Name: Étiquetage et visualisation des produits d and apos;expression du génome mitochondrial dans Baker and apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Découvrez le marquage radioactif et l'électrophorèse sur gel pour visualiser les huit polypeptides mitochondriaux de la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet d'étudier la biosynthèse protéique mitochondriale.

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Cette recherche a été financée par la Fondation russe pour la recherche fondamentale, subvention numéro 18-29-07002. P.K. a été soutenu par l'Affectation d'État du Ministère des sciences et de l'enseignement supérieur de la Fédération de Russie, numéro de subvention AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. a été soutenu par le Ministère des sciences et de l'enseignement supérieur de la Fédération de Russie, subvention numéro 075-15-2019-1659 (Programme de Kurchatov Center of Genome Research). Les travaux ont été réalisés en partie sur l'équipement acheté dans le cadre du Programme de développement de l'Université d'État de Moscou. I.C., S.L., et M.V.B. ont été en outre soutenus par la subvention de l'Université d'État de Moscou « Leading Scientific School Noah's Ark ».

1. Préparation de culture de levure
<ol><li>Streak levure des cultures de bouillon congelés sur des assiettes fraîches avec le milieu approprié. Mettez les assiettes dans un incubateur de culture à 30 °C pendant 24-48 h. REMARQUE : Laissez pousser les mutants sensibles à la température à la température permissive.</li>
	<li>Inoculer les cultures de levure dans 2 mL de milieu YPGal (2% de peptone, 1% d'extrait de levure, 2% de galactose) de la strie fraîche dans des tubes de 15 mL et les incuber toute la nuit agitant à 200 rpm à 30 °C.</li>
	<li>Mesurer la densité optique de la culture à une longueur d'onde de 600 nm (OD600).</li>
	<li>Prenez le volume correspondant à 0,2 unités d'absorption dans les tubes stériles, les cellules de levure de granulés à 9.000 x g pendant 30 s à température ambiante, et jetez le supernatant.</li>
	<li>Laver les cellules avec 0,5 mL d'eau stérile en tourbillonnant pendant 5 s. Pelleter les cellules de levure à 9000 x g pendant 30 s à température ambiante et jeter le supernatant. Diluer les cellules dans 2 mL de milieu YPGal frais.</li>
	<li>Incuber l'agitation à 200 rpm et 30 °C jusqu'à ce que l'OD600 atteigne 1,5 à 1,9 valeur. REMARQUE: Les taux de croissance de levure varient, alors soyez prêt à attendre. Il est raisonnable de faire des pas 1.3-1.6 tôt le matin. Il faut généralement 4-5 h, mais peut prendre plus de temps.</li>
</ol>2. Incorporation d'isotopes radioactifs
<ol><li>Transférer le volume de culture équivalent à une unité optique dans un tube de microcentrifugeuse. Faire tourner les tubes à 3 000 x g pendant 1 min et jeter le supernatant. Laver avec 0,5 mL d'eau stérile en tourbillonnant pendant 5 s.<ol>
<li>Pelleter les cellules de levure à 9000 x g pendant 30 s à température ambiante et jeter le supernatant. Resuspendez les cellules de levure dans 0,5 mL de tampon de traduction stérile. Placer la suspension dans un tube de 15 mL. REMARQUE : Le tampon de traduction est une solution contenant 2 % de galactose (w/v) et 50 mM de phosphate de potassium avec pH 6,0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter le cycloheximide à la suspension cellulaire jusqu'à une concentration finale de 0,2 mg/mL. Incuber pendant 5 min agitant à 200 rpm et 30 °C pour inhiber la traduction cytosolique. REMARQUE : La solution cycloheximide (20 mg/mL, en éthanol) doit être préparée fraîchement avant l'expérience. Le chloramphénicol peut être remplacé avec succès par de l'anisomycine dans la même concentration7.</li>
