Name: Assemblage et fonctionnement d’un dispositif acoustofluidique pour une administration améliorée de composés moléculaires aux cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Apprenez l'assemblage d'un dispositif acoustofluidique pour la livraison rapide de biomolécules aux cellules en maintenant leur viabilité. Cette méthode ouvre des perspectives pour les thérapies cellulaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu en partie par le financement de la National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) et des National Institutes of Health (U01HL127518). Les services de photolithographie ont été fournis par le Centre de micro/nanotechnologie de l’Université de Louisville.

Les dons de sang total ont été recueillis auprès de donneurs en bonne santé conformément aux protocoles approuvés par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Louisville.
1. Fabrication d’un dispositif acoustofluidique
<ol><li>Obtenir un photomasque avec un dessin en spirale concentrique contenant des canaux d’un diamètre de 500 μm. Un fichier CAO est fourni dans les fichiers supplémentaires à titre d’exemple. Un photomasque personnalisé peut être commandé auprès d’un fournisseur commercial ou modelé à l’aide d’un enregistreur de masques.</li>
	<li>Préparez un moule de la conception en spirale concentrique sur une plaquette de silicium revêtue de photorésine en utilisant des techniques de photolithographie standard.<ol>
<li>Ajouter environ 2 c. à soupe (~30 mL) de SU-8 2100 à une plaquette de silicium de 100 mm.</li>
		<li>Faites tourner la plaquette sur une toupie à une vitesse de 150 tr/min pendant 30 s pour étaler la photorésine, puis augmentez la vitesse à 1 200 tr/min pendant 60 s pour obtenir une épaisseur de 200 μm.</li>
		<li>Durcir la plaquette revêtue de photorésine dans un four à vide en polyimide avec une rampe de 30 minutes et un séjour de 30 minutes à 115 °C, puis descendre en rampe pendant 30 minutes.</li>
		<li>Exposez la plaquette revêtue de photorésine pendant 130 s à l’aide d’un aligneur de masque avec le photomasque de l’étape 1.1.</li>
		<li>Cuire la plaquette après exposition selon le même procédé décrit à l’étape 1.2.3.</li>
		<li>Développer la photorésine dans la solution de développement SU-8 pendant environ 8 min. ATTENTION : N’utilisez qu’une solution de développement dans une hotte chimique bien ventilée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Silaniser le moule pour rendre la surface plus hydrophobe. Placer la plaquette revêtue de photorésine dans un dessicateur et ajouter une goutte de chlorosilane de 20 μL(C8H4Cl3F13Si). Appliquez du vide sur la chambre pendant 30 s, puis scellez la chambre et laissez-le pendant la nuit. ATTENTION : Le chlorosilane est très dangereux et inflammable. L’exposition provoque de graves brûlures et des lésions oculaires.</li>
	<li>Mélanger 54 g de base de polymiméthsiloxane (PDMS) et 6 g d’agent de durcissement dans une tasse et mélanger vigoureusement et soigneusement avec une spatule pendant au moins 1 min.</li>
	<li>Placer la tasse contenant la solution PDMS dans un dessicateur pendant environ 30 min ou jusqu’à ce que les bulles d’air résiduelles soient éliminées de la solution.</li>
	<li>Placez la plaquette revêtue de photorésine avec les motifs orientés vers le haut dans une boîte de Pétri de 150 mm.</li>
	<li>Versez la solution PDMS sur le moule à l’intérieur de la boîte de Pétri de 150 mm.</li>
	<li>Si nécessaire, placez la boîte de Petri de 150 mm à l’intérieur d’un dessiçateur et appliquez du vide jusqu’à ce que les bulles d’air résiduelles disparaissent.</li>
	<li>Transférer la boîte de Petri de 150 mm dans un four de laboratoire et la cuire pendant 2 h à 60 °C pour durcir le PDMS.</li>
	<li>Après durcissement, retirez soigneusement le PDMS de la boîte de Pétri en coupant autour des bords de la plaquette à l’aide d’une lame de rasoir.</li>
	<li>Découpez chaque appareil à l’aide d’un couteau ou d’une lame de rasoir.</li>
	<li>Percer des trous à travers les orifices d’entrée et de sortie de chaque appareil à l’aide d’un poinçon de biopsie de 2,5 mm.</li>
	<li>Placez chaque dispositif PDMS dans un ensemble plasma avec des canaux exposés (orientés vers le haut). Appliquez un traitement au plasma d’oxygène (100 W pendant 45 s, 500 mbarO2)puis placez immédiatement chaque dispositif PDMS sur une lame de microscope en verre de chaux soude propre (75 mm x 25 mm x 1 mm) avec des canaux orientés vers la surface du verre.</li>
	<li>Laissez les appareils se lier pendant la nuit à température ambiante.</li>
	<li>Appliquez doucement du silicone sur la surface du transducteur piézo-piézo-1 cm de diamètre à une épaisseur d’environ 1 à 2 mm, puis alignez soigneusement le transducteur avec la spirale concentrique et appuyez doucement sur le fond de la lame du microscope en verre (côté opposé au dispositif PDMS).</li>
</ol>2. Assemblage et fonctionnement du système acoustofluidique
<ol><li>Connectez un microcontrôleur à un ordinateur à l’aide d’un câble USB A vers B. Un voyant d’alimentation vert (étiqueté PWR) devrait s’allumer.</li>
	<li>Utilisez le programme associé sur l’ordinateur pour télécharger un programme qui génère un signal de 8 MHz. Un exemple de programme est fourni dans les Files supplémentaires . Après avoir téléchargé le programme, il sera stocké dans la mémoire du microprocesseur et n’aura pas besoin d’être téléchargé à nouveau.</li>
