Name: Réponse cardiaque à la stimulation β-adrénergique déterminée par l’analyse de la boucle pression-volume (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Découvrez l'analyse des boucles pression-volume cardiaques chez la souris pour évaluer la fonction cardiaque intrinsèque et la réserve bêta-adrénergique. Cette méthode à thorax ouvert permet des mesures précises in vivo.

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Nous remercions Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter et l’équipe de l’Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung (IBF) de l’Université de Heidelberg pour leur assistance technique experte.
Ce travail a été soutenu par le DZHK (Centre allemand pour la recherche cardiovasculaire), le BMBF (ministère allemand de l’Éducation et de la Recherche), un fonds d’innovation de l’État fédéral du Bade-Wurtemberg et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) Project-ID 239283807 - TRR 152, FOR 2289 et le Centre de recherche collaborative (SFB) 1118.

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées et réalisées conformément aux règlements du Conseil régional de Karlsruhe et de l’Université de Heidelberg (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) conformément aux directives de la directive 2010/63/UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Les données présentées dans ce protocole proviennent de souris mâles sauvages de type C57Bl6/N (âgées de 17 ± 1,4 semaine). Les souris ont été maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes à l’animalerie (IBF) de la faculté de médecine de Heidelberg. Les souris ont été logées dans un cycle lumière-obscurité de 12 heures, avec une humidité relative comprise entre 56 et 60%, un changement d’air 15 fois par heure et une température ambiante de 22 ° C + / - 2 ° C. Ils étaient conservés dans des cages conventionnelles de type II ou de type II, longtemps munies de litière pour animaux et de papiers de soie comme enrichissement. Des aliments autoclavés standard et de l’eau autoclavée étaient disponibles pour être consommés ad libitum.
1. Préparation d’instruments et de solutions médicamenteuses
<ol><li>Cathéter veineux central: Coupez le microtube (diamètre extérieur de 0,6 mm) en tubes de cathéter d’environ 20 cm de long. Utilisez une pince pour tirer une extrémité du tube sur l’extrémité d’une canule de calibre 23. Coupez l’autre extrémité du tube en diagonale pour créer une pointe pointue qui peut percer la veine fémorale.</li>
	<li>Tube endotrachéal: Pour un tube d’intubation, coupez une canule de ponction veineuse de calibre 20 de 3 cm de long pour retirer la fixation de la seringue.<ol>
<li>Si le tube d’intubation ne s’adapte pas parfaitement au raccord du ventilateur, enroulez le parafilm sur l’extrémité du tube où le dispositif de ventilation est connecté. La connexion doit être stable et scellée par l’épaississement (Figure 1A). Raccourcissez la broche de guidage métallique de la canule de ponction veineuse de calibre 20 à 2,7 cm et utilisez-la comme aide à l’intubation. Des approches affinées pour l’intubation, y compris des fibres légères pour faciliter la visualisation de la trachée, sont également bien décrites, par exemple par Das et ses collaborateurs16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mélange anesthésique utilisé pour l’intubation : Mélanger 200 μL d’héparine (1000 UI/mL) avec 50 μL de NaCl à 0,9 % et 750 μL d’étomidate de 2 mg/mL provenant d’un produit à base d’émulsion huile-dans-eau. Utiliser 7 μL/g de poids corporel (PSB) pour chaque souris (0,1 mg/kg de buprénorphine p.c. 10 mg/kg d’étomidate de p.c.).</li>
	<li>Relaxant musculaire : Dissoudre 100 mg de bromure de pancuronium dans 100 mL de NaCl à 0,9 %. Utiliser 1,0 μL/g de poids corporel (1 mg/kg p.c.) pour chaque souris.</li>
	<li>Solutions d’isoprotérénol : Dissoudre 100 mg d’isoprotérénol dans 100 mL de NaCl à 0,9 % (1 μg/μL). Préparer les dilutions suivantes (Tableau 1) et transférer chacune dans une seringue de 1 mL.<ol>
<li>Pour obtenir la dilution 1, diluer le stock 1:1.8. Pour obtenir la dilution 2, diluer le stock 1:6. Pour obtenir la dilution 3, diluer la dilution 1 en 1:10. Enfin, obtenir la dilution 4 par une dilution 1:10 de la dilution 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NaCl hypertonique à 15 % (p/v) : Dissoudre 1,5 g de NaCl à 0,9 % dans 10 mL deH2O double distillé. Filtrer la solution à l’aide d’un filtre à seringue à pores de 0,45 μm.</li>
