Name: Utilisation de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs embryonnaires de poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Découvrez une méthode d'immunofluorescence pour détecter les dommages à l'ADN induits par les PM2,5 dans les cœurs embryonnaires de Danio rerio. Cette technique permet d'évaluer précisément l'expression protéique et les malformations cardiaques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences de la nature de Chine (numéro de subvention: 81870239, 81741005, 81972999) et le développement du programme académique prioritaire des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu.

Le poisson-zèbre de type sauvage (AB) utilisé dans cette étude a été obtenu auprès du National Zebrafish Resource Center de Wuhan, en Chine. Toutes les procédures animales décrites ici ont été examinées et approuvées par l’Établissement de soins aux animaux du Comité d’éthique de l’Université Soochow.
1. Échantillonnage des PM2,5 et extraction des composés organiques
REMARQUE : Les PM2,5 ont été collectées dans une zone urbaine à Suzhou, en Chine, du 1er au 7 août 2015, comme décrit précédemment5.
<ol><li>Cuire des filtres à membrane de quartz de 47 mm dans un four à moufle à 500 °C pendant 2 h pour éliminer les composants organiques.</li>
	<li>Placez un filtre dans un échantillonneur PM2,5 pour 24 h d’échantillonnage ininterrompu.</li>
	<li>Retirez le filtre et séchez-le pendant 24 h à température ambiante.</li>
	<li>Quantifiez le filtre avec une balance analytique.</li>
	<li>Extraire les composants organiques du filtre par extraction Soxhlet en utilisant le dichlorométhane comme solvant19.</li>
	<li>Sécher la MOE par évaporation rotative dans un bain-marie à 60 °C et un flux d’azote. Dissoudre la MOE dans le DMSO et conserver à -20 °C.</li>
</ol>2. Collecte et traitement des embryons de poisson-zèbre
<ol><li>Maintenir le poisson-zèbre à 28,5 ± 0,5 °C dans un système d’aquaculture à recirculation avec un cycle de photopériode clair de 14 h et de photopériode sombre de 10 h.</li>
	<li>Placez le poisson-zèbre adulte en bonne santé dans un aquarium à un ratio mâle/femelle de 2:1.</li>
	<li>Le lendemain, recueillez les embryons et lavez-les avec de l’eau du système (c.-à-d. de l’eau de reproduction du poisson-zèbre).</li>
	<li>Sélectionnez et divisez au hasard les embryons de poisson zèbre démontrant un développement normal (taille uniforme, grains pleins et pas de coagulation des œufs) en 4 groupes dans des boîtes de Petri en verre individuelles d’un diamètre de 7 cm (environ 50 embryons par plat).</li>
	<li>Traiter les embryons avec des PM2,5 (5 mg/L) en présence ou en l’absence de NAC à 0,25 μM de 2 hpf à 72 hpf. Utiliser le DMSO comme témoin du véhicule jusqu’à une concentration finale à 0,1 % (v/v).</li>
</ol>3. Observation morphologique des embryons de poisson zèbre et dissection cardiaque
<ol><li>À 72 hpf, transférez les embryons sur des lames de verre et observez-les au stéréomicroscope. Enregistrez les malformations cardiaques, telles que l’œdème péricardique, la modification de l’anse et la diminution de la taille.</li>
	<li>Calculer les taux de malformation (le pourcentage d’embryons atteints de malformations cardiaques par rapport au total des embryons vivants) et analyser les différences entre les groupes en utilisant l’ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de la Turquie (p < 0,05 = statistiquement significatif).</li>
	<li>Anesthésier les embryons avec 0,6 mg/mL de MS-222 pour les immobiliser sur des lames de verre.</li>
	<li>Enregistrez les battements cardiaques pendant 30 s et quantifiez les fréquences cardiaques à l’aide du logiciel ImageJ5,20.</li>
	<li>Disséquez les cœurs d’embryons de poisson zèbre avec une aiguille de seringue jetable sous un stéréomicroscope. Attention : Évitez de détruire la forme du cœur.</li>
</ol>4. Dosage d’immunofluorescence
<ol><li>Pour utiliser un test d’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5 dans le cœur des embryons de poisson-zèbre, utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur un côté en verre propre.</li>
	<li>Ajouter 50 μL de paraformaldéhyde à 4 % à 1,25 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour en faire une solution fixative.</li>
	<li>Placez 3 cœurs disséqués dans un cercle de stylo barrière hydrophobe et incubez pendant 20 minutes à température ambiante.</li>
	<li>Décantez la solution au microscope et séchez les échantillons à température ambiante pendant au moins 5 minutes, de sorte que les cœurs se fixent complètement aux lames de verre.</li>
	<li>Lavez les lames trois fois en PBS avec 0,1% Tween 20 (PBST) pendant 5 min par lavage.</li>
	<li>Ajouter 50 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 1000 μL de PBST pour obtenir une solution de BSA à 5% et incuber les lames dans une chambre humide pendant 1 h pour bloquer la liaison aux anticorps non spécifiques.</li>
	<li>Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBST pendant 5 minutes par lavage.</li>
	<li>Diluer 2 μL d’anticorps monoclonal de souris contre le 8-OHdG et 2 μL d’anticorps polyclonaux de lapin contre l’γH2AX dans 296 μL de PBST pour obtenir une solution cocktail d’anticorps primaires fonctionnelle.</li>
	<li>Incuber les échantillons cardiaques avec 50 μL de la solution cocktail d’anticorps primaires contre le 8-OHdG et l’γH2AX dans une chambre humidifiée pendant au moins une heure à température ambiante ou pendant la nuit à 4 °C (l’incubation pendant la nuit peut augmenter l’intensité du signal).</li>
	<li>Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBST pendant 5 minutes par lavage.</li>
	<li>Diluer 1 μL d’anticorps secondaire anti-souris de chèvre marqué FITC et 1 μL d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre cy3 dans 498 μL de PBST pour obtenir une solution de cocktail d’anticorps secondaires fonctionnelle et incuber les échantillons avec les anticorps secondaires (1:500 dans PBST) pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant 5 min par lavage à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Ajouter 20 μL de DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) aux échantillons pour la coloration nucléaire pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Appliquez un couvercle pour glisser et scellez avec du vernis à ongles pour éviter le séchage et le mouvement. Ensuite, imagez les échantillons sous un microscope à fluorescence et quantifiez le signal de fluorescence de la région cardiaque à l’aide du logiciel ImageJ. Calculez les changements relatifs avec la moyenne des échantillons de contrôle DMSO. Déterminer la signification statistique des données comme à l’étape 3.2.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/</a> (2018).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).</li>
<li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li>
<li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs%3A+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+AhR+and+wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li>
<li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+senescence%2C+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li>
<li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+%28PM2.5%29+collected+in+Abidjan%2C+Cote+d%27Ivoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li>
<li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li>
<li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation%2C+apoptosis%2C+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li>
<li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+biochemistry+and+physiology.+Part+B%2C+Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li>
<li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diabetology%22%5BJournal%5D)">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46(2014).</li>
<li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine%2C+reactive+oxygen+species+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).</li>
<li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li>
<li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li>
<li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li>
<li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).</li>
<li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li>
<li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li>
<li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que le poisson-zèbre soit un excellent modèle de vertébrés pour étudier la toxicité pour le développement cardiaque des produits chimiques environnementaux, en raison de la petite taille du cœur embryonnaire, il est difficile d’obtenir suffisamment de protéines pour l’analyse par transfert de Western. Par conséquent, nous présentons une méthode d’immunofluorescence sensible pour quantifier les niveaux d’expression protéique des biomarqueurs de dommages à l’ADN dans le cœur des embryons de poisson-zèbre exposés aux P...