	<li>Souder un fil 1 » 22G à l’extrémité de chaque fil sur le transducteur PZT.</li>
	<li>Connectez le fil de borne négatif (noir) du transducteur PZT à une broche GND via le fil soudé.</li>
	<li>Connectez le fil de borne positif (rouge) du transducteur PZT à la broche de sortie (#9 dans l’exemple de programme fourni) via le fil soudé.</li>
	<li>En option, montez le dispositif acoustofluidique et le microcontrôleur dans un boîtier imprimé en 3D. Les fichiers CAO sont fournis dans les F iles Supplemental à titred’exemples. Des fils supplémentaires peuvent être connectés à d’autres broches de microcontrôleur pour contrôler un indicateur LED externe et un bouton-poussoir marche / arrêt si vous le souhaitez.</li>
	<li>Coupez des sections de 3-6 " de tubes en plastique souple tygon PVC (1/16 " ID, 1/8 " OD) et poussez le tube dans les ports d’entrée et de sortie. Il peut être nécessaire de faire pivoter le tube tout en appliquant une pression jusqu’à ce qu’il s’adapte à l’ouverture. Éventuellement, après avoir inséré le tube dans chaque port, du colle peut être appliqué à la jonction pour lier le PDMS et le tube ensemble.</li>
	<li>Assemblez le réservoir microfluidique conformément aux instructions du fabricant.</li>
	<li>Couper une section de 3-6 « de tygon PVC tube en plastique souple (1/16 « ID, 1/8 » OD) et pousser le tube sur le tube ID 1/32 « à partir du tube de sortie du réservoir microfluidique. Si vous le souhaitez, enroulez la jonction avec un film de paraffine pour éviter les fuites.</li>
	<li>Remplissez une seringue de 60 mL avec de l’air ambiant (éventuellement, filtrez l’air avec un filtre de 0,2 μm) et connectez-la à un tube en PVC tygon (1/16 « ID, 1/8 » OD) sur le côté du réservoir microfluidique.</li>
	<li>Régler la pompe à seringue à un débit de 200 mL/h pour pousser les solutions d’agent de contraste cellulaire/ultrasonore à travers le dispositif acoustofluidique à un débit volumétrique de 50 mL/h et prélever les échantillons de la sortie du dispositif acoustofluidique dans un tube de centrifugation de 50 mL. Éventuellement, rincer le canal avant le traitement acoustofluidique avec 15 mL de solution d’éthanol à 70% pour augmenter la stérilité des canaux fluidiques. De plus, les canaux peuvent être rincés avec 15 mL d’eau désionisée pour éliminer l’éthanol résiduel dans l’appareil avant de pomper les cellules à travers le système.</li>
</ol>3. Préparation d’agents de contraste à ultrasons
REMARQUE: Les agents de contraste à ultrasons améliorent considérablement l’administration acoustofluidique de composés moléculaires en augmentant transitoirement la perméabilisation des membranes cellulaires voisines19. L’administration moléculaire est très limitée sans agents de contraste à ultrasons dans ce système.
<ol><li>Préparer une solution de phospholipide dans un flacon de scintillation de 20 ml contenant le mélange suivant :<ol>
<li>Ajouter 25 mg de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC).</li>
		<li>Ajouter 11,6 mg de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-éthylphosphocholine (DSEPC).</li>
		<li>Ajouter 0,26 mg de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycérol (DSPG).</li>
		<li>Ajouter 0,88 mg de stéarate de polyoxyéthylène40.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter le chloroforme jusqu’à ce que tous les phospholipides soient dissous (p. ex. 3 mL de chloroforme).</li>
	<li>Évaporer le chloroforme dans un desséchant pendant 48 h pour former un film lipidique sec (l’évaporation sous argon ou avec un évaporateur rotatif peut être utilisée pour accélérer le processus de séchage).</li>
	<li>Réhydratez le film lipidique avec 10 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Soniquez la solution lipidique pendant 3 min à 40% d’amplitude pour former une solution micellaire cationique.</li>
	<li>Après la sonication, conservez la solution de phospholipide à 2-6 °C jusqu’à 1 mois.</li>
	<li>Pour préparer des agents de contraste à ultrasons, ajouter 200 μL de solution micellaire cationique et 600 μL de PBS stérile à un flacon de septum en verre de 2 mL.</li>
	<li>Scellez le flacon en sertissant le capuchon.</li>
	<li>Utilisez une aiguille 1,5 » 20G pour remplir l’espace de tête du flacon avec du décafluorobutane gazeux pendant 30 s.</li>
	<li>Amalgamer le flacon pendant 45 s à 4 350 cpm pour former des agents de contraste à ultrasons remplis de perfluorobutane remplis de gaz.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de solution d’agent de contraste à ultrasons par 1 mL de solution cellulaire immédiatement avant de pomper le mélange combiné agent de contraste/cellule à travers le dispositif acoustofluidique. La solution cellulaire peut être modifiée comme désiré par l’utilisateur, mais dans nos études la solution cellulaire s’est composée des cellules T primaires à l’étape 4.21, et des cellules cancéreuses du poumon A549 à l’étape 5.7, respectivement.</li>
</ol>4. Préparation des cellules T primaires
<ol><li>Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) des solutions de sang total et les conserver à -150 °C. La séparation par gradient de densité contenant un substrat est couramment utilisée pour séparer les PBMC du sang total24,25,26.</li>