	<li>Ajouter 25-30 μCi de 35S-méthionine à la suspension cellulaire et incuber pendant 30 min agitant à 200 tours et 30 °C. REMARQUE : Le mélange de 35S-méthionine et de 35S-cystéine peut également être utilisé. Pure 35S-methionine se traduit par le signal le plus fort et le meilleur rapport signal-bruit. Généralement, la méthionine est plus efficace que la cystéine parce que la teneur de cet acide aminé dans les protéines mitochondriques est plus élevée. Cependant, le mélange EasyTag de 35S-méthionine et cystéine est moins cher et donne des résultats comparables7. ATTENTION: 35S-méthionine est radioactif. Suivez les pratiques de sécurité habituelles pour la manipulation des matières radioactives. REMARQUE : Il est bien connu que l'incorporation de la radioactivité atteint une limite en raison de laquelle le total des signaux se nivelle au fil du temps. Une fois cette limite atteinte, il est presque impossible de déterminer les taux de synthèse des différents produits de traduction. Pour analyser le taux de traduction mitochondrique, il est impératif d'être dans un état dans lequel l'intensité du signal augmente avec le temps d'incubation avec 35S-méthionine d'une manière linéaire. Pour les souches courantes de type sauvage de laboratoire, le signal est déjà saturé pour des temps d'incubation beaucoup plus courts que les 30 min. Les mutants translationnels peuvent se comporter très différemment. Un cours du temps devrait être effectué pour établir la cinétique de l'incorporation de radioactivité et donc le taux de traduction, au moins lorsque vous travaillez avec une nouvelle souche. Pour cela, nous suggérons de prélever des échantillons avec un intervalle de plusieurs minutes (p. ex., 2,5, 5,0, 7,5, 10 et 20 min).</li>
	<li>Ajouter la méthionine « froide » non étiquetée (la concentration finale devrait être de 20 mM) et la puromycine (la concentration finale devrait être de 1 à 10 μg/mL) pour arrêter l'étiquetage. Incuber pendant 10 min agitant à 200 rpm et 30 °C. REMARQUE : Cette étape est essentielle pour donner aux ribosomes le temps de finir de traduire les peptides. Dans le cas contraire, tous les polypeptides plus courts que la pleine longueur seront détectés à une taille différente. Une expérience de cours du temps (pulse-chase) peut être faite à cette étape pour déterminer la stabilité des produits de traduction mitochondrial. Pour cela, poursuivre l'incubation en prélevant des échantillons avec un intervalle de 30 min (p. ex., 30, 60, 90 et 120 min).</li>
</ol>3. Lyse de cellules de levure et extraction des protéines
<ol><li>Recueillir les cellules de levure par centrifugation à 9 000 x g pendant 30 s. Laver les cellules avec 0,5 mL d'eau stérile en tourbillonnant pendant 5 s. Cellules de levure de granulés à 9.000 x g pour 30 s à température ambiante. Jeter le surnatant. note. Le protocole peut être mis en pause ici. Conserver les échantillons à -20 °C.</li>
	<li>Ajouter 75 μL de tampon de lyse à la pastille et au vortex pendant 5 à 10 s. REMARQUE : Le tampon de lyse est une solution de 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoéthanol et 1 MM PMSF dans l'eau. Évitez l'incubation excessive avec tampon de lyse menant à l'hydrolyse alcaline des protéines. Passez immédiatement à l'étape 3.3.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de tampon Tris-HCl de 0,5 M avec pH 6,8. Vortex brièvement.</li>
</ol>4. Précipitation de protéines
ATTENTION : Le méthanol et le chloroforme sont des solvants organiques. Suivez les pratiques de sécurité habituelles pour la manipulation des substances organiques.
