Utilisation de l’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs embryonnaires de poisson-zèbre
15 février 2021
Ce protocole utilise un test d’immunofluorescence pour détecter les dommages à l’ADN induits par les PM2,5dans les cœurs disséqués des embryons de poisson-zèbre.
Cette méthode peut être utilisée pour détecter avec précision et facilité l’expression des protéines cibles dans le cœur du poisson-zèbre. Le changement dans la protéine cible est directement détecté en mesurant l’immunofluorescence. Effectuer la collecte et le traitement d’embryons de poisson-zèbre, comme décrit dans le manuscrit du texte.
72 heures après la fécondation, transférez les embryons sur des lames de verre et observez-les au stéréomicroscope. Enregistrez les malformations cardiaques, telles que l’œdème péricardique, l’altération de la boucle et la diminution de la taille. Calculer les taux de malformation et analyser les différences entre les groupes en utilisant l’ANOVA à sens unique, suivie du test de comparaison multiple de la Turquie.
Après avoir anesthésique les embryons avec 0,6 milligramme par millilitre MS222, enregistrez les battements cardiaques pendant 30 secondes et quantifiez les fréquences cardiaques à l’aide du logiciel Image J. Disséquez soigneusement les cœurs des embryons de poisson zèbre avec une aiguille de seringue jetable sous un stéréomicroscope. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur une glissière en verre propre.
Ajouter 50 microlitres de paraformaldéhyde à 4% à 1,25 microlitres de PBS pour obtenir une solution fixative, puis placer trois cœurs disséqués dans un cercle barrière hydrophobe et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Décantez la solution au microscope et séchez les échantillons à température ambiante pendant au moins cinq minutes. Lavez les lames trois fois dans PBST pendant cinq minutes par lavage.
Ajouter 50 microlitres de BSA à 1 000 microlitres de PBST pour obtenir une solution de BSA à 5 % et incuber les lames dans une chambre humide pendant une heure pour bloquer la liaison aux anticorps non spécifiques. Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant cinq minutes par lavage. Diluer deux microlitres d’anticorps monoclonaux de souris contre la 8-hydroxydésoxyguanosine et deux microlitres d’anticorps polyclonaux de lapin contre le gamma-H2AX dans 296 microlitres de PBST pour obtenir une solution cocktail d’anticorps primaires fonctionnelle.
Incuber les échantillons cardiaques avec 50 microlitres de la solution primaire de cocktail d’anticorps dans une chambre humidifiée pendant au moins une heure à température ambiante ou pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBST pendant cinq minutes par lavage. Diluer un microlitre d’anticorps secondaire anti-souris de chèvre marqué fitC et un microlitre d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre psy-3 dans 500 microlitres de PBST pour obtenir une solution de cocktail d’anticorps secondaires fonctionnelle.
Incuber les échantillons avec les anticorps secondaires pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Décantez la solution et lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant cinq minutes par lavage. Ajouter 20 microlitres de DAPI aux échantillons pour la coloration nucléaire et les incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
Appliquez un couvercle sur la glissière et scellez-la avec du vernis à ongles pour éviter le séchage et le mouvement. Imagez les échantillons sous un microscope à fluorescence et quantifiez le signal fluorescent de la région cardiaque à l’aide du logiciel ImageJ. Calculer les changements relatifs à l’aide de la moyenne des échantillons témoins du DMSO et déterminer la signification statistique des données.
Les embryons exposés aux PM 2,5 en l’absence ou en présence de l’antioxydant, la N-acétyl-L-cystéine, ou NAC, ont été évalués pour la présence de malformations cardiaques. L’EOM des PM 2,5 a coûté une augmentation significative de la tératogenèse cardiaque, telle qu’un œdème péricardique, une altération de la boucle et une diminution de la taille, par rapport aux cœurs traités par DMSO. La fréquence cardiaque a également été significativement diminuée chez les embryons exposés à l’EOM.
Ajout de malformations cardiaques atténuées par EOM atténuées par le CNA. Un test d’immunofluorescence a été utilisé pour évaluer l’étendue des dommages à l’ADN dans les tissus traités par EOM. Les niveaux d’expression de 8-hydroxydésoxyguanosine et de gamma-H2AX ont été significativement augmentés dans le cœur des embryons de poisson-zèbre traités par EOM, indiquant une augmentation des dommages oxydatifs à l’ADN et des cassures double brin de l’ADN, respectivement.
Les dommages à l’ADN induits par la MOE ont été partiellement contrecarrés par la supplémentation en NAC. Lorsque vous essayez ce protocole, faites attention lorsque vous lavez les échantillons avec du PBS, car le cœur du poisson-zèbre peut se décoller de la glissière.
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Aperçu
Ce protocole utilise un dosage par immunofluorescence pour détecter les dommages de l'ADN induits par les PM 2,5 dans les cœurs disséqués d'embryons de poisson zèbre. La méthode permet une détection précise de l'expression de la protéine cible dans le cœur du poisson zèbre.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Toxicologie
Contexte
- L'immunofluorescence est une technique puissante permettant de visualiser l'expression des protéines.
- Les embryons de poisson zèbre constituent un modèle précieux pour l'étude des processus de développement.
- L'exposition aux PM 2,5 est connue pour provoquer divers problèmes de santé, notamment des dommages à l'ADN.
- Comprendre les effets des toxines environnementales sur le développement est essentiel pour la santé publique.
Objectif de l'étude
- Évaluer l'impact des PM 2,5 sur l'intégrité de l'ADN dans les cœurs de zebrafish.
- Utiliser l'immunofluorescence pour détecter les modifications de l'expression protéique.