La pollution de l’air est aujourd’hui un grave problème environnemental auquel le monde est confronté. Les particules fines ambiantes (PM2,5),qui sont l’un des indicateurs les plus importants de la qualité de l’air, peuvent transporter un grand nombre de substances nocives et pénétrer dans le système circulatoire sanguin, causant de graves dommages à la santé humaine1. Des études épidémiologiques ont démontré que l’exposition aux PM2,5 peut entraîner un risque accru de malformations cardiaques congénitales (CHD)2,3. Les preuves provenant d’expériences animales ont également montré que les PM2,5 peuvent provoquer un développement cardiaque anormal chez les embryons de poisson-zèbre et la progéniture de souris, mais les mécanismes moléculaires de la toxicité pour le développement cardiaque des PM2,5 sont encore largement inconnus4,5,6.
Les dommages à l’ADN peuvent provoquer l’arrêt du cycle cellulaire et induire l’apoptose, ce qui peut détruire considérablement le potentiel des cellules progénitaires et, par conséquent, nuire au développement cardiaque7). Il a été bien documenté que les polluants environnementaux, y compris les PM2,5,ont le potentiel d’attaquer l’ADN par des mécanismes de stress oxydatif8,9. Le développement cardiaque humain et le poisson-zèbre sont sensibles au stress oxydatif10,11,12. Le 8-OHdG est un marqueur oxydatif de dommages à l’ADN, et le signal γH2AX est un marqueur des cassures double brin de l’ADN. La N-acétyl-L-cystéine (NAC), un précurseur synthétique de la cystéine intracellulaire et du glutathion, est largement utilisée comme composé antioxydant. Dans cette étude, nous utilisons le NAC pour étudier le rôle du stress oxydatif dans les dommages à l’ADN induits par les PM2,513.
Le poisson-zèbre en tant que vertébré modèle a été largement utilisé pour étudier le développement cardiaque et les maladies cardiovasculaires humaines, car les mécanismes du développement cardiaque sont très conservés chez les vertébrés14,15. Les avantages de l’utilisation du poisson-zèbre comme modèle comprennent leur petite taille, leur forte capacité de reproduction et leur faible coût d’alimentation. D’un intérêt particulier pour ces études, les embryons de poisson zèbre ne dépendent pas du système circulatoire au cours du développement précoce et peuvent survivre à une malformation cardiaque grave14. De plus, leur transparence permet d’observer directement l’ensemble du corps au microscope. Ainsi, les embryons de poisson zèbre offrent une occasion exceptionnelle d’évaluer les mécanismes moléculaires impliqués dans l’induction de la toxicité pour le développement cardiaque à la suite de l’exposition à divers produits chimiquesenvironnementaux 5,16,17. Nous avons précédemment rapporté que le stress oxydatif induit par les PM2,5entraîne des dommages à l’ADN et l’apoptose, entraînant des malformations cardiaques chez le poisson-zèbre18. Dans cette étude, nous fournissons un protocole détaillé pour étudier les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans le cœur des embryons de poisson-zèbre.