<ol><li>Ajouter 600 μL de méthanol à l'échantillon. Vortex pour 5 s.</li>
	<li>Ajouter 150 μL de chloroforme à l'échantillon. Vortex pour 5 s.</li>
	<li>Centrifugeuse les échantillons pendant 2 min à 12.000 x g. Jetez soigneusement la phase supérieure à l'avec un échantillonneur.</li>
	<li>Ajouter 600 μL de méthanol à l'échantillon. Mélanger soigneusement en inversant le tube plusieurs fois.</li>
	<li>Centrifugeuse les échantillons pendant 2 min à 12.000 x g. Jeter le surnatant.</li>
	<li>Sécher à l'air le granulé pendant 2 min à 80 °C. REMARQUE : Tout le liquide doit s'évaporer. Il y a un risque d'avoir une séparation aberrante des protéines dans le gel si la pastille a été séchée insuffisamment. Cependant, il n'est pas possible de trop sécher la pastille, de sorte qu'elle peut même être stockée pendant la nuit à 4 °C.</li>
	<li>Dissoudre les protéines précipitées dans 60 μL de tampon échantillon 1x Laemmli.</li>
	<li>Chauffer pendant 10 min à 40 °C. REMARQUE : Évitez de faire bouillir les échantillons à 95 °C, car cela provoque une agrégation. Si les agrégats se forment encore, faites tourner les échantillons à 12 000 x g pendant 2 min et recueillez le supernatant. Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C. Le protocole peut être mis en pause ici.</li>
</ol>5. SDS-PAGE
<ol><li>Jetez le gel Laemmli SDS-polyacrylamide 17,5%. NOTE: 6 M d'urée peuvent être ajoutés au gel pour résoudre mieux atp8 et atp9. Gradient 15%-20% gels peuvent également donner une meilleure résolution.</li>
	<li>Chargez 15 μL (40-50 μg) de chaque échantillon dans les poches. REMARQUE : Il n'est pas nécessaire de mesurer la concentration en protéines si les valeurs del'OD 600 étaient proches à l'étape 1.6. Si ce n'est pas le cas, mesurez les concentrations de protéines à l'aide de l'analyse avec des réacompteurs compatibles avec le détergent.</li>
	<li>Faire fonctionner le gel dans une pièce froide jusqu'à ce que le colorant bleu atteigne environ 65% de la longueur du gel. REMARQUE : Pour le système utilisé (p. ex., protéien II xi cell), nous utilisons l'un ou l'autre des deux modes : 16-17 h à 5 V/cm ou 5 h à 15 V/cm. Aucune protéine ne court plus vite que le colorant bleu bromophénol, mais de longues courses peuvent entraîner un brouillage des signaux atp8 et atp9.</li>
	<li>Tacher le gel avec coomassie bleu brillant et faire un scan ou une photo, qui est nécessaire comme un contrôle de chargement. REMARQUE : Une autre façon de faire un contrôle de chargement est l'immunoblotting avec un anticorps au gène mitochondrique de « ménage », par exemple, porine 1.</li>
</ol>6. Autoradiographie
<ol><li>Sécher le gel dans un séchoir à gel. Gardez-le dans la cassette avec un écran de phosphore de stockage pendant 3-5 jours. REMARQUE : Une alternative au criblage du gel séché est le transfert de protéines à une membrane de nitrocellulose par électroblotting et criblage par la suite. Il en résulte des signaux plus forts et des bandes plus nettes.</li>
	<li>Scannez l'écran sur un phosphorimager. REMARQUE : Comme alternative à l'imagerie au phosphore, le film à rayons X peut également être utilisé pour révéler les signaux.</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li>
<li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li>
<li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li>
<li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li>
<li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li>
<li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim-less+translation%3A+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3%2FAim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749(2016).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li>
<li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li>
<li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li>
<li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876(2012).</li>
<li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ribosome+%28mitoribosome%29+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li>
<li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Les études de l'expression des gènes occupent une place centrale dans les sciences de la vie modernes. De nombreuses méthodes donnant un aperçu de ce processus complexe ont été développées. Ici, nous avons décrit la méthode permettant d'accéder à la biosynthèse protéique dans la levure de boulanger S. cerevisiae mitochondries. Il est généralement appliqué pour comparer l'efficacité de traduction des ARNH dans les mitochondries de souche de levure mutante par rapport au type sauvage pour accéder aux conséquences ...

Les mitochondries sont les organites profondément impliqués dans le métabolisme d'une cellule eucaryotique. Leur chaîne de transfert d'électrons fournit à la cellule de l'ATP, la principale monnaie énergétique utilisée dans de multiples voies biochimiques. En outre, ils sont impliqués dans l'apoptose, l'acide gras et la synthèse de l'hème, et d'autres processus. Le dysfonctionnement des mitochondries est une source bien connue de maladie humaine1. Il peut résulter de mutations dans des gènes nucléaires ou mitochondriques codant des composants structurels ou réglementaires des organites2. La levure saccharomyces cerevisiae de Baker est un excellent organisme modèle pour étudier l'expression des gènes mitochondriaux pour plusieurs raisons. Tout d'abord, leur génome estcomplètement séquencé 3, bien annoté, et une grande somme de données est déjà disponible dans la littérature grâce à la longue histoire des enquêtes menées avec cet organisme. Deuxièmement, les manipulations avec leur génome nucléaire sont relativement rapides et faciles en raison de leur taux de croissance rapide et de leur système de recombinaison homologue très efficace. Troisièmement, la levure de boulanger S. cerevisiae est l'un des rares organismes pour lesquels les manipulations avec des génomes mitochondriaux sont développées. Enfin, la levure de boulanger est un organisme de faculté d'aérobe-anaérobie, qui permet l'isolement et l'étude des mutants respiratoires défectueux, car ils peuvent se développer dans des médias contenant des sources de carbone fermentescibles.