	<li>Préparation d’une solution d’albumine à 12,5 % (p/v) : Dissoudre 1,25 g d’albumine sérique bovine dans 10 mL de NaCl à 0,9 %. Incuber la solution à 37 °C pendant 30 min. Refroidir à température ambiante et filtrer la solution avec un filtre à seringue à pores de 0,45 μm.</li>
	<li>Préparation de l’installation: Allumez d’abord la plaque chauffante et réglez-la à 39-40 ° C. Placez une seringue remplie de solution saline sur le coussin chauffant et transférez le cathéter à boucle pression-volume (PVL) dans la seringue. Pré-incuber le cathéter pendant au moins 30 minutes avant utilisation pour la stabilisation. La configuration que nous utilisons se compose d’un cathéter de conductance de pression de 1,4 F, d’une unité de commande et du logiciel correspondant, et elle est décrite graphiquement sur la figure 1B et les références du fournisseur sont répertoriées dans la table des matériaux.</li>
</ol>2. Anesthésie
<ol><li>Injecter de la buprénorphine (0,1 mg/kg p.C. par voie intrapéritonéale) 30 min avant l’intubation.</li>
	<li>Placez la souris dans une chambre en verre acrylique pré-saturée de 2,5% d’isoflurane et préchauffée avec un coussin chauffant placé à la base de la chambre.</li>
	<li>Dès que la souris dort (absence de réflexe), injecter le mélange anesthésique (7 mL/kg p.c.) contenant 10 mg/kg d’étomidate et de l’héparine (1 200 UI/kg p.c.) par voie intrapéritonéale.</li>
</ol>3. Ventilation
<ol><li>Transférer l’animal sur la plate-forme d’intubation (Figure 1C) 3-4 minutes après l’injection anesthésique. La souris est suspendue aux dents avec la vue dorsale face à l’opérateur.</li>
	<li>Soulevez doucement la langue avec une pince. Pour identifier la glotte, soulevez légèrement la mâchoire inférieure de la souris avec une deuxième pince.</li>
	<li>Insérez soigneusement le tube endotrachéal (Figure 1A) dans la trachée et retirez la tige guide.</li>
	<li>Transférez l’animal sur la plaque chauffante, placez-le à l’arrière et connectez le tube d’intubation au respirateur pour petit animal.</li>
	<li>Ajuster la fréquence respiratoire à 53,5 x (poids corporel en grammes)-0,26 [min-1], comme décrit par d’autres12, et les volumes courants aux pressions inspiratoires maximales de 11 ± 1 cmH2O. Établissez un PEEP de 2 cmH2O.</li>
	<li>Fixez soigneusement les extrémités de la souris sur la plaque chauffante avec des bandes adhésives et appliquez une pommade pour les yeux sur les deux yeux pour éviter la sécheresse.</li>
	<li>Insérez une sonde de température rectale et maintenez la température corporelle centrale à 37 ± 0,2 °C.</li>
	<li>Installez un ECG à 1 dérivation et surveillez la fréquence cardiaque en ligne comme indicateur de la profondeur et de la stabilité de l’anesthésie.</li>
	<li>En l’absence de réflexes interdigitaux, injecter 1 mg/kg de poids corporel du relaxant musculaire pancuronium-bromure par voie intrapéritonéale. Cela empêche les artefacts respiratoires lors des mesures PVL.</li>
</ol>4. Chirurgie
<ol><li>Recommandations générales<ol>
<li>Pendant la chirurgie, ventiler avec ~ 1,5-2% d’isoflurane vaporisé avec O2. La concentration d’isoflurane peut également dépendre de variables telles que la souche de souris, le sexe, l’âge et le poids des animaux, mais elle doit être déterminée individuellement et expérimentalement et les valeurs ici sont des références pour la souche de souris C57BL6 / N. Il est important de noter que le ventilateur est connecté à un système d’extraction pour empêcher l’opérateur d’inhaler de l’isoflurane.</li>
		<li>Utilisez un grossissement entre 1,5 et 4x du stéréomicroscope pour les interventions chirurgicales. REMARQUE : Se référer aux directives institutionnelles/locales sur la préparation de l’animal pour les chirurgies non liées à la survie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Canulation fémorale<ol>
<li>Rincez le membre postérieur avec de l’éthanol à 70%, incissez la région inguinale gauche et exposez la veine fémorale gauche.</li>
		<li>Souffler l’artère épigastrique et la veine avec une cautérisation.</li>
		<li>Ligaturez la veine fémorale avec une suture placée distale à l’accès au cathéter.</li>
		<li>Passez une suture sous la veine fémorale et préparez un nœud crânien du site de ponction. Perforez la veine fémorale avec le microtube préparé (voir étape 1.1) attaché à une seringue de 1 mL.</li>
		<li>Attachez le nœud pour fixer le tube à l’intérieur du récipient.</li>