<table><tbody><tr><td>Anticorps 8-OHdG</td><td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td><td>sc-66036</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>Sartorius, Chine</td><td>BSA124S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Solarbio, Pékin, Chine</td><td>SW3015</td><td>Pour bloquer</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam, USA</td><td>ab104139</td><td>Pour contre-coloration nucléaire.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Solarbio, Pékin, Chine</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Olympus, Japon</td><td>IX73</td><td>Pour l’imagerie des signaux de fluorescence</td></tr>/<tr><td>Chèvre Anti-Lapin IgG Cy3</td><td>Carlsbad, USA</td><td>CW0159</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>Chèvre Anti-Lapin IgG FITC</td><td>Carlsbad, USA</td><td>RS0003</td><td>Anticorps secondaire</td></tr><tr><td>N-Acétyl-L-cystéine (NAC)</td><td>Adamas-Beta, Shanghai, Chine</td><td>616-91-1</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>QILINBEIER, Chine</td><td>TS-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma, Chine</td><td>P6148</td><td>Fabriquer 4 % de paraformaldéhyde pour la fixation.</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>HyClone, États-Unis</td><td>SH30256.01</td><td>Préparez 0,1 % de Tween dans PBS pour le lavage.</td></tr><tr><td>Échantillonneur PM2.5</td><td>TianHong, Wuhan, Chine</td><td>TH-150C</td><td>Pour un échantillonnage ininterrompu des PM2.5 24 heures sur 24.</td></tr><tr><td>Système d’aquaculture en recirculation</td><td>HaiSheng, Shanghai, Chine</td><td></td><td>Le poisson zèbre y a été maintenu.</td></tr><tr><td>Extracteur Soxhlet</td><td>ZhengQiao, Shanghai, Chine</td><td>BSXT-02</td><td>Pour l’extraction de composants organiques.</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon, Canada</td><td>SMZ645</td><td>Pour la dissection cardiaque à partir d’embryons de poisson-zèbre.</td></tr><tr><td>Méthanesulfonate de tricaïne (MS222)</td><td>Sigma,Chine</td><td>E10521</td><td>Pour anesthésier les embryons de poisson-zèbre</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma,Chine</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&gamma ; Anticorps H2AX</td><td>Abcam, États-Unis</td><td>ab26350</td><td>Anticorps primaire</td></tr></tbody></table>