Nous décrivons la méthode pour étudier l'expression mitochondrique de gène de la levure de boulanger S. cerevisiae au niveau translationnel4. Son principe principal provient de plusieurs observations. Tout d'abord, le génome mitochondrial de levure ne code que huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l'enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p5. Ce nombre est faible, et tous peuvent être séparés par électrophoresis sur un seul gel dans les conditions appropriées. Deuxièmement, les ribosomes mitochondriques appartiennent à la classe procaryotique plutôt qu'à l'eucaryotique6, et donc, la sensibilité aux antibiotiques est différente pour les ribosomes cytoplasmiques et mitochondriques de levure. Il permet l'inhibition de la traduction cytoplasmique avec le cycloheximide, fournissant les conditions où l'acide aminé étiqueté(35S-méthionine) est incorporé seulement dans les produits de traduction mitochondrial. En conséquence, l'expérience donne des informations sur le taux d'incorporation d'acides aminés dans les protéines mitochondriales synthétisées de novo, reflétant l'efficacité globale de la traduction mitochondriale pour chacun des huit produits

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Gélose bactériologique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Densimètre à cellules Biowave CO8000</td><td>BIOCHROM US BE</td><td>80-3000-45</td><td></td></tr><tr><td>MARQUE cuvettes jetables standard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z330361</td><td></td></tr><tr><td>chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>chauffe-moteur numérique</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>EasyTag L-[35S]-Méthionine, 500&micro ; Ci (18.5MBq), Solution aqueuse stabilisée</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG709A500UC</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf 5425</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-864-457</td><td></td></tr><tr><td>GE Filtres au phosphore de stockage</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE29-0171-33</td><td></td></tr><tr><td>L-méthionine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime ;,N&prime ;-Tétraméthyléthylènediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime ;-Méthylènebisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td></td></tr><tr><td>Nouveau-Brunswick Innova 44/44R Agitateur</td><td>Incubateur Nouveau-Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptone de viande, bactériologique</td><td>Millipore</td><td>91249&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthanesulfonyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626²626² ;</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660nm Kit de dosage des protéines</td><td>Thermo Scientific</td><td>22662</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation de base PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651802</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de puromycine de Streptomyces alboniger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Storm 865 imageur phosphore</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Séchoir à gel chauffé sous vide</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-GDVH</td><td></td></tr><tr><td>Extrait</td><td>de levure Sigma-Aldrich</td><td>Y1625&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

Étiquetage et visualisation des produits d&apos;expression du génome mitochondrial dans baker&apos;s yeast saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes capables de respirer aérobie. Ils contiennent un génome circulaire et un appareil d'expression génique. Un génome mitochondrial de levure de boulanger code huit protéines : trois sous-unités de la cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, et Cox3p), trois sous-units de la synthase ATP (Atp6p, Atp8p, et Atp9p), une sous-unité de l'enzyme ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase, cytochrome b (Cytb), et la protéine ribosomique mitochondriale Var1p. Le but de la méthode décrite ici est d'étiqueter spécifiquement ces protéines avec de la méthionine 35S, de les séparer par électrophoresis et de visualiser les signaux comme des bandes discrètes à l'écran. La procédure comporte plusieurs étapes. Tout d'abord, les cellules de levure sont cultivés dans un milieu contenant de la galactose jusqu'à ce qu'elles atteignent le stade de croissance logarithmique tardive. Ensuite, le traitement cycloheximide bloque la traduction cytoplasmique et ne permet l'incorporation de 35S de méthionine que dans les produits de traduction mitochondrique. Ensuite, toutes les protéines sont extraites des cellules de levure et séparées par électrophoresis gel polyacrylamide. Enfin, le gel est séché et incubé avec l'écran de phosphore de stockage. L'écran est scanné sur un phosphorimager révélant les bandes. La méthode peut être appliquée pour comparer le taux de biosynthèse d'un seul polypeptide dans les mitochondries d'une souche de levure mutante par rapport au type sauvage, ce qui est utile pour étudier les défauts d'expression des gènes mitochondriaux. Ce protocole donne des informations précieuses sur le taux de traduction de tous les ARNm mitochondriaux de levure. Toutefois, il faut plusieurs contrôles et des expériences supplémentaires pour tirer des conclusions appropriées.

Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons attribué des produits de traduction mitochondrique à partir de deux souches de S. cerevisiae : le type sauvage (WT) et une suppression mutante du gène AIM23 (AIM23Δ), codant le facteur d'initiation à la traduction mitochondrique 3 (tableau 1)8. Les produits de traduction mitochondrial ont été étiquetés et séparés radioactivement dans SDS-PAAG9. Les échantillons ont été prélevés toutes les 2,5 min...

Le génome mitochondrial de levure de Baker code huit polypeptides. Le but du protocole actuel est de les étiqueter tous et de les visualiser par la suite comme des bandes distinctes.

Étiquetage et visualisation des produits d&apos;expression du génome mitochondrial dans Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes capables de respirer aérobie. Leur dysfonctionnement est une source bien connue de maladie humaine. Les mitochondries de levure de Baker contiennent un génome circulaire codant huit protéines.Dans cette vidéo, nous avons décrit le protocole utilisé pour l’analyse de la biosynthèse protéique dans les mitochondries de levure au moyen de l’étiquetage radioactif des produits translationnels et de la séparation subséquente par électrophoresis gel. La procédure comprend plusieurs étapes majeures. Streak levure de cultures de bouillon congelés sur des assiettes fraîches avec un milieu approprié.Mettez les assiettes dans l’incubateur de culture à 30 degrés pendant 24 à 48 heures. Inoculer ces cultures en deux millilitres de milieu de la strie fraîche dans un tube de 15 millilitres et les incuber pendant la nuit agitant à 200 RPM à 30 degrés. Mesurer la densité optique de la culture à la longueur d’onde de 600 nanomètres.Prenez le volume correspondant à 0,2 unités d’absorption dans les cellules de levure palette tubes stériles à 9000 G pendant 30 secondes à température ambiante. Jetez ce supernatant. Lavez les cellules avec 0,5 millilitres d’eau stérile en tourbillonnant pendant cinq secondes.Paletter les cellules de levure à 9000 G pendant 30 secondes à température ambiante. Jeter le surnatant. Diluer les cellules en deux millilitres de linge frais moyen d’agar.Bord d’incubation pris à 200 RPM et 30 degrés jusqu’à ce que la densité optique atteigne de 1,5 à 1,9 de 1,5 à 1,9 valeurs. Transférer le volume de culture équivalent à une unité optique dans un tube de micro centrifugeuse. Faire tourner les tubes à 3000 G pendant une minute.Jeter le surnatant. Lavez les cellules avec 0,5 millilitres d’eau stérile en tourbillonnant pendant cinq secondes. Paletter les cellules de levure à 9000 G pendant 30 secondes à température ambiante Jeter le supernatant.Suspendre à nouveau les cellules de levure dans 0,5 millilitres de tampon de traduction stérile. Placer la suspension dans un tube de 15 millilitres. Ajouter le cycloheximide à la suspension cellulaire jusqu’à une concentration finale de 0,2 milligramme par millilitre d’incubation pendant cinq minutes de bord pris à 200 RPM et 30 degrés pour inhiber la traduction cytosolique.Ajouter de 25 à 30 Ajouter de 25 à 30 microcourards de méthionine S35 de la méthionine S35 à la suspension cellulaire et incuber pendant 30 minutes bord pris à 200 RPM et 30 degrés. Ajouter la méthionine froide non étiquetée et la borymycine pour arrêter l’étiquetage Incubate pendant 10 minutes bord pris à 200 RPM et 30 degrés. Recueillir les cellules de levure par centrifugation à 9000 G pendant 30 secondes.Lavez les cellules avec 0,5 millilitres d’eau stérile en tourbillonnant pendant cinq secondes. Paletter les cellules de levure à 9000 G pendant 30 secondes à température ambiante. Jeter le surnatant.Ajouter 75 microlitres de tampon de lyse à la palette et au vortex pendant cinq à dix secondes. Ajouter 500 microlitres de 0,5 molar tris tampon de 0,5 molaire tris tampon avec pH 6,8. Avec pH 6.8.Vortex brièvement. Ajouter 600 microlitres de méthanol à l’échantillon. Vortex pendant cinq secondes.Ajouter 150 microlitres de chloroforme à l’échantillon. Vortex pendant cinq