		<li>Contrer la perte de liquide par la perfusion de NaCl à 0,9% complété par 12,5% d’albumine à un débit de perfusion de 15 μL / min avec une pompe à seringue automatique. De plus, gardez les tissus exposés humides en utilisant du NaCl préchauffé à 0,9%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Thoracotomie<ol>
<li>Rincez le thorax avec de l’éthanol à 70%.</li>
		<li>Inciser la peau juste en dessous du processus xyphoïde et séparer brutalement les muscles pectoraux de la paroi thoracique avec une pince ou une cautérisation.</li>
		<li>Soulevez le processus xyphoïde avec une pince, puis coupez à travers la paroi thoracique en se déplaçant latéralement des deux côtés avec une cautérisation jusqu’à ce que le diaphragme soit entièrement visible par en dessous.</li>
		<li>Inciser le diaphragme par le dessous et exposer l’apex cardiaque. Ensuite, retirez soigneusement le péricarde avec une pince.</li>
		<li>Effectuez une costotomie limitée sur le côté gauche comme décrit précédemment6.</li>
		<li>Passez une suture sous la veine cavale inférieure pour effectuer une réduction de la précharge au cours des étapes ultérieures.</li>
		<li>Perforez doucement l’apex cardiaque avec une canule de calibre 25 (maximum 4 mm). Retirez la canule et insérez le cathéter PV jusqu’à ce que toutes les électrodes soient dans le ventricule.</li>
		<li>Ajuster la position du cathéter par des mouvements doux et des virages jusqu’à ce que des boucles de forme rectangulaire soient obtenues (Figure 2A).</li>
		<li>Gardez toujours tous les tissus exposés humides en utilisant du NaCl préchauffé à 0,9%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Mesures
<ol><li>Recommandations générales<ol>
<li>Pendant les mesures, ventilez avec ~ 1,5-2% d’isoflurane vaporisé avec 100% O2.
</li>
		<li>Effectuer 2 mesures de base ainsi que 2 occlusions de la veine cave à chaque étape du protocole dose-réponse. REMARQUE: Il est important qu’après la première et la deuxième occlusion de la veine cave, les valeurs de pression et de volume reviennent aux valeurs à l’état d’équilibre comme avant la première occlusion. Cette observation est nécessaire pour reconnaître un changement de position du cathéter dû à des réductions en série du volume intraventriculaire. Si un changement de position du cathéter était le cas, les valeurs de volume en particulier seraient décalées.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer une analyse en ligne des paramètres (fréquence cardiaque, volume de l’AVC, dP/dtmax)et attendre que la fonction cardiaque à l’état d’équilibre soit obtenue. Pour la plage de paramètres attendue avec le paramètre utilisé ici chez les souris C57Bl6/N, veuillez vous référer aux résultats publiés6.</li>
	<li>Arrêtez le respirateur en position expiratoire et enregistrez les paramètres de base. Après 3 à 5 secondes, réduire la précharge cardiaque en soulevant la suture sous la veine cavale inférieure avec une pince afin d’obtenir des paramètres indépendants de la précharge(Figure 2B). Allumez le ventilateur. Attendez au moins 30 secondes pour la deuxième occlusion jusqu’à ce que les paramètres hémodynamiques soient stabilisés.</li>
	<li>Après avoir obtenu les mesures dans des conditions basales, procédez à la dose-réponse de l’isoprotérénol en passant aux seringues préparées. Ici, le débit de perfusion reste inchangé afin d’éviter des modifications de la précharge cardiaque. Veillez à ne pas infuser de bulles d’air lors du changement de seringue.<ol>
<li>Attendez au moins 2 minutes jusqu’à ce qu’une nouvelle fonction cardiaque à l’état d’équilibre soit obtenue, puis arrêtez à nouveau le respirateur en position expiratoire et enregistrez les paramètres de base. Après 3 à 5 secondes, réduire la précharge cardiaque en soulevant la suture sous la veine cavale inférieure afin d’obtenir des paramètres indépendants de la précharge.</li>
		<li>Attendez au moins 30 secondes pour la deuxième occlusion. Ensuite, passez à la seringue préparée avec la prochaine concentration d’isoprotérénol et répétez les enregistrements des paramètres indépendants de la ligne de base et de la précharge. REMARQUE: Des artefacts tels que le pic de pression systolique terminale (ESPS, Figure 2C)peuvent se produire lors de l’augmentation de la dose d’isoprotérénol, qui résulte du piégeage du cathéter. Les artefacts qui se produisent avant le début des paramètres basaux peuvent être facilement corrigés via le repositionnement du cathéter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Étalonnage
REMARQUE: Les procédures d’étalonnage peuvent varier en fonction du système PVL utilisé.