utilisation de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’adn induits par les pm2,5dans les cœurs embryonnaires de poisson-zèbre

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

L’exposition aux particules fines ambiantes (PM2,5)peut entraîner une toxicité pour le développement cardiaque, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents ne sont pas encore clairs. La 8-hydroxy-2'désoxygénase (8-OHdG) est un marqueur des dommages oxydatifs à l’ADN et γH2AX est un marqueur sensible pour les cassures double brin de l’ADN. Dans cette étude, nous avons cherché à détecter les changements 8-OHdG etγH2AXinduits par les PM 2,5 au cœur des embryons de poisson-zèbre à l’aide d’un test d’immunofluorescence. Les embryons de poisson-zèbre ont été traités avec des matières organiques extractibles (EOM) de PM2,5 à 5 μg/mL en présence ou en l’absence d’antioxydant n-acétyl-L-cystéine (NAC, 0,25 μM) à 2 h après la fécondation (HPF). Le DMSO a été utilisé comme contrôle du véhicule. À 72 hpf, les cœurs ont été disséqués à partir d’embryons à l’aide d’une aiguille de seringue et fixés et perméabilisés. Après avoir été bloqués, les échantillons ont été sondés avec des anticorps primaires contre le 8-OHdG et l’γH2AX. Les échantillons ont ensuite été lavés et incubés avec des anticorps secondaires. Les images résultantes ont été observées en microscopie à fluorescence et quantifiées à l’aide d’ImageJ. Les résultats montrent que la MOE des PM2,5 a significativement amélioré les signaux 8-OHdG et γH2AX au cœur des embryons de poissons-zèbres. Cependant, le NAC, agissant comme un piégeur d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), a partiellement contrecarré les dommages à l’ADN induits par la MOE. Ici, nous présentons un protocole d’immunofluorescence pour étudier le rôle des dommages à l’ADN dans les malformations cardiaques induites par les PM2,5qui peuvent être appliqués à la détection des changements d’expression protéique induits par des produits chimiques environnementaux dans le cœur des embryons de poisson-zèbre.

Ce test d’immunofluorescence est une méthode sensible et spécifique pour mesurer les changements d’expression des protéines dans le cœur des embryons de poisson-zèbre exposés à des produits chimiques environnementaux.
Dans cette analyse représentative, les embryons exposés aux PM2,5 en l’absence ou en présence de l’antioxydant NAC ont été évalués pour la présence de malformations cardiaques (Figur...

Ce protocole utilise un test d’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs disséqués des embryons de poisson-zèbre.

Utilisation de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs embryonnaires de poisson-zèbre

