Microscopie électronique à balayage par blocs série (SBF-SEM) d’échantillons de tissus biologiques

La microscopie électronique périodique de balayage de bloc-visage fournit une vue sans précédent des structures ultra tridimensionnelles de tissu, et peut répondre à une foule de questions précédemment impossibles ou excessivement difficiles à poursuivre. Cette technique permet la production rapide et reproductible de jeux de données tridimensionnels avec une charge tissulaire et des artefacts minimaux. Et surtout, il permet la capture automatisée de milliers d’images par jour.

La microscopie électronique à transmission standard fournit une excellente structure ultra cellulaire. Cependant, ces images manquent de contexte tridimensionnel et peuvent être difficiles à interpréter. La microscopie électronique à balayage de bloc-face série fournit ce contexte tridimensionnel, permettant l’interprétation de processus complexes.

Bien que ce protocole soit fiable et reproductible, certaines étapes nécessitent de la précision et sont d’une importance cruciale pour le succès de cette méthodologie. Cette vidéo démontrera ces étapes critiques en détail. Après avoir fixé des échantillons dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 molaire, contenant 2,5 % de glutaraldéhyde, et deux chlorures de calcium millimolaires, les échantillons doivent être coupés en blocs ne dépassant pas deux millimètres cubes et lavés avec un tampon de cacodylate de sodium molaire 0,1 contenant deux chlorures de calcium millimolaires.

Le tissu est ensuite coloré séquentiellement avec du ferrocyanure d’osmium, du thiocarbohydrazide et du tétroxyde d’osmium. Après incubation du tétroxyde d’osmium, traiter le tissu avec de l’acétate d’uranyle aqueux à 1% à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, dissoudre 0,066 gramme de nitrate de plomb dans 10 millilitres de solution d’acide aspartique molaire à 0,03 et utiliser un hydroxyde de potassium normal pour ajuster le pH de la solution d’aspartate de plomb de Walton à 5,5.

Après avoir réchauffé la solution au four, lavez le tissu cinq fois pendant trois minutes par lavage à température ambiante, à l’eau doublement distillée, avant de transférer le tissu dans une solution d’aspartate de plomb de Walton réchauffée à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez le tissu et déshydratez-le dans une série ascendante d’acétone glacée, suivie d’une incubation de 10 minutes dans de l’acétone à température ambiante. Placez ensuite le tissu dans un rapport 1:3 de résine dure mélangée dans l’acétone pendant quatre heures d’infiltration sur une plate-forme rotative, suivie d’une infiltration de huit heures ou de nuit dans un rapport 1:1 de résine à solution d’acétone sur une plate-forme rotative, puis d’une infiltration pendant la nuit dans un rapport 3:1 de résine à l’acétone sur la plate-forme rotative.

Le lendemain matin, infiltrez le tissu dans de la résine fraîche à 100% pendant une infiltration de quatre à huit heures, une pendant une nuit et une infiltration de quatre heures à température ambiante sur une plate-forme rotative. Le lendemain matin, utilisez un bâton en bois pour mélanger une petite quantité de résine avec de la poudre de noir de carbone jusqu’à ce que la résine soit saturée de poudre, mais reste fluide et ne devienne pas granuleuse. La résidence doit ressembler à de l’encre épaisse et pouvoir s’égoutter lentement sans touffes visibles Placer l’échantillon de tissu dans un moule en caoutchouc de silicone et capturer une image pour référence ultérieure de l’orientation de l’échantillon dans le bloc de résine.

Lorsque l’échantillon est en place, couvrir le tissu dans la résine saturée de noir de carbone à l’extrémité du moule en silicone, avec l’étiquette indiquant les détails expérimentaux et tissulaires dans le moule à l’extrémité opposée de la résine. Ensuite, placez le moule dans un four à 65 degrés Celsius à une inclinaison d’environ une heure. Lorsque la résine infusée au noir de carbone a suffisamment durci, retirez le moule du four et commencez par un puits vide, remplissez le reste du moule avec de la résine claire, en prenant soin que l’étiquette reste visible.

Lorsque l’échantillon a été recouvert de résine transparente, replacez le moule en silicone dans le four à 65 degrés Celsius, et non sur une pente, pendant 48 heures, puis retirez le moule. Pour préparer le bloc pour l’imagerie, placez l’échantillon en résine incorporé sur un mandrin à microtome dont l’extrémité conique colle à environ cinq à six millimètres du mandrin. Verrouillez l’échantillon en place avec la vis de réglage et placez l’échantillon sous une lampe chauffante.