	<li>Décongeler le flacon congelé dans un bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Diluer les PBMC décongelés 1:10 avec du PBS dans un tube à centrifuger de 15 ml. Chaque flacon de 1 ml contient environ 10 millions de PBMC.</li>
	<li>Pbmcs dilués par centrifugeuse à 580 x g pendant 11 min à 4 °C.</li>
	<li>Aspirez le surnageant et ajoutez 13 mL de tampon d’exécution de MACs pour ressusciter les cellules.</li>
	<li>Comptez les PBMC avec un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifuger à nouveau les PBMC à 580 x g pendant 11 min à 4 °C et aspirer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 40 μL de tampon d’exploitation réfrigéré par 10 millions de PBMC.</li>
	<li>Pour isoler les lymphocytes T, ajoutez 10 μL de cocktail d’anticorps pan-cellulaires à la biotine par 10 millions de PBMC.</li>
	<li>Agiter doucement les PBMC et conserver la solution à 4 °C pendant 5 min pour 10 millions de cellules.</li>
	<li>Ajouter 30 μL de tampon en cours d’exécution et 20 μL de Cocktail micro-bouilles pan-T-cell par 10 millions de PBMC.</li>
	<li>Mélanger soigneusement les PBMC et les billes et incuber pendant 15 min supplémentaires à 4 °C.</li>
	<li>Ajoutez la mémoire tampon en cours d’exécution pour atteindre un volume total de 500 μL.</li>
	<li>Séparez les lymphocytes T primaires à l’aide d’un instrument de tri magnétique de paillasse disponible dans le commerce à l’aide du paramètre « épuise la séparation » suivant le protocole du fabricant. Cette étape devrait produire entre 5 et 10 millions de lymphocytes T après le tri cellulaire.</li>
	<li>Comptez les lymphocytes T à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Diluer les lymphocytes T dans 10 mL de PBS stérile et centrifuger à 580 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les cellules.</li>
	<li>Aspirer les lymphocytes T surnageants et remises en suspension dans 1 ml de PBS.</li>
	<li>Comptez les lymphocytes T à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre et aliquote 1 million/mL pour les expériences.</li>
	<li>Préparer une solution de fluorescéine à 1 mg/mL dans du PBS.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de solution de fluorescéine à 1 mg/mL par 1 mL de solution à cellules T (concentration finale de fluorescéine = 100 μg/mL) immédiatement avant le traitement.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de solution d’agent de contraste à ultrasons comme décrit précédemment à l’étape 3.11.</li>
	<li>Traiter des aliquotes de 1 ml de cellules à l’aide du système acoustofluidique (voir les étapes 2.10 à 2.11). Cette étape améliore l’administration de la fluorescéine dans les cellules T primaires.</li>
	<li>Immédiatement après le traitement, laver les cellules trois fois par centrifugation à 580 x g pendant 10 min avec 500 μL de PBS pour éliminer la fluorescéine extracellulaire. Les cellules doivent être lavées dans les 10 minutes suivant l’ajout d’une solution de fluorescéine.</li>
	<li>Après l’étape finale de lavage, ressusciter les cellules dans 250 μL de PBS et mesurer la fluorescence sur le cytomètre de flux.</li>
</ol>5. Préparation des cellules cancéreuses du poumon A549
<ol><li>Culturez des cellules A549 (épithéliales basales alvéolaires humaines adénocarcinomiques) dans des milieux DMEM complets (10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de pénicilline/streptomycine) à 37 °C et 5 % deCO2 dans une fiole de culture de tissu à fond plat.</li>
	<li>Récoltez les cellules A549 lorsqu’elles atteignent une confluence de 70 à 90%. Aspirer les milieux du ballon et laver les cellules une fois avec du PBS pour éliminer les protéines sériques.</li>
	<li>Ajouter de la trypsine (0,25 %) d’EDTA dans le ballon et incuber pendant 5 min à 37 °C. La trypsine est une enzyme digestive qui provoque le détachement des cellules de la surface inférieure du ballon de culture tissulaire.</li>
	<li>Transférer la solution de trypsine dans un tube à centrifuger de 15 ml et la neutraliser en ajoutant un support DMEM complet à un rapport de 1:3.</li>
	<li>Granuler les cellules par centrifugation à 1 500 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et le ressusciter à une concentration de 100 000/mL dans une solution de PBS contenant 200 mM de tréhalose dans un flacon conique de 15 mL.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de solution d’agent de contraste à ultrasons comme décrit précédemment à l’étape 3.11.</li>
	<li>Traiter des aliquotes de 1 ml de cellules à l’aide du système acoustofluidique (voir les étapes 2.10 à 2.11). Cette étape améliore l’administration du tréhalose dans les cellules cancéreuses du poumon A549.</li>
	<li>Immédiatement après le traitement, laver les cellules trois fois par centrifugation avec 500 μL de PBS pour éliminer le tréhalose extracellulaire. Les cellules doivent être lavées dans les 10 minutes après l’ajout d’une solution de tréhalose.</li>
	<li>Après l’étape finale de lavage, ressusciter les cellules dans 100 μL de PBS.</li>
	<li>Ajouter 11 μL de solution de Triton X-100 à 1 % aux cellules de lyse et libérer du tréhalose intracellulaire.</li>
	<li>Vortex pendant 15 s, puis incuber pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Vortex à nouveau pendant 15 s, puis mesurer la concentration de tréhalose en utilisant le test de tréhalose disponible dans le commerce suivant la recommandation du fabricant.</li>
</ol>

