sélectionnez l’icône ROI à partir de la barre d’outils.</li>
	<li>Sélectionnez le bouton Ajouter polygone.</li>
	<li>Tracez la région d’intérêt (ROI) pour l’arrière-point de contrôle à l’aide de la souris. Le traçage du polygone n’a pas besoin d’être exact car le fond gris ne sera pas inclus dans les moyennes calculées.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.3-4.5 pour l’arrière-train chirurgical.</li>
	<li>Choisissez l’icône Statistiques pour ouvrir la fenêtre Résultats statistiques des IA d’image (PU).</li>
	<li>Exportez les résultats pour polygone 1 (limite postérieur de commande) et Polygone 2 (limite postérieur chirurgicale) à une feuille de travail de collecte de données par copie/pâte.</li>
</ol>5. Analyse
<ol><li>Capturez les données sous forme de rapport chirurgie/contrôle pour chaque analyse.</li>
	<li>Utilisez la moyenne chirurgicale / contrôle pour les trois scans pour le point de données pour cette souris particulière à ce moment-là. En raison de la variabilité biologique dans la réponse à l’ischémie postérieur, en général 8-10 souris sont nécessaires par point de temps pour atteindre des résultats reproductibles avec ~10% d’erreur standard. REMARQUE : Avant de permettre à la souris de se remettre d’une anesthésie, il est utile d’effectuer une analyse rapide des scans répétés pour vérifier si les données sont trop variables (p. ex., plus de 100 à 150 unités de perfusion différentes d’une analyse à l’autre 1-3). Une variation élevée entre les balayages répétés suggère que la souris n’a pas été complètement equilibrée pendant l’analyse (figure 2), et un balayage répété peut être effectué sans perdre un point de données, ce qui se produirait si les images ne sont pas analysées avant une date ultérieure. Il peut être nécessaire de modifier la palette de couleurs pour optimiser la plage dynamique des valeurs de flux affichées afin de mieux afficher la variation de balayage (figure 2).</li>
</ol>

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</ol>

Le Dr Tang n’a aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Une technique cohérente est essentielle pour obtenir des résultats fiables avec LDPI. Le même anesthésique, les mêmes réglages de température, la position de la souris et la même région d’intérêt doivent être utilisés tout au long du cours du temps. Différents agents anesthésiques se traduira par des valeurs de perfusion plus ou moinsélevées 9. L’anesthésie isoflurane est pratique en raison de son apparition et de son émergence rapides ainsi que de sa sécurité globale. Un pourcentage constant d’is...

L’ulcération de peau avec la guérison inadéquate de blessure est une cause principale des amputations dans les patientshumains 1. La guérison adéquate de blessure exige des niveaux plus élevés de perfusion artérielle que sont nécessaires pour maintenir la peau intacte, qui est compromise dans les patients présentant la maladie artérielle périphérique2,3,4. Plusieurs autres affections rhumatismologiques et le diabète peuvent également conduire à une microcirculation cutanée perturbée et inadéquate pour guérir lesplaies 5,6. Beaucoup de patients diabétiques ont la maladie artérielle périphérique concomitante, les plaçant à un risque particulièrement élevé pour l’amputation. La formation image de perfusion de Doppler de laser (LDPI) est employée dans des situations cliniques pour évaluer la microcirculation de peau, aussi bien que dans des situations de recherche pour évaluer le flux sanguin et la récupération de flux sanguin après ischémie expérimentale d’arrière-mot, ischémie-reperfusion, et ailerons microchirurgical7.
Le système LDPI projette un faisceau laser de faible puissance qui est dévié par un miroir à balayage pour se déplacer sur une région d’intérêt. Cela diffère de la flowmétrie Laser Doppler, qui fournit une mesure de perfusion pour la petite zone de tissu en contact direct avec la sonde flowmetry8. Lorsque le faisceau laser interagit avec le sang en mouvement dans la microvasculature, il subit un changement de fréquence Doppler, qui est photodétecté par le scanner et converti en unités de perfusion arbitraires. Parce que LDPI est une technique basée sur la lumière, elle est limitée en termes de profondeur de pénétration à 0,3-1 mm, ce qui signifie que pour la plupart la perfusion cutanée est évaluée7. Le débit cutané peut être modifié par la température de la peau et le système nerveux sympathique, qui peut être affecté par divers agents anesthésiques9. Les mesures du laser optique sont également affectées par les conditions d’éclairage ambiant, la pigmentation de la peau, et peuvent être bloquées par la fourrure ou les cheveux7.
LDPI est la technique de recherche la plus couramment utilisée pour surveiller la récupération de perfusion après ischémie parce qu’elle n’est pas invasive, ne nécessite pas d’administration de contraste, et a des temps d’analyse rapide permettant la collecte de données sur plusieurs animaux. Il est donc idéal d’aider à déterminer si les traitements destinés à l’artériogenèse thérapeutique ou à l’angiogenèse sont efficaces dans les modèles de petits animaux. La récupération du flux sanguin après ischémie postérieure mesurée par LDPI est bien corrélée avec le développement des artères collatérales lorsqu’elle est évaluée par d’autres moyens tels que la coulée de microfil ou le micro-CT10,11. L’objectif de ce protocole est de démontrer l’évaluation de la perfusion postérieur à l’aide de LDPI.