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Cette méthode peut être utilisée pour détecter avec précision et facilité l’expression des protéines cibles dans le cœur du poisson-zèbre. Le changement dans la protéine cible est directement détecté en mesurant l’immunofluorescence. Effectuer la collecte et le traitement d’embryons de poisson-zèbre, comme décrit dans le manuscrit du texte.72 heures après la fécondation, transférez les embryons sur des lames de verre et observez-les au stéréomicroscope. Enregistrez les malformations cardiaques, telles que l’œdème péricardique, l’altération de la boucle et la diminution de la taille. Calculer les taux de malformation et analyser les différences entre les groupes en utilisant l’ANOVA à sens unique, suivie du test de comparaison multiple de la Turquie.Après avoir anesthésique les embryons avec 0,6 milligramme par millilitre MS222, enregistrez les battements cardiaques pendant 30 secondes et quantifiez les fréquences cardiaques à l’aide du logiciel Image J. Disséquez soigneusement les cœurs des embryons de poisson zèbre avec une aiguille de seringue jetable sous un stéréomicroscope. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur une glissière en verre propre.Ajouter 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4% à 1,25 microlitres de PBS pour obtenir une solution fixative, puis placer trois cœurs disséqués dans un cercle barrière hydrophobe et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Décantez la solution au microscope et séchez les échantillons à température ambiante pendant au moins cinq minutes. Lavez les lames trois fois dans PBST pendant cinq minutes par lavage.Ajouter 50 microlitres de BSA à 1 000 microlitres de PBST pour obtenir une solution de BSA à 5 % et incuber les lames dans une chambre humide pendant une heure pour bloquer la liaison aux anticorps non spécifiques. Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant cinq minutes par lavage. Diluer deux microlitres d’anticorps monoclonaux de souris contre la 8-hydroxydésoxyguanosine et deux microlitres d’anticorps polyclonaux de lapin contre le gamma-H2AX dans 296 microlitres de PBST pour obtenir une solution cocktail d’anticorps primaires fonctionnelle.Incuber les échantillons cardiaques avec 50 microlitres de la solution primaire de cocktail d’anticorps dans une chambre humidifiée pendant au moins une heure à température ambiante ou pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBST pendant cinq minutes par lavage. Diluer un microlitre d’anticorps secondaire anti-souris de chèvre marqué fitC et un microlitre d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre psy-3 dans 500 microlitres de PBST pour obtenir une solution de cocktail d’anticorps secondaires fonctionnelle.Incuber les échantillons avec les anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant cinq minutes par lavage. Ajouter 20 microlitres de DAPI aux échantillons pour la coloration nucléaire et les incuber pendant 30 minutes à température ambiante.Appliquez un couvercle sur la glissière et scellez-la avec du vernis à ongles pour éviter le séchage et le mouvement. Imagez les échantillons sous un microscope à fluorescence et quantifiez le signal fluorescent de la région cardiaque à l’aide du logiciel ImageJ. Calculer les changements relatifs à l’aide de la moyenne des échantillons témoins du DMSO et déterminer la signification statistique des données.Les embryons exposés aux PM 2,5 en l’absence ou en présence de l’antioxydant, la N-acétyl-L-cystéine, ou NAC, ont été évalués pour la présence de malformations cardiaques. L’EOM des PM 2,5 a coûté une augmentation significative de la tératogenèse cardiaque, telle qu’un œdème péricardique, une altération de la boucle et une diminution de la taille, par rapport aux cœurs traités par DMSO. La fréquence cardiaque a également été significativement diminuée chez les embryons exposés à l’EOM.Ajout de malformations cardiaques atténuées par EOM atténuées par le CNA. Un test d’immunofluorescence a été utilisé pour évaluer l’étendue des dommages à l’ADN dans les tissus traités par EOM. Les niveaux d’expression de 8-hydroxydésoxyguanosine et de gamma-H2AX ont été significativement augmentés dans le cœur des embryons de poisson-zèbre traités par EOM, indiquant une augmentation des dommages oxydatifs à l’ADN et des cassures double brin de l’ADN, respectivement.Les dommages à l’ADN induits par la MOE ont été partiellement contrecarrés par la supplémentation en NAC. Lorsque vous essayez ce protocole, faites attention lorsque vous lavez les échantillons avec du PBS, car le cœur du poisson-zèbre peut se décoller de la glissière.

using-immunofluorescence-to-detect-pm25-induced-dna-damage-zebrafish

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Un moyen rapide pour effectuer immunocoloration des embryons de poisson zèbre coeur est décrite. Comparativement à l'approche immunologique monter ensemble, cette méthode augmente considérablement la pénétration de l'anticorps, ce qui permet d'obtenir des images haute résolution qui révèlent des structures cellulaires / subcellulaires dans le coeur dans un temps de traitement beaucoup plus réduite.