<ol><li>Gardlik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectors+and+delivery+systems+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Science+Monitor%22%5BJournal%5D)">Vectors and delivery systems in gene therapy.</a> Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).</li>
<li>Wahlers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+multiplicity+of+infection+and+protein+stability+on+retroviral+vector-mediated+gene+expression+in+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells.</a> Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).</li>
<li>Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+and+nonviral+delivery+systems+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Viral and nonviral delivery systems for gene delivery.</a> Advanced Biomedical Research. 1, 27(2012).</li>
<li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+theories%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+%26+Biological+Engineering+%26+Computing%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation theories: a review.</a> Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).</li>
<li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation%3A+theory+and+methods%2C+perspectives+for+drug+delivery%2C+gene+therapy+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).</li>
<li>Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulation+and+experimental+demonstration+of+the+electric+field+assisted+electroporation+microchip+for+in+vitro+gene+delivery+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement.</a> Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).</li>
<li>Sugar, I. P., Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+model+for+electric+field-induced+membrane+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Electroporation.+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stochastic model for electric field-induced membrane pores.</a> Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).</li>
<li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation%3A+a+general+phenomenon+for+manipulating+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).</li>
<li>Hashimoto, M., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+enables+the+efficient+mRNA+delivery+into+the+mouse+zygotes+and+facilitates+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing.</a> Scientific Reports. 5, 11315(2015).</li>
<li>Klibanov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+contrast+agents%3A+targeted+ultrasound+imaging+and+ultrasound-assisted+drug-delivery+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Radiology%22%5BJournal%5D)">Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications.</a> Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).</li>
<li>Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-triggered+release+of+materials+entrapped+in+microbubble-liposome+constructs%3A+a+tool+for+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).</li>
<li>Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+microbubble-facilitated+sonoporation+for+drug+and+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Delivery%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery.</a> Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).</li>
<li>Secomski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ultrasound+experiments%3A+Standing+wave+and+multiple+reflections+influence+on+the+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasonics%22%5BJournal%5D)">In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome.</a> Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).</li>
<li>Gedge, M., Hill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidics+17%3A+theory+and+applications+of+surface+acoustic+wave+devices+for+particle+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+tweezers%3A+patterning+cells+and+microparticles+using+standing+surface+acoustic+waves+%28SSAW%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW).</a> Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).</li>
<li>Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+particle+separation+in+a+microfluidic+channel+via+standing+surface+acoustic+waves+%28SSAW%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW).</a> Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).</li>
<li>Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+operation+of+acoustofluidic+devices+supporting+bulk+acoustic+standing+waves+for+sheathless+focusing+of+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53861(2016).</li>
<li>Belling, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustofluidic+sonoporation+for+gene+delivery+to+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).</li>
<li>Centner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-induced+molecular+delivery+to+erythrocytes+using+a+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system.</a> Biomicrofluidics. 14 (2), 024114(2020).</li>
<li>Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+developing+CAR+T-cell+therapy+for+HIV+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure.</a> Frontiers in Immunology. 11, 361(2020).</li>
<li>Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+and+future+of+CAR+T+cells+for+B-Cell+Acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).</li>
<li>Hand, S. C., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approaches+for+improving+desiccation+tolerance%3A+insights+from+the+brine+shrimp+Artemia+franciscana%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana.</a> Planta. 242 (2), 379-388 (2015).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-drying+of+mammalian+cells+using+trehalose%3A+preservation+of+DNA+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6198(2017).</li>
<li>Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+isolation+techniques+for+human+peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+Cell+recovery+and+viability%2C+population+composition%2C+and+cell+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality.</a> Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).</li>
<li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).</li>
<li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+%28PBMC%29+by+density+gradient+centrifugation+on+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+insight+into+mechanisms+of+sonoporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biophysical insight into mechanisms of sonoporation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).</li>
<li>Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+perforation+and+recovery+dynamics+in+microbubble-mediated+sonoporation%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).</li>
<li>Kopechek, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+targeted+microbubble+destruction-mediated+delivery+of+a+transcription+factor+decoy+inhibits+STAT3+signaling+and+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth.</a> Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).</li>
<li>Bhutto, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+molecular+weight+on+sonoporation-mediated+uptake+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medical+Biology%22%5BJournal%5D)">Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells.</a> Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).</li>
<li>Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-dependent+evaluation+of+the+role+of+definity+in+producing+sonoporation+of+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrasound+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).</li>
<li>Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+insight+into+mechanisms+of+sonoporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Biophysical insight into mechanisms of sonoporation.</a> Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).</li>
<li>Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonoporation+of+cultured+cells+in+the+rotating+tube+exposure+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system.</a> Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).</li>
</ol>