<table><tbody><tr>Matériau <td></td><td></td><td>noir non réfléchissant</td><td>Magasin de tissu, néoprène noir recommandé par la société</td></tr><tr><td>F/air cannister</td><td>A.M. Bickford Inc</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>Couverture homéothermique avec sonde métallique rigide</td><td>Appareil Harvard Livré</td><td></td><td>également avec une sonde flexible, mais celle-ci est moins durable</td></tr><tr><td>Isoflurane Machine d’anesthésie</td><td>Dräger</td><td></td> Plusieurs <td>fabricants</td></tr><tr><td>Chambre à induction d’isoflurane</td><td>VetEquip</td><td>941444</td><td>2 L Chambre</td></tr><tr><td>Imageur de perfusion Doppler laser Moor</td><td>Moor Instruments</td><td>MoorLDI2-IR</td><td>Imageur à haute résolution (MoorLDI2-HIR)</td></tr><tr><td>Souris Anesthésie Cône</td><td></td><td></td> de nez <td>Plusieurs fabricants</td></tr><tr><td>Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réservoir</td><td></td><td></td> d’oxygène <td>Plusieurs fabricants</td></tr><tr><td>Surgilube</td><td>Plusieurs distributeurs</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

laser doppler perfusion imaging dans l’hindlimb souris

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

La récupération de flux sanguin est une mesure critique de résultats après ischémie postérieuse expérimentale ou ischémie-reperfusion. La formation image de perfusion de Doppler de laser (LDPI) est une méthode commune, non invasive, reproductible pour évaluer la récupération de flux sanguin. La technique calcule le flux sanguin global dans le tissu échantillonné à partir du changement de fréquence Doppler causé lorsqu’un laser frappe les globules rouges en mouvement. Les mesures sont exprimées en unités de perfusion arbitraires, de sorte que la non-intervention contralatérale sur la jambe est généralement utilisée pour aider à contrôler les mesures. La profondeur de mesure est de l’ampleur de 0,3 à 1 mm; pour l’ischémie postérieures, cela signifie que la perfusion cutanée est évaluée. La perfusion cutanée dépend de plusieurs facteurs, notamment la température de la peau et l’agent anesthésique, qui doivent être soigneusement contrôlés pour aboutir à des lectures fiables. En outre, la pigmentation des cheveux et de la peau peut modifier la capacité du laser à atteindre ou pénétrer dans le derme. Cet article démontre la technique de LDPI dans l’arrière-point de souris.

Le succès de l’IPV devrait donner lieu à des analyses répétées cohérentes des mesures, avec une variation de l’unité de perfusion ne pas plus de 100 à 150 (correspondant à environ 10 % de la perfusion moyenne habituelle pour le tapis de souris) entre les trois scans (figure 2). Comme l’indique la figure 2,les balayages répétés aident à déterminer que la souris a été convenablement équilibrée de sorte que le rapport ischémique/de contrôle reflète le mieux le flux...

