Fabrication de plates-formes magnétiques pour l’organisation à l’échelle du micron de neurones interconnectés

Notre approche permet de contrôler la formation de réseaux neuronaux à l’aide de manipulations magnétiques. Il s’agit d’un outil efficace pour les études in vitro de réseaux et offre une nouvelle orientation thérapeutique pour les dispositifs de biointerfaisçage. Avec cette technique, nous pouvons contrôler à la fois l’emplacement et la croissance de la cellule à l’échelle du micron, permettant une conception flexible du motif magnétique et donc de l’organisation du réseau.

Une nanoparticule magnétique stériloptique efficace et non toxique est cruciale. Pour réussir, des nanoparticules magnétiques appropriées sont nécessaires. Les caractéristiques importantes sont la taille, le revêtement et la valeur d’aimantation de la situation.

Reut Plen et Dafna Levenberg, étudiants en master pour mon laboratoire, feront la démonstration des procédures. Pour commencer, coupez les lames de verre en morceaux de deux par deux centimètres à l’aide d’un stylo scriber. Nettoyez les lames de verre à l’acétone puis à l’isopropanol pendant cinq minutes chacune dans un bain à ultrasons.

Ensuite, séchez-les avec de l’azote ultra haute pureté. Enrobez le verre de photorésine à l’aide d’un revêtement de spin à 6 000 tr / min pendant 60 secondes pour atteindre une épaisseur de 1,5 micromètre et faites cuire 100 degrés Celsius pendant 60 secondes. Exposez l’échantillon à une source lumineuse à l’aide d’un photomasque ou d’une lithographie sans masque pour obtenir le motif souhaité.

Prélever l’échantillon pendant 40 secondes dans un révélateur dilué dans de l’eau distillée conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, lavez-le à l’eau pendant 45 secondes et séchez-le avec de l’azote gazeux UHP. Inspectez le motif sous un microscope optique.

Insérez l’échantillon dans la chambre de verrouillage de la charge du système de dépôt et attendez la pression de base. Transférer l’échantillon dans la chambre principale et le fixer à la hauteur appropriée pour le dépôt. Augmentez la puissance sur chaque cible jusqu’à ce que le taux souhaité soit atteint.

Activez la rotation, puis déposez la multicouche ferromagnétique, en alternant entre les cibles de cobalt, de fer et de palladium en ouvrant et en fermant respectivement les volets cibles. Déposez 14 couches de fer de cobalt palladium et terminez par une couche de capsulage de palladium supplémentaire. Une fois le dépôt terminé, déchargez l’échantillon du système de dépôt.

Faire tremper l’échantillon dans de l’acétone pendant 30 minutes et le rincer à l’isopropanol. Ensuite, séchez-le avec de l’azote UHP et examinez-le au microscope. Conservez-le dans un environnement propre et sec jusqu’à son utilisation.

Utilisez une lame de verre avec une barre magnétique en forme de croix de 100 micromètres de largeur déposée avec des multicouches ferromagnétiques. Fixer l’échantillon au support à l’aide de ruban adhésif double face. Utilisez un liant de fil pour lier quatre fils à l’échantillon, un sur chaque jambe de l’électrode transversale.

Régler le porte-échantillon et l’échantillon à l’intérieur du système de mesure du transport avec un champ magnétique de sorte que le champ magnétique soit perpendiculaire à l’échantillon. Effectuer des mesures de tension transversales comme décrit dans le manuscrit de texte. Balayez le champ magnétique et mesurez la tension transversale en fonction du champ.

Tracer la résistance transversale en fonction du champ magnétique pour déterminer le signal Hall anormal, qui est proportionnel à l’aimantation perpendiculaire dans le film. Préparer le milieu de croissance de base et le milieu de différenciation pour la culture cellulaire PC12 comme décrit dans le manuscrit de texte. Cultiver les cellules dans une fiole de culture non traitée avec 10 millilitres de milieu de croissance basique, en ajoutant 10 millilitres de milieu à la fiole tous les deux à trois jours.

Sous-culture des cellules après huit jours. Pour l’absorption cellulaire, centrifuger la suspension cellulaire pendant huit minutes à 200 G et à température ambiante, puis jeter le surnageant. Ressusciter les cellules dans trois millilitres de milieu de croissance de base frais.