Les coauteurs MAM et JAK détiennent la propriété de DesiCorp, qui pourrait bénéficier financièrement des produits liés à cette recherche.

Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un système acoustofluidique à faible coût qui améliore l’administration intracellulaire de biomolécules pour des applications de recherche. Il existe plusieurs facteurs importants à prendre en compte lors de l’assemblage et de l’exploitation de ce système. Le dispositif acoustofluidique est fabriqué en PDMS, qui est un matériau biocompatible qui peut facilement être moulé avec des dimensions de canal cohérentes27. Les canaux de l’appareil peu...

Des plateformes virales et non virales ont été utilisées pour améliorer la livraison moléculaire aux cellules. L’administration virale (transduction) est une technique couramment utilisée dans les thérapies cellulaires nécessitant une modification génomique. Les limites de l’administration virale comprennent la mutagenèse insertionnelle potentielle, la capacité transgénique limitée et la multiplicité indésirable de l’infection1,2. Par conséquent, des techniques d’administration moléculaire non virale sont en cours de développement pour un large éventail d’applications biomédicales et de recherche. Les techniques courantes comprennent la mécanique, l’électricité, l’hydrodynamique ou l’utilisation de l’énergie laser pour améliorer l’absorption des biomolécules dans les cellules 3. L’électroporation est une plate-forme d’administration moléculaire non virale couramment utilisée qui a la capacité d’induire une perforation transitoire dans la membrane plasmique pour l’administration intracellulaire de composés moléculaires4,5,6,7,8,9. Cependant, la perforation transitoire de la membrane plasmique est un processus stochastique et l’absorption moléculaire par électroporation dépend généralement de la diffusion passive à travers les pores transitoires de la membrane4,7,8.
Une méthode alternative est l’utilisation de l’ultrason pour la livraison moléculaire intracellulaire améliorée par l’intermédiaire de la cavitation des agents de contraste d’ultrason (c.-à-d., microbulles remplies de gaz). La cavitation par microbulles induit des effets de microstreaming dans les milieux environnants qui peuvent provoquer une perforation transitoire des membranes plasmiques voisines (« sonoporation ») permettant une absorption intracellulaire rapide des biomolécules via des mécanismes de transport passifs ou actifs10,11,12. La sonoporation est une technique efficace pour l’administration moléculaire rapide aux cellules, mais cette approche nécessite souvent un équipement coûteux et des méthodes de traitement en vrac qui sont limitées par un débit plus faible et une plus grande variabilité dans les conditions d’exposition aux ultrasons13. Pour remédier à ces limitations, des dispositifs acoustofluidiques, qui permettent une sonoporation cohérente des cellules en suspension, sont actuellement en cours de développement.
L’acoustofluidique est un domaine en expansion qui intègre les technologies ultrasonores et microfluidiques pour une grande variété d’applications. Cette approche a déjà été utilisée pour la séparation des particules en appliquant une énergie ultrasonore continue pour induire des ondes acoustiques stationnaires dans les canaux fluidiques14,15,16,17. Les particules sont triées vers différentes parties du dispositif en fonction d’une variété de propriétés telles que la taille des particules, la densité et la compressibilité par rapport au milieu16. Des technologies acoustofluidiques sont également en cours de développement pour permettre une livraison moléculaire rapide à une variété de types de cellules pour des applications de recherche et la fabrication de thérapies cellulaires18. Récemment, nous avons démontré l’administration moléculaire améliorée aux érythrocytes utilisant un dispositif acoustofluidic PDMS-basé19. Dans la plate-forme acoustofluidique, la dynamique des cellules et des microbulles peut être manipulée pour induire des interactions physiques qui permettent une meilleure administration des biomolécules. L’efficacité et la cohérence de l’administration moléculaire intracellulaire peuvent potentiellement être augmentées en optimisant la distance entre les cellules et les microbulles.
Une application importante pour la sonoporation à médiation acoustofluidique implique le transport des biomolécules dans les cellules T humaines primaires. Les immunothérapies basées sur le transfert de lymphocytes T adoptifs, telles que la thérapie à base de lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique (CAR T), émergent rapidement pour le traitement de diverses maladies, y compris le cancer et les virus tels que le VIH20. La thérapie de CAR T a été particulièrement efficace dans les patients pédiatriques de leucémie lymphoblastique aiguë (LAL), avec des taux complets de remise de 70-90%21. Cependant, la fabrication de lymphocytes T pour ces thérapies dépend généralement de la transduction virale qui est limitée par la mutagenèse insertionnelle potentielle, les longs délais de traitement et les défis liés à la fourniture de biomolécules non génétiques telles que des protéines ou de petites molécules1. Les méthodes d’administration moléculaire à médiation acoustofluidique peuvent potentiellement surmonter ces limites et améliorer la fabrication de thérapies à base de cellules T.
Une autre application importante pour la sonoporation à médiation acoustofluidique implique l’administration intracellulaire de composés conservateurs, tels que le tréhalose, qui protègent les cellules pendant la congélation et la dessiccation. Le tréhalose est produit par certains organismes dans la nature et les aide à tolérer la congélation et la dessiccation en protégeant leurs membranes cellulaires22,23. Cependant, le tréhalose n’est pas produit par les cellules de mammifères et est imperméable aux membranes cellulaires des mammifères. Par conséquent, des techniques efficaces de livraison moléculaire, telles que la sonoporation, sont nécessaires afin d’atteindre des niveaux intracellulaires suffisants de tréhalose requis pour protéger les membranes cellulaires internes. Cette approche est actuellement en cours de développement pour la préservation à sec de divers types de cellules.
Ce protocole fournit une description détaillée de l’assemblage et du fonctionnement d’un système acoustofluidique relativement peu coûteux piloté par un microcontrôleur. Les agents de contraste d’ultrason sont utilisés pour induire la sonoporation dans les canaux fluidiques et permettre la livraison moléculaire rapide à divers types de cellules, y compris les cellules T et les cellules cancéreuses. Ce système acoustofluidique peut être utilisé pour une variété d’applications de recherche et peut également être utile comme système prototype pour évaluer les méthodes de sonoporation pour améliorer les processus de fabrication de thérapie cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Fabrication d’un dispositif acoustofluidique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862 (SKU)</td><td>https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/</td></tr> <tr><td>Harris Uni-Core (2.5 mm)</td><td>Sciences de la microscopie électronique</td><td>69039-25</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir microfluidique pour tube Falcon de 15 mL - S (port 2/4)</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KPT-S-2 (SKU)</td><td>https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port</td></tr><tr><td>Lame de microscope</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium</td></tr><tr><td>trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>105732-02-3 (n° de cas.)</td><td>Le chlorosilane est très hazaradeux et inflammable. L’exposition provoque de graves brûlures et des lésions oculaires.</td></tr><tr><td>Tube en plastique souple en PVC Tygon (1/16 » ID, 1/8 » OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>5233K51 (Part #)</td><td>https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/</td></tr><tr><td>Assembly of Acoustofluidic System</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno</td><td>Arduino</td><td>7630049200050 (Code-barres)</td><td>https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3</td></tr><tr><td><fort>Préparation d’agents de contraste à ultrasons</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-éthylphosphocholine (DSEPC)</td><td>Avanti Lipids</td><td>890703P-25mg (SKU)</td><td>https://avantilipids.com/product/890703</td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)</td><td>Avanti Lipids</td><td>850365P-25mg (SKU)</td><td>https://avantilipids.com/product/850365</td></tr><tr><td>1,2- distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol (DSPG)</td><td>Avanti Lipids</td><td>840465P-25mg (SKU)</td><td>https://avantilipids.com/product/840465</td></tr><tr><td>APF-140HP (gaz décafluorobutate)</td><td>FlouroMed</td><td>355-25-9 (n° CAS)</td><td>http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/</td></tr><tr><td>DB-338 Amalgamateurs&nbsp ;</td><td>COXO</td><td></td><td>https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/</td></tr> <tr><td>stéarate de polyoxyéthylène 40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3440-250G (SKU)</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&region=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB</td></tr><tr><td>Q125 Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110 (Ref.)</td><td>https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r</td></tr><tr><td>Preparation of Primarty T Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>autoMACs running buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221 (N° de commande)</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref</td></tr><tr><td>Kit d’isolement de cellules Pan T, humain (cocktail d’anticorps à la biotine Pan T-Cell & Pan T-Cell MicroBead Cocktail)&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-535 (N° de commande)</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535</td></tr><tr><td>trieur de cellules magnétiques (autoMACS Pro Separator)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545 (N° de commande)</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545</td></tr><tr><td>Préparation de cellules cancéreuses du poumon A549</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kit de dosage du tréhalose&nbsp ;</td><td>Megazyme</td><td>K-TREH (Cat. Non.)</td><td>https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit</td></tr><tr><td>Bleu de trypan (0,4 % en solution aqueuse Prêt à l’emploi, stérile)</td><td>VWR</td><td>97063-702 (Cat. Non.)</td><td>https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile</td></tr></tbody></table>