<ol><li>Étalonnage de conductance parallèle<ol>
<li>Connectez une seringue contenant une solution de NaCl à 15 % à la canule fémorale après la dernière mesure de la dose-réponse à l’isoprotérénol. Infuser soigneusement 5 μL de la solution hypertonique restant dans le tube jusqu’à ce que le PVL se déplace légèrement vers la droite pendant la visualisation en ligne. Attendez ensuite que les boucles reviennent à l’état d’équilibre.</li>
		<li>Arrêtez le respirateur à la fin de l’expiration et injectez un bolus de 10 μL de NaCl à 15 % en 2 à 3 secondes. Vérifiez si les PVL s’élargissent largement et sont déplacés vers la droite lors de la visualisation en ligne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrage de la conductance au volume<ol>
<li>Attendez 5 min, pas moins, pour que le bolus salin hypertonique soit complètement dilué. Ensuite, retirez le cathéter et prélevez au moins 600 μL de sang du ventricule gauche du cœur battant à l’aide d’une seringue de 1 mL et d’une canule de calibre 21. À ce stade, l’animal est euthanasié sous anesthésie profonde et analgésie par saignement massif, en arrêtant la ventilation et l’ablation du cœur.</li>
		<li>Transférer le sang dans la cuvette d’étalonnage préchauffée (au bain-marie à 37 °C) avec des cylindres de volume connu. Placez le cathéter PV au centre de chaque cylindre et enregistrez la conductance. En calculant une courbe standard pour chaque animal, les unités de conductance peuvent être converties en valeurs de volume absolu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Analyse
<ol><li>Après des mesures PVL réussies dans des conditions basales et une stimulation isoprotérénol, visualisez, numérisez, calculez et extrayez les paramètres caractérisant la fonction cardiaque (comme PRSW, dP / dt, pression et volume diastoliques finaux, pression et volume systoliques finaux, constante de relaxation Tau, entre autres) à l’aide d’un logiciel d’analyse PVL approprié. D’autres analyses statistiques et représentations graphiques peuvent être effectuées avec un logiciel d’analyse standard.</li>
	<li>Analyse des paramètres indépendants de la précharge REMARQUE: Pour cette étape, il est crucial de normaliser la procédure.<ol>
<li>Sélectionnez les 5 à 6 premiers PVL montrant une précharge décroissante dans toutes les mesures pour l’analyse des paramètres indépendants de la précharge(Figure 2D). Un nombre constant de PVL sélectionnés pour l’analyse lors de la réduction de la précharge diminuera la variabilité entre les mesures des paramètres obtenus.</li>
		<li>Calculez la valeur moyenne des deux mesures à chaque étape du protocole.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Aucun conflit d’intérêts ne doit être déclaré.

Ici, nous fournissons un protocole pour analyser la fonction cardiaque in vivo chez les souris sous stimulation β-adrénergique croissante. La procédure peut être utilisée pour traiter à la fois les paramètres de base de la fonction cardiaque et la réserve adrénergique (par exemple, l’inotropie et la chronotropie) chez les souris génétiquement modifiées ou lors d’interventions. L’avantage le plus important des mesures en boucle pression-volume (PVL) par rapport à d’autres moyens de déterminer la fonction cardiaque est l’a...