Après plusieurs minutes, placez le mandrin dans un support de stéréomicroscope et utilisez une nouvelle lame de rasoir à double tranchant pour créer de fines sections parallèles à la face du bloc jusqu’à ce que le tissu soit visible, ce qui sera moins réfléchissant et granulaire par rapport aux parties de la résine dépourvues de tissu. Fixez une goupille d’échantillon en aluminium dans le support de goupille de coupe et faites plusieurs rayures profondes et entrecroisantes à la face de la goupille pour fournir une plus grande surface pour la colle utilisée pour maintenir l’échantillon en place. Placez l’échantillon sous une lampe chauffante et poussez le rasoir d’un à deux millimètres directement dans le bloc de résine avant de faire une deuxième coupe perpendiculaire de profondeur égale dans le bloc, pour couper l’excès de résine de l’échantillon de tissu de sorte que le bloc mesure environ trois millimètres de diamètre par deux à trois millimètres de hauteur.

Après cette coupe initiale, réchauffez à nouveau le bloc sous la lampe chauffante et utilisez une nouvelle lame de rasoir à double tranchant pour couper le haut du bloc de résine à environ un millimètre en dessous de la partie coupée en une seule coupe lisse. Placez le support de goupille de coupe, contenant la goupille en aluminium coupée, dans le réceptacle de stéréomicroscope, et appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate sur la face de la goupille de sorte qu’elle recouvre complètement la goupille sans former de ménisque visible. Utilisez une pince pour appuyer sur le morceau de bloc de tissu taillé sur le centre de la face de la goupille de l’échantillon pendant plusieurs secondes et laissez la colle se fixer pendant plusieurs minutes.

Lorsque la colle a bien séché, localisez le tissu sur la partie surélevée du bloc de résine et utilisez un rasoir à double tranchant pour couper la partie surélevée de la résine contenant l’échantillon de tissu à une zone ne dépassant pas un millimètre carré. Lentement et soigneusement, retirez autant de résine excédentaire que possible, en laissant le bloc légèrement plus long dans une dimension, et utilisez une lime métallique finale pour incliner l’excès de résine dans la zone à l’extérieur de la partie surélevée contenant l’échantillon de tissu vers le bas vers le bord de la goupille. Enlevez les particules de résine et la poussière de l’échantillon préparé avant d’appliquer une fine couche de peinture argentée et de pulvérisation d’or sur toute la surface du bloc d’échantillonnage.

Après le revêtement, coupez tout excès de peinture argentée des surfaces de face du bloc et placez le bloc monté et garni à l’extrémité bulbeuse d’un tube de pipette de transfert sur mesure avec l’étiquette appropriée attachée. Utilisant la formation image SBF-SEM, un réseau de paquets sans élastine de microfibrille ont été identifiés dans la cornée adulte de souris. Ce réseau est organisé en couches distinctes, avec les fibres étroitement associées aux kératocytes, se trouvent même dans des invaginations peu profondes à la surface des kératocytes.

L’application de ce protocole a mené à la découverte d’une population précédemment inconnue des nerfs cornéens centraux qui fusionnent avec les cellules épithéliales basiques à la frontière stromal-épithéliale. La formation image de SBF-SEM de la cornée centrale indique la présence de la vascularisation limbal, des paquets de nerf, et des cellules associées qui peuvent être manuellement segmentées pour la reconstruction 3D. Certains pièges de cette procédure d’imagerie incluent l’utilisation d’un temps d’arrêt de pixel trop long, ce qui peut entraîner des images ultérieures ondulées et déformées, de petites décharges d’électrons de la face de bloc, conduisant à des changements de contraste rapides dans les lignes, des rayures de couteau sur la face de bloc en raison d’un couteau endommagé ou une accumulation de débris sur le bord du couteau , les artefacts d’un faisceau d’électrons étendu se concentrent sur la face de bloc alors que l’échantillon est encore dans la chambre d’imagerie, une fixation incorrecte des tissus, conduisant à la séparation des structures cellulaires et du tissu conjonctif, et un saut d’image à la suite d’une grande quantité de charge dans le bloc de tissu ou de résine.

Lors de la coupe du bloc de tissu, il est important d’avoir une bonne compréhension de l’endroit où se trouve le tissu dans le bloc, Afin de ne pas couper accidentellement les régions d’échantillon importantes. Si des images à plus haute résolution de structures cellulaires ou d’interactions spécifiques sont souhaitées, l’imagerie peut être arrêtée, le bloc retiré du microscope et des sections coupées sur un ultramicrotome où elles peuvent être visualisées dans un microscope électronique à transmission La microscopie électronique à balayage de bloc de série permet une vue tout à fait unique des tissus biologiques. Grâce à ce protocole, nous avons pu acquérir rapidement des ensembles de données de qualité et élargir la gamme de tissus que nous pouvons explorer.