assemblage et fonctionnement d’un dispositif acoustofluidique pour une administration améliorée de composés moléculaires aux cellules

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

L’administration intracellulaire efficace de biomolécules est nécessaire pour un large éventail de recherches biomédicales et d’applications thérapeutiques cellulaires. la sonoporation Ultrason-négociée est une technique émergente pour la livraison intracellulaire rapide des biomolécules. La sonoporation se produit lorsque la cavitation de microbulles remplies de gaz forme des pores transitoires dans les membranes cellulaires voisines, ce qui permet une absorption rapide des biomolécules du fluide environnant. Les techniques actuelles de sonoporation in vitro des cellules en suspension sont limitées par un débit lent, une variabilité des conditions d’exposition aux ultrasons pour chaque cellule et un coût élevé. Pour remédier à ces limitations, un dispositif acoustofluidique à faible coût a été développé qui intègre un transducteur à ultrasons dans un dispositif fluidique à base de PDMS pour induire une sonoporation cohérente des cellules lorsqu’elles circulent à travers les canaux en combinaison avec des agents de contraste à ultrasons. L’appareil est fabriqué à l’aide de techniques de photolithographie standard pour produire la puce fluidique à base de PDMS. Un transducteur de disque piézo-ultrasonore est fixé à l’appareil et piloté par un microcontrôleur. L’assemblage peut être intégré à l’intérieur d’un boîtier imprimé en 3D pour une protection supplémentaire. Les cellules et les microbulles sont poussées à travers l’appareil à l’aide d’une pompe à seringue ou d’une pompe péristaltique connectée à un tube en PVC. L’administration améliorée des biomolécules aux lymphocytes T humains et aux cellules cancéreuses du poumon est démontrée avec ce système acoustofluidique. Comparé aux approches de traitement en vrac, ce système acoustofluidique augmente le débit et réduit la variabilité, ce qui peut améliorer les méthodes de traitement cellulaire pour les applications de recherche biomédicale et la fabrication de thérapies cellulaires.

Une image du système acoustofluidique assemblé à l’intérieur d’un boîtier imprimé en 3D est illustrée à la figure 1. Ce protocole produit un système acoustofluidic qui peut être employé pour augmenter la livraison moléculaire intracellulaire dans des variétés de cellule multiples utilisant des agents de contraste d’ultrason.
Graphique 2   démontre l’administration intracellulaire augmentée d’un composé fluorescent, fl...

Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un dispositif acoustofluidic à faible coût pour la livraison moléculaire rapide aux cellules par l’intermédiaire du sonoporation induit par des agents de contraste d’ultrason.

Assemblage et fonctionnement d’un dispositif acoustofluidique pour une administration améliorée de composés moléculaires aux cellules