Les maladies cardiovasculaires affectent généralement la fonction cardiaque. Ce numéro souligne l’importance d’évaluer in vivo la fonction cardiaque détaillée dans les modèles de maladies animales. L’expérimentation animale est entourée d’un cadre des trois principes directeurs Rs (3R) (Réduire/Affiner/Remplacer). En cas de compréhension de pathologies complexes impliquant des réponses systémiques (c’est-à-dire des maladies cardiovasculaires) au niveau de développement actuel, l’option principale consiste à affiner les méthodes disponibles. Le raffinage entraînera également une réduction du nombre d’animaux requis en raison de moins de variabilité, ce qui améliorera la puissance de l’analyse et des conclusions. En outre, la combinaison de mesures de contractilité cardiaque avec des modèles animaux de maladies cardiaques, y compris ceux induits par la stimulation neurohumorale ou par une surcharge de pression comme la bande aortique, qui imite par exemple les niveaux altérés de catécholamine / β-adrénergiques1,2,3,4,fournit une méthode puissante pour les études précliniques. Compte tenu du fait que la méthode par cathéter reste l’approche la plus largement utilisée pour l’évaluation approfondie de la contractilité cardiaque5,nous avons cherché à présenter ici une mesure affinée de la fonction cardiaque in vivo chez la souris par des mesures de boucle pression-volume (PVL) lors d’une stimulation β-adrénergique basée sur l’expérience antérieure incluant l’évaluation de paramètres spécifiques de cette approche6, 7.
Pour déterminer les paramètres hémodynamiques cardiaques, des approches comprenant des techniques d’imagerie ou de cathéter sont disponibles. Les deux options s’accompagnent d’avantages et d’inconvénients qui doivent être soigneusement pris en compte pour la question scientifique respective. Les approches d’imagerie comprennent l’échocardiographie et l’imagerie par résonance magnétique (IRM); les deux ont été utilisés avec succès chez la souris. Les mesures échocardiographiques impliquent des coûts initiaux élevés d’une sonde à grande vitesse nécessaire à la fréquence cardiaque élevée des souris; il s’agit d’une approche non invasive relativement simple, mais elle est variable parmi les opérateurs qui, idéalement, devraient être expérimentés dans la reconnaissance et la visualisation des structures cardiaques. De plus, aucune mesure de pression ne peut être effectuée directement et les calculs sont obtenus à partir d’une combinaison de grandeurs de taille et de mesures de débit. D’autre part, il présente l’avantage que plusieurs mesures peuvent être effectuées sur le même animal et que la fonction cardiaque peut être surveillée par exemple pendant la progression de la maladie. En ce qui concerne la mesure du volume, l’IRM est la procédure de référence, mais comme pour l’échocardiographie, aucune mesure de pression directe n’est possible et seuls les paramètres dépendants de la précharge peuvent être obtenus8. Les facteurs limitatifs sont également la disponibilité, l’effort d’analyse et les coûts d’exploitation. Ici, les méthodes basées sur des cathéters pour mesurer la fonction cardiaque sont une bonne alternative qui permet en outre la surveillance directe de la pression intracardiaque et la détermination de paramètres de contractilité indépendants de la charge comme le travail d’AVC recrutable précharge (PRSW)9. Cependant, les volumes ventriculaires mesurés par un cathéter pression-conductance (par détermination de la conductivité) sont plus petits que ceux de l’IRM mais les différences de groupe sont maintenues dans la même plage10. Afin de déterminer des valeurs de volume fiables, l’étalonnage correspondant est nécessaire, ce qui est une étape critique lors des mesures PVL. Il combine des mesures ex vivo de la conductivité sanguine dans des cuvettes étalonnées en volume (conversion de la conductance en volume) avec l’analyse in vivo de la conductance parallèle du myocarde lors de l’injection en bolus de la solution saline hypertonique11,12. Au-delà de cela, le positionnement du cathéter à l’intérieur du ventricule et l’orientation correcte des électrodes le long de l’axe longitudinal du ventricule sont essentiels pour la capacité de détection du champ électrique environnant produit par celles-ci. Toujours avec la taille réduite du cœur de la souris, il est possible d’éviter les artefacts produits par les changements d’orientation intraventriculaire du cathéter, même dans les ventricules dilatés5,10, mais les artefacts peuvent évoluer sous stimulation β-adrénergique6,13. En plus des méthodes de conductance, le développement de la méthode basée sur l’admission semblait éviter les étapes d’étalonnage, mais ici les valeurs de volume sont plutôt surestimées14,15.