Ici, nous présentons un protocole qui démontre la technique et les contrôles nécessaires pour l’imagerie par perfusion Laser Doppler pour mesurer le flux sanguin dans l’arrière-point de la souris.

Laser Doppler Perfusion Imaging dans l’hindlimb souris

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

L’ulcération de peau avec la guérison inadéquate de blessure est une cause principale d’amputation dans les patients humains. La guérison adéquate de blessure exige des niveaux plus élevés de profusion artérielle qui sont nécessaires pour maintenir la peau intacte, qui est compromise dans les patients présentant la maladie artérielle périphérique. Plusieurs autres affections rhumatismologiques et le diabète peuvent également conduire à une microcirculation cutanée perturbée et inadéquate pour guérir les blessures.Beaucoup de patients diabétiques ont la maladie artérielle périphérique concomitante, les plaçant à un risque particulièrement élevé pour l’amputation. Laser Doppler perfusion imagerie ou LDPI est utilisé dans des situations cliniques pour évaluer la microcirculation de la peau ainsi que dans des situations de recherche pour évaluer le flux sanguin et la récupération du flux sanguin après ischémie postérieuse expérimentale, reperfusion ischémie et volets microchirurgiques. Le système LDPI projette un faisceau laser de faible puissance qui est dévié par un miroir à balayage pour se déplacer sur une région d’intérêt.Cela diffère de la flowmétrie laser Doppler, qui fournit une mesure de perfusion pour la petite zone de tissu en contact direct avec la sonde flowmetry. Lorsque le faisceau laser interagit avec le sang en mouvement dans la microvasculature, il subit un changement de fréquence Doppler qui est photodétecté par le scanner et converti en unités de perfusion arbitraires. Étant donné que le LDPI est une technique basée sur la lumière, il est limité en termes de profondeur de pénétration à 0,3 à 1 millimètre, ce qui signifie que, pour la plupart, la perfusion cutanée est évaluée.Le débit cutané peut être modifié par la température de la peau et le système nerveux sympathique, qui peut être affecté par divers agents anesthésiques. Les mesures du laser optique sont également affectées par les conditions d’éclairage ambiant, la pigmentation de la peau et peuvent être bloquées par la fourrure ou les cheveux. LDPI est la technique de recherche la plus couramment utilisée pour surveiller la récupération de la profusion après ischémie parce qu’elle n’est pas invasive, ne nécessite pas d’administration de contraste, et a des temps d’analyse rapide permettant la collecte de données sur plusieurs animaux.Il est donc idéal d’aider à déterminer si les traitements destinés à l’artériogenèse thérapeutique ou à l’angiogenèse sont efficaces dans les modèles de petits animaux. La récupération du flux sanguin après ischémie postérieur mesurée par LDPI est bien corrélée avec le développement de l’artère collatérale lorsqu’elle est évaluée par d’autres moyens tels que la coulée de microfill ou micro CT. L’objectif de ce protocole est de démontrer l’évaluation de la perfusion postérieur à l’aide de LDPI. Réglez la hauteur du scanner de sorte que la distance au sujet de balayage est d’environ 30 centimètres.Allumez l’imageur et lancez le logiciel associé. Ouvrez le programme de mesure. Si le logiciel communique correctement avec le scanner, le laser infrarouge allume l’avertissement.Ajustez les paramètres du scanner pour qu’ils conviennent au matériau de fond et à la configuration de l’éclairage dans la pièce. Fixez le seuil d’arrière-plan en pointant le faisceau laser vers le matériau de fond noir et appuyez sur Auto BK Set. Mettre en place la chambre d’induction isoflurane avec un encavenir approprié des déchets de gaz.Placer la chambre d’induction sur un coussin chauffant aidera à prévenir la perte de température de la souris pendant l’induction de l’anesthésie. Allumez