- Mettre en place une méthode fiable pour évaluer les malformations cardiaques chez les embryons de zebrafish.
Méthodes utilisées
- Prélèvement et traitement des embryons de poisson zèbre.
- Essai d'immunofluorescence pour détecter les protéines cibles.
- Observation des embryons au microscope stéréo 72 heures après la fécondation.
- Analyse statistique à l'aide de l'ANOVA à un facteur et du test de comparaison multiple de Tukey.
Résultats principaux
- Détection de l'ADN endommagé dans les cœurs de zebrafish suite à une exposition aux PM 2,5.
- Identification de malformations cardiaques telles que l'œdème péricardique et des anomalies de la boucle cardiaque.
- Quantification des taux de malformations dans différents groupes de traitement.
- Signification statistique des résultats confirmée par analyse.
Conclusions
- L'exposition aux PM 2,5 entraîne des dommages importants de l'ADN dans les cœurs de poisson-zèbre.
- Le dosage d'immunofluorescence est efficace pour étudier les modifications de l'expression des protéines.
- Ce modèle peut être utilisé pour des recherches ultérieures sur les toxines environnementales et la biologie du développement.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole d'immunofluorescence permet une détection mécanistique des risques liés aux polluants environnementaux en quantifiant des biomarqueurs de dommages de l'ADN dans les cœurs d'embryons de poisson zèbre, un modèle prédictif de cardiotoxicité développementale. Le test soutient les démarches de validation ciblée et de criblage phénotypique en établissant un lien entre l'exposition aux PM2.5 et les voies de stress oxydatif ainsi que de cassures double-brin de l'ADN. Il fournit des données translationnelles sur les biomarqueurs utiles à l'évaluation des risques en phase précoce de découverte, facilitant le tri des bibliothèques chimiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en détectant l'8-OHdG et l'γH2AX comme indicateurs mécanistiques des dommages oxydatifs de l'ADN et des cassures double brin.
- Valeur opérationnelle : Permet une détection biologique des risques grâce à des lectures quantitatives par immunofluorescence qui précisent l'activation des voies dans le tissu cardiaque.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans la cible en corrélant les modifications des biomarqueurs induites par les PM2.5 avec des phénotypes de malformations cardiaques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare un tissu cardiaque de poisson zèbre validé pour le criblage ultérieur de composés génotoxiques à l’aide de la détection de l’expression protéique par immunofluorescence.
- Valeur opérationnelle : Fournit des résultats quantitatifs standardisés et reproductibles grâce à l’analyse par ImageJ des signaux fluorescents dans les cœurs disséqués.
- Valeur de scalabilité : Permet la réutilisation de la plateforme pour évaluer les modifications de l’expression protéique induites par des produits chimiques environnementaux dans un système pertinent pour l’étude des maladies.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Démontre la pertinence pathologique en détectant les lésions de l'ADN dans les cœurs d'embryons de poisson zèbre, un modèle possédant des voies de développement cardiaque conservées.
- Valeur opérationnelle : Assure une continuité translationnelle depuis la découverte jusqu'à la validation préclinique en fournissant un éclairage mécanistique sur la cardiotoxicité induite par les PM2.5.
- Progrès pondéré par le risque : Informe les décisions d'orientation (go/no-go) en quantifiant l'atténuation des lésions de l'ADN grâce à un traitement co-adjuvant par des antioxydants (par exemple, NAC).
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de la cible à l'identification de composés candidats, en fournissant des lectures mécanistiques qui renforcent la confiance prédictive lors des campagnes de criblage précoce.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification des hypothèses et la clarification des voies biologiques en quantifiant les biomarqueurs de dommages de l'ADN suite à une exposition à des agents toxiques environnementaux.
- Écrantage : Assure la disponibilité du test et fournit des résultats quantitatifs grâce à une coloration immunofluorescente standardisée et à la quantification de la fluorescence basée sur ImageJ dans les cœurs de zebrafish.
- Analytique : Génère des résultats statistiques (par exemple, variations relatives de fluorescence, significations dérivées d'ANOVA) permettant la comparaison entre différentes conditions et la validation des résultats positifs.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans une continuité préclinique en utilisant un modèle de zebrafish dont les voies de développement sont pertinentes pour l'évaluation de la cardiotoxicité humaine.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité réutilisable pour l'analyse de bibliothèques chimiques variées afin d'évaluer leur potentiel génotoxique dans un modèle de cœur de vertébré.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive grâce à la réduction des risques mécanistiques des voies de dommages de l'ADN dans le criblage de la toxicité développementale.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité par des protocoles fixes de dissection, de coloration et d'imagerie utilisant des barrières hydrophobes et la microscopie en fluorescence.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller ou de ne pas aller en reliant les modifications des biomarqueurs aux résultats phénotypiques, réduisant ainsi les risques biologiques en phase tardive dans les programmes de toxicologie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des composés en fonction de leur potentiel de dommages de l'ADN dans un modèle de cœur en développement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des embryons de poisson zèbre, la dissection cardiaque et les techniques d'immunofluorescence.
- Dépend de la microscopie à fluorescence et du logiciel ImageJ pour la quantification du signal et l'analyse statistique.
- Exige une standardisation inter-équipes du moment de la dissection, de l'incubation avec les anticorps et des procédures de lavage afin d'éviter la perte de tissus.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'extension du test à d'autres tissus de poisson zèbre ou à d'autres modèles de maladies.
- Comprend des limites pratiques telles que le détachement du tissu cardiaque pendant les étapes de lavage, nécessitant une manipulation soigneuse au PBS, comme indiqué dans la documentation source.