Centrifuger à nouveau les cellules pendant cinq minutes, puis jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans trois millilitres de milieu de différenciation frais. Aspirez les cellules 10 fois à l’aide d’une seringue et d’une aiguille pour briser les amas cellulaires, puis comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et semez un million de cellules dans un plat régulier de 35 millimètres non enrobé. Ajouter le volume calculé de suspension MNP et de milieu de différenciation à la boîte pour atteindre la concentration de MNP souhaitée.

Mélangez les cellules, les MLP et le milieu de différenciation, puis incuber le plat dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Nettoyez le substrat à motifs avec de l’éthanol à 70% et placez-le dans un plat de culture de 35 millimètres dans le capot. Placez un grand aimant sous le substrat à motifs pendant une minute, puis retirez-le en déplaçant la parabole de haut en bas et en sortant l’aimant de la hotte.

Allumez la lumière ultraviolette pendant 15 minutes. Pour préparer un substrat en verre enduit de collagène, diluez le collagène de type un à un rapport d’un à 50 dans de l’éthanol à 30%. Couvrez le verre avec la solution.

Laissez le plat à découvert dans la hotte pendant quatre heures jusqu’à ce que toute la solution s’évapore, puis lavez-le trois fois dans du PBS stérile. Retirez les cellules de l’incubateur, centrifugez la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 200 G et jetez le surnageant. Ressusciter les cellules dans un millilitre de milieu de différenciation frais et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Ensemencez 10 sur les cinq cellules au sommet du substrat dans une boîte de culture de 35 millimètres et ajoutez deux millilitres de milieu de différenciation. Incuber la culture dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Après 24 heures, ajoutez un à 100 bêta-NGF murin frais aux cellules.

Renouvelez le milieu de différenciation et ajoutez du bêta-NGF frais tous les deux jours. Imager les cellules tous les deux jours à l’aide de la photomicroscopie et effectuer une immunomarquage sur les cellules après la formation du réseau. Des plates-formes magnétiques avec différentes formes géométriques ont été fabriquées et des MNF d’oxyde de fer fluorescent ont été synthétisés par nucléation.

Les mesures magnétométriques des MLP montrent que la courbe d’aimantation n’avait pas d’hystérésis, un faible champ de saturation et une saturation d’aimantation relativement élevée. Des cellules PC12 ont été incubées dans le milieu mélangé avec les MNF fluorescents d’oxyde de fer, les transformant en unités magnétiques. Les M. M. C.R. ont été internalisés dans le soma des cellules, mais pas aux noyaux.

La concentration de fer à l’intérieur des cellules a augmenté avec l’augmentation de la concentration de MNP dans le milieu. La viabilité des cellules PC12 chargées par MNP pour différentes concentrations de MNP a été évaluée en comparant les paramètres morphologiques des cellules chargées de MNP à l’aide de l’analyse de Shoal, ne montrant aucune différence par rapport aux cellules témoins. Les essais basés sur XTT et Resazurin ont confirmé que les concentrations évaluées de MNF n’ont montré aucune cytotoxicité significative envers les cellules.

Des cellules PC12 avec et sans traitement de MNP ont été développées et différenciées sur un substrat magnétique. Les cellules magnétisées se sont avérées pour se fixer aux modèles magnétiques et pour faire pousser des branches selon les modèles, alors que les cellules sans traitement de MNP se développaient sans affinité avec les dispositifs magnétiques. Le positionnement des cellules sur un substrat à géométrie hexagonale est illustré ici.

75% des corps de cellules chargés de MNP étaient en contact avec les bandes magnétiques, tandis que seulement 35% des cellules non magnétisées étaient situées sur les rayures. En plus de l’effet de positionnement cellulaire, ces plates-formes magnétiques ont été trouvées pour contrôler la directionnalité des neurites en croissance. Pour évaluer l’effet magnétique sur la directionnalité de la croissance neuronale, l’angle entre les neurites et les bandes magnétiques a été mesuré, montrant une corrélation significative avec l’orientation des bandes magnétiques.

Cette procédure est facilement adaptée pour diriger des composés actifs, comme des médicaments, après les avoir conjugués à des nanoparticules magnétiques. Le peut être traduit en essais de dépistage de médicaments à haut débit ou en traitement local dans les tissus. Cette nouvelle approche ouvre de nouvelles possibilités de fonctionnalisation d’autres substrats ou dispositifs en ajoutant des structures magnétiques attrayantes.

Actuellement, nous développons des interfaces de puces neuronales biocompatibles améliorées.