la couverture homéothermique, qui est placée dans la zone de balayage sous une surface non réfléchissante. Dans ce cas, un tissu en néoprène noir.La couverture homéothermique est réglée pour maintenir une température corporelle de 37 degrés Celsius. Placez la sonde de température et les lubrifiants afin qu’ils soient prêts pour l’insertion. Placez également le masque facial et le système de balayage de l’anesthésie dans la zone de balayage.Anesthésier la souris à l’aide d’un vaporisateur d’isoflurane. Le taux d’oxygène est fixé à un litre par minute de débit. Et l’isoflurane est ajusté à 4% pour l’induction de l’anesthésie.Le flux est activé à la chambre d’induction de l’anesthésie et le taux de respiration de la souris ralentira. Une anesthésie adéquate est obtenue lorsque la souris perd son réflexe de droitage. Transférer la souris à un cône de nez masque anesthésique avec charognard de gaz de déchets attachés et ajuster l’isoflurane à 1,5%Ce niveau d’anesthésie est généralement suffisant pour garder la souris couchée relativement immobile pendant le balayage, mais n’est pas destiné à fournir des niveaux chirurgicaux d’anesthésie.Ainsi, la profondeur de l’anesthésie n’est pas vérifiée. Changer le niveau d’isoflurane provoque des changements dans la fréquence cardiaque, la respiration et la profusion cutanée. Ainsi, un pourcentage constant doit être utilisé tout au long de toute expérience de cours de temps et pour tous les sujets expérimentaux.D’autres techniques anesthésiques, telles que l’injection IP de kétamine xylazine peuvent également être utilisées, mais la même technique anesthésique doit être utilisée tout au long de toute étude de cours de temps que différents anesthésiques affectent profusion cutanée différemment. Si la région d’intérêt du plan à numériser est couverte de fourrure, utilisez une petite tondeuse électrique et/ou une crème depilatory pour enlever les cheveux de la région d’intérêt. Les crèmes depilatory devraient être complètement enlevées et la peau de souris séchée avant de numériser car la peau humide peut causer des réflexions du laser Insérer la sonde lubrifiée de température rectale associée à la couverture homéothermique dans le rectum de souris.Equilibrer la température de la souris pour désirer la température de balayage, 37 degrés Celsius. Cela peut prendre jusqu’à cinq à dix minutes. Sélectionnez Configuration scanner accessible à partir du menu supérieur ou de l’icône Configuration scanner.La zone d’analyse doit être ajustée en modifiant les coordonnées X et Y pour tenir compte de la région d’intérêt. La vitesse d’analyse dépendra de la résolution de l’analyse. Une résolution plus élevée se traduira par des temps d’analyse plus longs.Pour la numérisation répétée, en se concentrant sur la profusion globale, par opposition à une résolution plus élevée se concentrant sur la perfusion anatomique, la vitesse de balayage la plus élevée de quatre millisecondes par pixel est suffisante. Si vous effectuez des analyses répétées, sélectionnez l’onglet Répéter et line scan. Le nombre d’analyses peut être modifié.Dans ce cas, trois scans, ainsi que l’intervalle de répétition. Le temps minimum pour l’intervalle de répétition serait les temps de numérisation estimés indiqués dans la zone grisée à droite de la boîte, déterminés par la zone d’analyse et la résolution de balayage. L’ajout de quelques secondes permet à l’utilisateur de mettre en pause et potentiellement de repositionner la souris si nécessaire entre les analyses.Le temps total d’analyse dans ce cas est de trois minutes et 21 secondes. Sélectionnez l’onglet Analyse d’image et sélectionnez le bouton Marque. Cela provoquera le laser pour décrire la zone de balayage.Ajustez la position de la souris de sorte que la cible à numériser se trouve dans la zone marquée. Commencez la mesure répétée en sélectionnant l’icône Repeat Scanning et en appuyant sur le bouton Lecture pour