Immunocoloration des Disséqué coeur embryonnaire Zebrafish

Cette vidéo présente un test basé sur l’immunofluorescence très sensible pour détecter les dommages oxydatifs induits par les PM2,5 dans le cœur des embryons de poisson-zèbre en mesurant les niveaux de 8-OHdG et de γH2AX, qui indiquent respectivement des dommages à l’ADN et des cassures de l’ADN double brin.

Dosage de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN médiés par les PM2,5 chez les embryons de poissons

Certaines perturbations génétiques ou l’exposition à des toxines peuvent perturber les processus de développement normaux conduisant à la mort de types de cellules spécifiques. L’analyse de la caspase 3 activée par immunofluorescence dans l’ensemble des embryons de poisson-zèbre révèle une localisation spécifique au stade et au tissu des cellules subissant spécifiquement l’apoptose.

Analyse de l&#39;apoptose dans embryons de poissons zèbres par Whole montage immunofluorescence pour détecter caspase 3

Décrit ici est un protocole d'imagerie semi-automatisé de la fluorescence spécifique de tissu d'embryons de poisson zèbre.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Pour analyser les profils cardiaques de l'expression des gènes au cours du développement cardiaque du poisson zèbre, l'ARN total doit être extrait à partir des coeurs isolés. Ici, nous présentons un protocole de collecte coeurs fonctionnels / battant par la dissection manuelle rapide des embryons de poisson zèbre pour obtenir ARNm spécifique cardiaque.

À grande échelle de poisson zèbre embryonnaire Coeur Dissection d&#39;analyse transcriptionnelle

Les teneurs en protéines dans les cellules et les tissus sont souvent étroitement réglementées par l'équilibre de la production de protéines et de dégagement. En utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP), la cinétique de dégagement de protéines peuvent être mesurées expérimentalement in vivo.

Mesure de la stabilité des protéines dans le salon embryons de poissons zèbres en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP)

Le but de ce protocole est de détailler une nouvelle méthode pour l’évaluation de la fonction cardiaque segmentale chez le poisson zèbre embryonnaire dans des conditions physiologiques et pathologiques.

L’analyse de déplacement de la déformation mécanique myocardique (DIAMOND) révèle l’hétérogénéité segmentale de la fonction cardiaque chez le poisson zèbre embryonnaire

Nous décrivons des outils optimisés pour étudier le cœur du poisson-zèbre in vivo avec la microscopie à fluorescence à feuille de lumière. Plus précisément, nous suggérons des lignées transgéniques cardiaques brillantes et présentons de nouvelles techniques d’intégration et d’immobilisation douces qui évitent les malformations développementales et cardiaques. Un éventuel pipeline d’acquisition et d’analyse de données adapté à l’imagerie cardiaque est également fourni.

Microscopie à feuille de lumière de la dynamique cardiaque rapide chez les embryons de poisson zèbre

La manipulation optogénétique des voies de signalisation peut être une stratégie puissante pour étudier comment la signalisation est décodée dans le développement, la régénération, l’homéostasie et la maladie. Ce protocole fournit des directives pratiques pour l’utilisation d’activateurs de signalisation nodaux et de protéines morphogéniques osseuses (BMP) basés sur le domaine de détection lumière-oxygène-tension dans l’embryon précoce du poisson-zèbre.

Activation de la signalisation optogénétique chez les embryons de poisson-zèbre

Cette étude établit une méthode d’imagerie sensible basée sur l’immunofluorescence pour quantifier la méthylation globale de l’ADN dans les cœurs embryonnaires individuels de poisson-zèbre. Cette approche surmonte le défi du matériel tissulaire limité et contourne le besoin de conversion du bisulfite.

Détection de la méthylation globale de l’ADN dans le cœur des larves de poisson-zèbre

Découvrez une méthode d'immunofluorescence pour détecter les dommages à l'ADN induits par les PM2,5 dans les cœurs embryonnaires de Danio rerio. Cette technique permet d'évaluer précisément l'expression protéique et les malformations cardiaques.

Utilisation de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs embryonnaires de poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal

Utilisation de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM_2,5dans les cœurs embryonnaires de poisson-zèbre

Explorer plus de vidéos