secondes. Centrifugeuse les échantillons pendant deux minutes à 12 000 G.Jetez soigneusement l’opaface avec un échantillonneur.Ajouter 600 microlitres de méthanol à l’échantillon. Mélanger soigneusement en inversant le tube plusieurs fois. Centrifugeuses pendant deux minutes à 12 000 G.Jeter le supernatant.Sécher à l’air le palettisation pendant deux minutes à 80 degrés. Dissoudre les protéines précipitées dans 60 microlitres de tampon échantillon Laemmli. Chauffer les échantillons pendant 10 minutes à 14 degrés.Causer le gel polyacrylamide SDS 17,5%Laemmli. Charger 15 microlitres de chaque échantillon dans les poches. Faire fonctionner le gel dans la chambre froide jusqu’à ce que le colorant bleu atteigne environ 65% de la lymphe gel.Tachez le gel avec kumasi bleu brillant et faire l’analyse ou la photo qui est nécessaire comme contrôle de chargement. Sécher le gel dans le séchoir à gel. Gardez-le dans la cassette avec écran de phosphore de stockage pendant trois à cinq jours.Numérisez l’écran sur l’imageur de phosphore. Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons attribué des produits de traduction mitochondrial de deux souches de Cerevisiae de Saccharomyces. Le type sauvage et la suppression de variante mutante du gène Aim23 codant le facteur d’initiation mitochondrique de traduction trois.Les produits de traduction mitochondrial étaient déjà activement étiquetés et séparés dans le gel de polyacrylamide dénaturant. Les échantillons ont été prélevés toutes les deux minutes et demie avant la saturation pour construire le cours du temps. Le gel a été taché, séché et filtré après l’exposition de cinq jours.Dans le cas d’une expérience réussie, l’image montre huit bandes assignées selon le modèle standard. Cependant, les intensités des bandes individuelles peuvent être très variables selon la souche et les conditions expérimentales. Chaque bande correspond à un produit de traduction.Les données suggèrent que la souche mutante est capable de synthèse des protéines mitochondriales parce que tous les produits apparaissant dans le type sauvage sont visibles dans ce mutant. Cependant, les intensités des bandes sont différentes du type sauvage, ce qui signifie que cette suppression d’Aim23 affecte l’expression du gène mitochondrial. Kumasi brassé en tache bleue et sert de contrôle de chargement.Leur résultat en données peut être quantifié pour identifier les différences entre les souches ou les conditions expérimentales à l’aide du logiciel Image G ou Image Quan. Pour ceux-ci, le rapport du signal correspondant à chaque produit est calculé au signal total. Les valeurs moyennes et les écarts types sont calculés dans au moins trois expériences indépendantes.La cinétique des protéines synthétisées retournées est étudiée au cours d’une expérience de l’année écoulée. Les échantillons sont prélevés aux points de temps indiqués après l’arrêt de la réaction d’étiquetage par la méthionine froide et la borymycine. Ce contrôle est nécessaire pour estimer la stabilité du produit.Immuno-coloration avec anti-porine un anticorps est un contrôle de chargement. Nous avons décrit la méthode, qui est souvent utilisée pour étudier la biosynthèse protéique dans les mitochondries de levure. Ce protocole est relativement simple et rapide à exécuter.Dans le même temps, il permet d’obtenir des informations précieuses sur le taux de traduction de quatre aDRM mitochondriaux de levure, ce qui est très avantageux. Cependant, il a plusieurs limitations nécessitant des expériences supplémentaires et se trouve dans ces niveaux interétatiques de protéines et d’ARNM. Il peut fournir des informations sur ces fonctions dans le système de traduction mitochondrial, mais des techniques plus avancées devraient être utilisées pour découvrir le mécanisme.

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Étiquetage et visualisation des produits d'expression du génome mitochondrial dans Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

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