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un système acoustofluidique capable de fournir efficacement des biomolécules pour une variété de recherches et d’applications thérapeutiques cellulaires. Le principal avantage de ce système est qu’il permet l’administration rapide de biomolécules aux cellules tout en maintenant leur viabilité. Il s’agit d’une technologie de plateforme qui permet de transformer les cellules pour une variété d’applications thérapeutiques cellulaires, telles que le traitement du cancer.Commencez par combiner 54 grammes de base PDMS et six grammes d’agent de durcissement dans une tasse. Mélanger vigoureusement et soigneusement avec une spatule pendant au moins une minute, puis placer la tasse avec la solution PDMS dans un desséchér pendant environ 30 minutes ou jusqu’à ce que les bulles d’air résiduelles soient éliminées. Placez une plaquette revêtue de photorésine avec les motifs orientés vers le haut dans une boîte de Petri de 150 millimètres, puis versez la solution PDMS sur le moule.Si nécessaire, placez la boîte de Petri à l’intérieur d’un dessicateur et appliquez du vide jusqu’à ce que les bulles d’air résiduelles disparaissent. Transférer la boîte de Pétri dans un four de laboratoire et cuire pendant deux heures à 60 degrés Celsius pour durcir le PDMS. Après durcissement, retirez soigneusement le PDMS de la boîte de Pétri en coupant sur les bords de la plaquette avec une lame de rasoir.Découpez chaque appareil individuel à l’aide d’un couteau ou d’une lame de rasoir, puis percez des trous à travers les orifices d’entrée et de sortie à l’aide d’un poinçon de biopsie de 2,5 millimètres. Après avoir traité le dispositif PDMS avec du plasma d’oxygène, placez immédiatement chaque appareil sur une lame de microscope en verre de chaux soude propre avec des canaux faisant face à la surface du verre. Laissez les appareils se lier pendant la nuit à température ambiante.Appliquez doucement du silicone sur la surface du transducteur piézo-piézo d’un centimètre de diamètre à une épaisseur d’un à deux millimètres, puis alignez soigneusement le transducteur avec une spirale concentrique et appuyez doucement sur le fond de la lame du microscope en verre. Connectez un microcontrôleur à un ordinateur à l’aide d’un câble USB A vers B. Un voyants LED d’alimentation verte devrait s’allumer.Utilisez le logiciel associé sur l’ordinateur pour télécharger un programme qui génère un signal de huit mégahertz. Souder un fil d’un pouce de calibre 22 à l’extrémité de chaque fil sur le transducteur PZT. Ensuite, utilisez-le pour connecter le fil de borne négatif du transducteur PZT à une broche GND.Connectez le fil de borne positif du transducteur PZT à la broche de sortie via le fil soudé. Coupez des sections de trois à six pouces de tubes en plastique souple tygon PVC et poussez le tube dans les ports d’entrée et de sortie. Il peut être nécessaire de faire pivoter le tube tout en appliquant une pression jusqu’à ce qu’il s’adapte à l’ouverture.Si vous le souhaitez, du colle peut être appliqué à la jonction pour lier le PDMS et le tube ensemble. En option, montez le dispositif acoustofluidique et le microcontrôleur dans un boîtier imprimé en 3D. Assemblez le réservoir microfluidique conformément aux instructions du fabricant.Coupez une section de trois à six pouces de tube en plastique souple tygon PVC de diamètre intérieur de 1/16 de pouce et poussez-la sur le tube de diamètre intérieur de 1/32 pouce à partir de la sortie du réservoir microfluidique. Si vous le souhaitez, enroulez la jonction avec un film de paraffine pour éviter les fuites. Remplissez une seringue de 60 millilitres avec de l’air ambiant sur le côté du réservoir microfluidique.Réglez la pompe à seringue à un débit de 200 millilitres par heure pour pousser les solutions d’agent de contraste à travers le dispositif acoustofluidique à un débit volumétrique de 50 millilitres par heure et prélever les échantillons de la sortie de l’appareil dans un tube de centrifugation de 50 millilitres. Préparer une solution de phphopholipide dans un flacon de scintillation de 20 millilitres en ajoutant 25 milligrammes de DSPC, 11,6 milligrammes de DSEPC, 0,26 milligramme de DSPG et 0,88 milligramme de stéarate de polyoxyéthylène40. Ajouter le chloroforme jusqu’à ce que tous les phospholipides soient dissous.Évaporer le chloroforme dans un dessicateur pendant 48 heures pour former un film lipidique sec. Réhydratez la mousse avec 10 millilitres de PBS stérile, puis soniquez la solution lipidique pendant trois minutes à 40% d’amplitude pour former une solution micellaire cationique. Après sonication, la solution de phphopholipide peut être conservée à deux à six degrés Celsius jusqu’à un mois.Pour préparer des agents de contraste à ultrasons, ajouter 200 microlitres de solution micellaire cationique dans 600 microlitres de PBS stérile à un flacon de septum en verre à deux millilitres. Scellez le flacon en sertissant le capuchon. Utilisez une aiguille de calibre 20 de 1,5 pouce pour remplir l’espace de tête du flacon avec du décafluorobutane gazeux pendant 30 secondes.Amalgamer le flacon pour former des agents de contraste à ultrasons remplis de perfluorobutane remplis de gaz. Ajouter 25 microlitres de solution d’agent de contraste à ultrasons par millilitre de solution cellulaire. Ensuite, pompez immédiatement l’agent de contraste combiné et le mélange cellulaire à travers le dispositif acoustofluidique.Ce protocole produit un système acoustofluidic qui peut être employé pour augmenter la livraison moléculaire intracellulaire dans des variétés de cellule multiples. La livraison intracellulaire d’un composé fluorescent, fluorescéine, aux cellules de T humaines primaires a été améliorée avec le traitement acoustofluidic comparé à un groupe témoin non traité. L’intensité de fluorescence des cellules de T a augmenté de cinq fois après traitement, indiquant la livraison augmentée de fluorescéine.La viabilité de cellules a diminué légèrement après un traitement acoustofluidic, mais est demeurée au-dessus de 80% Le traitement acoustofluidic a augmenté la livraison intracellulaire d’un trehalose composé conservateur aux cellules humaines de carcinome de poumon A549 comparées à l’écoulement seul et aux cellules dans le groupe témoin non traité. L’ajout des microbulles cationiques à la solution cellulaire est essentiel. L’administration intracellulaire de biomolécules sera limitée sans microbulles cationiques en solution.Cette plateforme permet l’administration intracellulaire de diverses biomolécules, qui peuvent altérer la fonction cellulaire à des fins de recherche ou thérapeutiques. Après avoir terminé cette procédure, une caractérisation cellulaire supplémentaire peut être effectuée pour évaluer l’impact de l’administration de diverses biomolécules.