Étant donné que la souris est l’un des modèles précliniques les plus importants de la recherche cardiovasculaire et que la réserve β-adrénergique du cœur est d’un intérêt central en physiologie et pathologie cardiaques, nous présentons ici un protocole affiné pour déterminer la fonction cardiaque in vivo chez la souris par des mesures PVL lors de la stimulation β-adrénergique.

<table><tbody><tr><td>1.4F SPR-839 cathéter</td><td>Millar Instruments, USA</td><td>840-8111</td><td></td></tr><tr><td>Seringues de 1 ml</td><td>Beckton Dickinson, USA</td><td>REF303172</td><td></td></tr><tr><td>Bio Amplifier</td><td>ADInstruments, USA</td><td>FE231</td><td></td></tr><tr><td>Bridge-Amplifier</td><td>ADInstruments, USA</td><td>FE221</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Roth, Allemagne</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de buprénorphine</td><td>Bayer, Allemagne</td><td>4007221026402</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette d’étalonnage</td><td>Millar, USA</td><td>910-1049</td><td></td></tr><tr><td>Transducteur de pression différentielle MPX</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Allemagne</td><td>Type 39912</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5/45</td><td>Fine Science tools Inc.</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #7B</td><td>Fine Science tools Inc.</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science tools Inc.</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>Ver. 8.3.0</td><td></td></tr><tr><td>EcoLab-PE-Micotube</td><td>Smiths, USA</td><td>004/310/168-1</td><td></td></tr><tr><td>Etomidate Lipuro</td><td>Braun, Allemagne</td><td>2064006</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Ratiopharm, Allemagne</td><td>R26881</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante et unité de commande</td><td>Labotec, Allemagne</td><td>Plaque chauffante 062</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter, Allemagne</td><td>HDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Vaporisateur Isofluran</td><td>Abbot</td><td>Vapor 19.3</td><td></td></tr><tr><td>Isoprenalinhydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>I5627</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène à alésage fin 0,61 mm OD, 0,28 mm ID</td><td>Smiths Medical International Ltd, UK</td><td>Ref. 800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>MiniVent ventilateur pour souris</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Allemagne</td><td>Type 845</td><td></td></tr><tr><td>MPVS Ultra PVL System</td><td>Millar Instruments, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem, Allemagne</td><td>A3597</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0.9 % isotonique</td><td>Braun, Allemagne</td><td>2350748</td><td></td></tr><tr><td>Bromure de pancuronium</td><td>Sigma-Aldrich, États-Unis</td><td>BCBQ8230V</td><td></td></tr><tr><td>Perfusor 11 Plus</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Nr. 70-2209</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab 4/35 unité de contrôle</td><td>ADInstruments, USA</td><td>PL3504</td><td></td></tr><tr><td>Kit de cautérisation rechargeable</td><td>Faromed, Allemagne</td><td>09-605</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Fine Science tools Inc.</td><td>140094-11</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel LabChart 7 Pro</td><td>ADInstruments, USA</td><td>LabChart 7.3 Pro</td><td></td></tr><tr><td>Standard mouse food</td><td>LASvendi GmbH, Germany</td><td>Rod18</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss, Germany</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Suture chirurgicale 8/0</td><td>Suprama, Germany</td><td>Ch.B.03120X</td><td></td></tr><tr><td>Canule de ponction veineuse Venflon Pro Safty calibre 20</td><td>Beckton Dickinson, États-Unis</td><td>393224</td><td></td></tr><tr><td>Pince à canulation pour récipients</td><td>Fine Science tools Inc.</td><td>00574-11</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue (Filtropur S 0.45)</td><td>Sarstedt, Allemagne</td><td>Ref. 83.1826</td><td></td></tr></tbody></table>

réponse cardiaque à la stimulation β-adrénergique déterminée par l’analyse de la boucle pression-volume

Cardiac Response to &#946;-Adrenergic Stimulation Determined by Pressure-Volume Loop Analysis

La détermination de la fonction cardiaque est une analyse de critères d’évaluation robuste dans des modèles animaux de maladies cardiovasculaires afin de caractériser les effets de traitements spécifiques sur le cœur. En raison de la faisabilité des manipulations génétiques, la souris est devenue le modèle animal mammifère le plus courant pour étudier la fonction cardiaque et rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Nous décrivons ici un protocole pour déterminer la fonction cardiaque in vivo en utilisant des mesures et des analyses de boucle pression-volume dans des conditions basales et sous stimulation β-adrénergique par perfusion intraveineuse de concentrations croissantes d’isoprotérénol. Nous fournissons un protocole affiné comprenant un support de ventilation prenant en compte la pression expiratoire finale positive pour améliorer les effets négatifs lors des mesures thoraciques ouvertes, et une analgésie puissante (buprénorphine) pour éviter un stress myocardique incontrôlable évoqué par la douleur pendant la procédure. Ensemble, la description détaillée de la procédure et la discussion sur les pièges possibles permettent une analyse hautement standardisée et reproductible de la boucle pression-volume, réduisant l’exclusion des animaux de la cohorte expérimentale en prévenant d’éventuels biais méthodologiques.