lancer l’analyse. Une fenêtre contexturée confirmant la distance de balayage apparaîtra.Cliquez sur OK pour commencer à numériser. Le balayage initial d’une souris avant l’induction de l’ischémie postérieur est montré en temps réel. Les deuxième et troisième balayages répétés sont accélérés à la vitesse de 16x.La fenêtre principale affiche les résultats de l’analyse tel qu’il est généré par le logiciel. L’encart en bas à droite montre le laser scannant les pavés de souris. Pour le footpad ou le footpad et le balayage dorsal de veau, le positionnement enclin avec les limites postérieures étendues vers la queue fournit une région plus cohérente d’intérêt dans le positionnement de supination.L’artère fémorale, l’artère saphenous et les garanties sont très proches de la surface ventrale de la cuisse et du veau. Ainsi, le positionnement supin est préférable si vous utilisez ces régions d’intérêt. Surveillez la souris pendant la numérisation du mouvement de la souris.Si la souris se déplace suffisamment pour que les pieds ne soient plus dans la région de balayage au milieu d’un scan, redémarrez l’analyse. De petites variations dans la position du footpad de souris peuvent être prises en compte dans les logiciels d’analyse. En outre, surveillez la température de la souris pendant le processus de balayage car elle peut fluctuer même avec l’utilisation de la couverture homéothermique.S’il y a trop de variation dans la température de la souris, cela peut entraîner des variations significatives entre les scans. En général, une plage de température de 36,8 à 37,2 donnera lieu à des données acceptables. Enregistrez l’analyse capturée sous la fenêtre Enregistrer comme avec un nom de fichier qui inclut l’identificateur de souris et le point de temps pour une analyse plus facile des données.Entrez les détails de la souris et du point de temps si désiré dans la fenêtre Détails du sujet. Le balayage ventral d’arrière-point avec la souris dans la position de supination est montré ici après ajustement de la zone de balayage. Notez que la proposition avec la sulfpine de souris entraîne une partie variable du côté du pied étant scanné.Retirez la sonde de température rectale et désinfectez-la avec 70% d’éthanol afin qu’elle soit prête pour la prochaine souris. Diminuer l’isoflurane à 0%La souris récupérera plus rapidement si elle continue à recevoir de l’oxygène, mais elle peut également être récupérée sans oxygène supplémentaire. Laissez la souris se remettre de l’anesthésie au point où elle affiche un réflexe de redressage en retournant de la position supine à la position couchée avant de la retourner à la cage.La récupération peut être effectuée soit sur une couverture chauffante pour l’isoflurane, puisque la récupération est très rapide ou dans une cage de récupération chaude pour la kétamine xylazine. Ouvrez le logiciel d’examen d’imagerie. Une nouvelle fenêtre pour examiner les analyses s’ouvrira.Allez dans le menu Fichier, Ouvrez et localisez le fichier enregistré. Sélectionnez l’icône ROI à partir de la barre d’outils. Sélectionnez l’icône Ajouter polygone.Tracez une zone autour de la région d’intérêt à l’aide de la souris. Une fois terminé, retournez à la barre d’outils et sélectionnez l’icône Statistiques. Cela permettra de mettre en place une fenêtre montrant les statistiques de la région d’intérêt.Lors de l’examen des données, les valeurs moyennes de l’unité de profusion, ou PU, ne varient pas de plus de 100 à 150 UDI par rapport aux scans répétés pour chaque footpad. Il s’agit d’un balayage acceptable et indique que la souris a été bien calibrée pendant l’analyse. Les valeurs moyennes de PU avec variation supérieure à 100 à 150 UI, ce qui correspond à plus de 10 % de la perfusion moyenne d’un tapis de souris non actionné au cours des balayages répétés, indiqueraient que la souris n’était pas bien calibrée et qu’une analyse répétée est fortement suggérée.Effectuer une