assembly-operation-an-acoustofluidic-device-for-enhanced-delivery

Research

Recherche

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Nous décrivons un protocole pour la fabrication de dispositifs microfluidiques qui peut permettre la capture cellulaire et de culture. Dans cette approche microstructures motifs tels que des rainures dans les canaux microfluidiques sont utilisés pour créer les régions à faible contrainte de cisaillement dans lequel la cellule peut quai.

Un dispositif microfluidique avec des modèles Groove pour étudier le comportement cellulaire

Dans cet article, nous décrivons comment nous obtenons FRET traces de molécules individuelles d'ADN immobilisés sur une surface en utilisant un microscope confocal à balayage automatisé.

Système automatisé pour les simples mesures de fluorescence de la molécule de surface immobilisée Biomolécules

Dans ce protocole, nous démontrons la fabrication d'un tableau de messages microactionneur déplacé verticalement sur lequel la technologie est basée, et comment cette technologie de base peut être modifié pour mener à haut débit de culture de cellules mécanique dynamique dans la culture à la fois à deux dimensions et en trois dimensions paradigmes.

Plates-formes pour la culture cellulaire microfabriqués mécanique dynamique

Source : Choi, H. J., et al. Acoustophorèse microfluidique pour la séparation par écoulement continu de bactéries à Gram négatif à l’aide de billes d’affinité d’aptamères. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo montre la méthode de séparation sélective des bactéries à Gram négatif d’un échantillon bactérien mixte à l’aide de microbilles enrobées d’aptamères et de forces acoustiques à l’intérieur d’une puce microfluidique.

Acoustophorèse assistée par aptamère pour la séparation microfluidique de bactéries à Gram négatif

Dans cette vidéo, nous décrivons d'abord les procédures de fabrication et d'exploitation d'une onde acoustique de surface (SAW) de l'appareil à contre-courant de l'acoustique. Nous démontrons ensuite un dispositif expérimental qui permet à la fois la visualisation des écoulements analyse qualitative et quantitative des flux complexes dans le dispositif de pompage SAW.

Fabrication, l&#39;exploitation et la visualisation des écoulements en surface à ondes acoustiques axées microfluidique-Acoustiques contre-courant

Nous avons développé une culture de cellules automatisé et plate-forme d'interrogation pour les expériences de stimulation cellulaire micro-échelle. La plate-forme offre un contrôle simple, polyvalent et précis dans la culture et la stimulation de petites populations de cellules, et la récupération de lysats pour les analyses moléculaires. La plate-forme est bien adapté aux études qui utilisent des cellules précieux et / ou des réactifs.

Une plate-forme automatisée polyvalent pour micro-échelle expériences de stimulation cellulaire

Déformation mécanique rapide des cellules a émergé comme une méthode prometteuse, indemne de vecteurs pour la délivrance intracellulaire de macromolécules et des nanomatériaux. Ce protocole fournit des instructions détaillées sur la façon d'utiliser le système pour une large gamme d'applications.

Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

Nous démontrons un dosage à base de microfluidique pour mesurer les délais pour les cellules de transiter par une séquence d'étranglements l'échelle du micron.

Une technique microfluidique à la sonde cellulaire Déformabilité

Ce protocole décrit une architecture système permettant d’effectuer des séparations automatisées de particules de petits volumes (0,15 à 1,5 ml) à l’aide d’un dispositif microfluidique, et discute des méthodes permettant d’optimiser les performances et le fonctionnement d’un dispositif acoustofluidique.

Une plate-forme microfluidique pour le traitement de précision de petit volume échantillon et son utilisation pour Taille séparer les particules biologiques avec un Microdevice acoustique

dispositifs Acoustofluidic utilisent des ondes ultrasonores dans les canaux microfluidiques pour manipuler, se concentrer et d'isoler micro suspendu et entités nanoscopiques. Ce protocole décrit la fabrication et le fonctionnement d'un tel dispositif de support des ondes stationnaires acoustiques de volume pour se concentrer des particules dans une ligne de courant central sans l'aide de fluides de gaine.

Fabrication et fonctionnement de Acoustofluidic Dispositifs de support en vrac ondes acoustiques permanents pour introducteur Mise au point des particules

Les sphéroïdes cellulaires ont été considérés comme un modèle potentiel dans le domaine des applications biologiques. Cet article décrit les protocoles permettant de générer de manière évolutive des sphéroïdes cellulaires à l’aide d’un dispositif d’assemblage acoustique 3D, qui fournit une méthode efficace pour la fabrication robuste et rapide de sphéroïdes cellulaires uniformes.

Dispositif d’assemblage acoustique tridimensionnel pour la fabrication en série de sphéroïdes cellulaires

Apprenez l'assemblage d'un dispositif acoustofluidique pour la livraison rapide de biomolécules aux cellules en maintenant leur viabilité. Cette méthode ouvre des perspectives pour les thérapies cellulaires.

Assemblage et fonctionnement d’un dispositif acoustofluidique pour une administration améliorée de composés moléculaires aux cellules (Vidéo) | JoVE Journal

Assemblage et fonctionnement d’un dispositif acoustofluidique pour une administration améliorée de composés moléculaires aux cellules

Explorer plus de vidéos