La mesure de la boucle volumique de pression (PVL) est un outil puissant pour analyser la pharmacodynamique cardiaque des médicaments et pour étudier le phénotype cardiaque de modèles murins génétiquement modifiés dans des conditions normales et pathologiques. Le protocole permet l’évaluation de la réserve cardiaque β-adrénergique dans le modèle murin adulte. Nous décrivons ici une méthode à poitrine ouverte sous anesthésie isoflurane combinée à la buprénorphine (analgésique) et au pancuronium (relaxant musculaire), qui ...

Nous décrivons ici une analyse de la boucle pression-volume cardiaque sous des doses croissantes d’isoprotérénol perfusé par voie intraveineuse pour déterminer la fonction cardiaque intrinsèque et la réserve β-adrénergique chez la souris. Nous utilisons une approche à poitrine ouverte modifiée pour les mesures de boucle pression-volume, dans laquelle nous incluons la ventilation avec une pression expiratoire positive.

Réponse cardiaque à la stimulation β-adrénergique déterminée par l’analyse de la boucle pression-volume

Determination of the cardiac function is a robust endpoint analysis in animal models of cardiovascular diseases in order to characterize effects of ...

Notre approche à poitrine ouverte, dans laquelle nous incluons la ventilation avec une pression expiratoire positive, est importante pour évaluer et analyser la fonction cardiaque in vivo et l’augmentation de la stimulation bêta-adrénergique. La procédure peut être utilisée pour traiter à la fois les paramètres de base de la fonction cardiaque indépendante de la charge et la réserve bêta-adrénergique chez les souris génétiquement modifiées ou lors d’interventions. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, désinfectez le membre postérieur gauche de la souris anesthésiée avec 70% d’éthanol et faites une incision pour exposer la veine fémorale gauche.Souffler l’artère épigastrique et la veine avec une cautérisation. Pour mieux voir la veine fémorale, le champ de vision est enjambé par une suture à travers l’abdomen. Ensuite, une suture est placée distale à l’accès au cathéter, pour ligaturer la veine fémorale.Passez une suture sous la veine fémorale et préparez un nœud crânien au site de ponction. Perforez la veine fémorale avec un microtube préparé attaché à une seringue de 1 millilitre et fixez le tube à l’intérieur du vaisseau avec la suture nouée. Pour contrer toute perte de liquide, utilisez une pompe à seringue automatique pour infuser du chlorure de sodium à 0,9%, complété par 12,5% d’albumine, à un débit de perfusion de 15 microlitres, et hydrater les tissus exposés avec du chlorure de sodium préchauffé à 0,9%.Pour accéder au thorax, rincez le thorax avec de l’éthanol à 70% et incissez la peau juste sous le processus xiphoïde. Séparez brutalement les muscles pectoraux de la paroi thoracique et utilisez une pince pour soulever le processus xiphoïde afin de permettre à la paroi thoracique d’être coupée, jusqu’à ce que le diaphragme soit entièrement visible. Inciser le diaphragme par le bas pour exposer l’apex cardiaque et utiliser une pince pour retirer soigneusement le péricarde.Effectuez une costotomie limitée sur le côté gauche et passez une suture sous la veine cavale inférieure pour permettre une réduction de la précharge en aval. À l’aide d’une canule de calibre 25, perforez doucement l’apex cardiaque et remplacez la canule par un cathéter pression-volume, jusqu’à ce que toutes les électrodes soient dans le ventricule. Ensuite, ajustez doucement la position du cathéter jusqu’à l’obtention de boucles de forme rectangulaire.Pour acquérir des mesures de boucle pression-volume, effectuez