analyse rapide immédiatement après la fin de l’analyse permet d’effectuer une analyse répétée pendant que la souris est encore anesthésiée et d’éviter de perdre un point de données qui pourrait se produire si les analyses sont analysées à une date ultérieure et qu’une analyse est jugée inacceptable en raison d’une variation significative entre les analyses répétées. Les résultats sont exprimés comme un rapport de profusion chirurgicale d’arrière-limite sur la perfusion postérieure de contrôle pendant que les souris d’abord vasodilate et développent alors leurs garanties intrinsèques, la récupération de flux sanguin par LDPI devrait être vue au-dessus d’un cours postopératoire de temps. Le degré de récupération dépend de la souche de la souris et de la gravité du modèle d’ischémie postérieur.Ce chiffre montre une expérience de cours de temps terminée sur 28 jours où LDPI a été utilisé pour mesurer la récupération du flux sanguin footpad au fil du temps après ligature artérielle fémorale et P27 KO et sauvage type C57Bl/6 souris. Les deux KO P27 chez les souris de type sauvage avaient altéré la récupération du flux sanguin lorsqu’elles étaient traitées avec de la doxycycline orale, un inhibiteur généralisé des métalloprotéines de matrice, suggérant que l’activité de MMP facilite l’artériogenèse. La configuration du gain et le seuil d’arrière-plan doivent être maintenus constants pendant toute l’expérience de cours de temps.Si le seuil d’arrière-plan est fixé trop bas, la numérisation du matériau d’arrière-plan se traduira par de faibles valeurs de profusion. Il en résultera que les valeurs de profusion de fond seront moyennes dans la région d’intérêt pendant la sélection des polygones. Pour éliminer ce problème, le seuil d’arrière-plan peut être ajusté dans la fenêtre configuration du scanner sous l’onglet Général.Dans ce cas, l’augmentation du seuil de fond à 118 unités de profusion entraîne l’arrière-plan gris qui ne sera inclus dans aucune analyse. La palette ou l’échelle de couleur de l’image de flux peut être ajustée à la fois dans le logiciel de mesure et le logiciel d’examen d’image. Toutes les valeurs de profusion supérieures à la valeur maximale sur l’échelle seront affichées comme la couleur de profusion la plus élevée.Dans ce cas, rouge. L’augmentation de la plage dynamique, par exemple, en changeant l’échelle pour varier de zéro à 1500, rendra la variation de balayage répétée plus évidente à l’œil que les zones mesurant entre 1000 à 1500 unités de profusion seront maintenant affichés en utilisant le gradient de couleur plutôt que tous étant montrés comme rouge. L’analyse montrée ici a été obtenue chez une souris dont la température corporelle centrale était initialement inférieure à 36,8 au début de l’analyse répétée, puis a augmenté au cours des balayages répétés.Notez que la profusion moyenne du footpad de contrôle a été plus effectée par la température corporelle centrale plus froide que le footpad ischémique. Un seul balayage de la température corporelle plus fraîche aurait eu comme conséquence un rapport plus élevé de profusion étant enregistré pour ce point de données. La variation de la pigmentation de la peau de souris, comme on peut le voir chez les souris C57Bl/6, peut rendre difficile l’analyse de la zone de balayage inférieure à la valeur du seuil de fond, ce qui rendra difficile l’analyse des régions d’intérêt contenant des zones pigmentées.Les pavés de souris en général n’ont pas d’hyperpigmentation, ce qui en fait la zone la plus pratique pour scanner cette souche de souris. Si le chercheur souhaite étudier l’embryon ventral, une souche de souris blanche doit être sélectionnée. LDPI est une méthode efficace, facilement exécutée, et reproductible pour mesurer la profusion cutanée d’hindlimb comme reflet de la perfusion artérielle globale.Une technique cohérente est nécessaire lors de l’utilisation de LDPI pour obtenir des données fiables.

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JoVE Journal

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Médecine

La procédure chirurgicale pour l'induction d'une ischémie unilatérale des membres postérieurs est démontré, avec confirmation d'ischémie par imagerie laser Doppler perfusion.

Modèle murin d&#39;ischémie des membres postérieurs

Nous décrivons la méthode des cellules souches de programmation pour surexprimer des facteurs thérapeutiques pour l'angiogenèse en utilisant des nanoparticules polymériques biodégradables. Les procédés décrits comprennent la synthèse du polymère, la transfection de cellules souches du tissu adipeux in vitro, et de valider l'efficacité des cellules souches programmées pour favoriser l'angiogenèse dans un modèle d'ischémie des membres postérieurs de souris.

Les cellules souches de programmation pour angiogenèse thérapeutique utilisant polymère biodégradable nanoparticules

L’induction chirurgicale de l’ischémie des membres postérieurs chez la souris est utile pour examiner l’angiogenèse, mais celle-ci est compromise chez certaines souches de souris consanguines qui présentent une nécrose tissulaire marquée induite par l’ischémie. Des méthodes sont décrites pour induire une ischémie subaiguë des membres à l’aide de constricteurs améroïdes pour contourner ce problème par l’induction d’une occlusion artérielle progressive.

Méthodes de aiguë et subaiguë murin Ischémie membres postérieurs

Vasodilatation induite par l’insuline régule la perfusion musculaire et augmente la microvasculaire surface habitable (recrutement microvasculaire) disponible pour échange soluté entre interstitium de sang et de tissus. La microscopie intravitale combinée et échographie de contraste accentué est présenté Evaluer simultanément l’action de l’insuline à des gros vaisseaux et la microcirculation in vivo.

Combiné la microscopie intravitale et échographie de contraste accentué des membres postérieurs souris pour étudier la vasodilatation induite par l’insuline et la Perfusion du Muscle

Îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire régule la distribution de sang îlot et maintient la fonction physiologique des cellules β des îlots. Ce protocole décrit en utilisant un moniteur Doppler laser pour déterminer l’état fonctionnel des îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire in vivo et d’évaluer les contributions de la microcirculation des îlots pancréatiques de maladies liées au pancréas.

Laser Doppler : Un outil pour mesurer les îlots pancréatiques vasomotricité microvasculaire In Vivo

Ici nous présentons une combinaison de laser Doppler l’imagerie de perfusion (LDPI) et laser Doppler perfusion surveillance (LDPM) pour mesurer la colonne vertébrale du cordon débits sanguins locaux et la saturation en oxygène (SO2), ainsi qu’une procédure normalisée pour l’introduction de la moelle épinière traumatisme chez le rat.

À l’aide de Laser Doppler d’imagerie et de surveillance pour analyser la Microcirculation de la moelle épinière chez le Rat

Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.

Imagerie intravitale multiphotonique pour la surveillance du recrutement leucocytaire au cours de l’artériogenèse dans un modèle murin de membre postérieur

Le présent protocole décrit un modèle unique et cliniquement pertinent de maladie artérielle périphérique qui combine l’électrocoagulation de l’artère fémorale et des veines avec l’administration d’un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase pour induire la gangrène des membres postérieurs chez les souris FVB. La perfusion intracardiaque DiI est ensuite utilisée pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution du système vasculaire du coussinet plantaire.

Imagerie tridimensionnelle haute résolution de la vascularisation du repose-pieds dans un modèle murin de gangrène postérieure

L’échographie Doppler ultrarapide (UFUS) avec une résolution spatiale (100 μm) et une sensibilité élevées représente une modalité d’imagerie non invasive appropriée pour obtenir une vue qualitative complète du système vasculaire hépatique. L’UFUS facilite également les mesures quantitatives de la microvascularisation, dans le but d’améliorer notre compréhension des mécanismes des maladies vasculaires.

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Une intervention chirurgicale mini-invasive est présentée ici, qui consiste à placer la sonde laser Doppler sur le crâne au-dessus de la région distale de l’artère cérébrale moyenne (ACM), une position périorbitaire adaptée aux rats et aux souris, afin d’évaluer le flux sanguin lors de l’occlusion transitoire de l’ACM.

Placement périorbitaire d’une sonde laser Doppler pour la surveillance du débit sanguin cérébral avant l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne chez des modèles de rongeurs

Un système d’imagerie laser à contraste de tapets a été utilisé pour surveiller les changements du flux sanguin microvasculaire rénal lors de l’ischémie rénale unilatérale après la résection du rein droit chez la souris.

Perfusion microvasculaire surveillée par imagerie laser à contraste de speckles lors d’une lésion ischémie-rénale de réperfusion chez la souris

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Laser Doppler Perfusion Imaging dans l’hindlimb souris

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