une analyse en ligne des paramètres de la fonction cardiaque d’intérêt et attendez qu’une fonction cardiaque à l’état d’équilibre soit obtenue. Arrêtez le respirateur à l’extrémité expiratoire et enregistrez les paramètres de base. Après 3 à 5 secondes, utilisez une pince pour soulever la suture sous la veine cavale inférieure afin d’obtenir des paramètres indépendants de la précharge et allumez le ventilateur.Attendez au moins 30 secondes pour la deuxième occlusion jusqu’à ce que les paramètres hémodynamiques soient stabilisés. Après avoir obtenu la mesure dans des conditions basales, montez une seringue chargée d’isoprotérénol sur la pompe à seringue. Attendez au moins deux minutes jusqu’à ce qu’une nouvelle fonction cardiaque à l’état d’équilibre soit observée.Avant d’arrêter le respirateur en position expiratoire et d’enregistrer les paramètres de base. Après 3 à 5 secondes, soulevez la suture sous la veine cavale inférieure pour obtenir des paramètres indépendants de la précharge et attendez au moins 30 secondes la deuxième occlusion. Montez ensuite la seringue contenant la prochaine concentration d’isoprotérénol, répétez la ligne de base et préchargez les enregistrements de paramètres indépendants.Pour effectuer un étalonnage de conductance parallèle, après la dernière mesure dose-réponse d’isoprotérénol, connectez une seringue chargée de la solution de chlorure de sodium à 15% à la canule fémorale et infusez soigneusement 5 microlitres de la solution hypertonique jusqu’à ce que la boucle pression-volume se déplace légèrement vers la droite. Attendez que les boucles reviennent à l’état d’équilibre, avant d’arrêter le respirateur à la fin de l’expiration et d’injecter immédiatement un bolus de 10 microlitres de chlorure de sodium à 15%. Vérifiez ensuite si la boucle pression-volume s’est largement élargie et déplacée vers la droite.Pour effectuer un rapport conductance/volume, attendez 5 minutes jusqu’à ce que le bolus salin hypertonique soit complètement dilué avant de retirer le cathéter, et à l’aide d’une seringue de 1 millilitre, équipée d’une canule de calibre 21 pour retirer au moins 600 microlitres de sang du ventricule gauche du cœur battant. Ensuite, transférez le sang dans une cuvette d’étalonnage préchauffée dans un bain-marie à 37 degrés Celsius, avec des cylindres d’un volume connu, et placez le cathéter pression-volume au centre de chaque cylindre pour permettre l’enregistrement de la conductance. En utilisant cette méthode de mesure de la pression thoracique ouverte, du volume et de la boucle, si le cathéter est correctement placé dans le ventricule, un cycle cardiaque complet sera représenté par une boucle pression-volume de forme rectangulaire.Comme illustré, la systole commence par une phase de contraction isovolumétrique, au cours de laquelle les deux valves cardiaques sont fermées. Lorsque la pression ventriculaire dépasse la pression aortique, la valve aortique s’ouvre et le sang est pompé dans l’aorte pendant la phase d’éjection. Par la suite, lorsque la pression aortique dépasse la pression ventriculaire, la valve aortique se ferme et la diastole commence.Pendant la relaxation isovolumétrique, la pression ventriculaire diminue, jusqu’à ce que la pression auriculaire dépasse la pression ventriculaire et que la valve mitrale s’ouvre. Le remplissage diastolique passif, caractérisé par la relation pression-volume diastolique terminale, a ensuite lieu jusqu’au début du prochain cycle cardiaque. Comme il est capable de déterminer la fonction cardiaque indépendamment de la précharge, l’analyse pression-volume peut fournir un aperçu détaillé de la fonction cardiaque, de la contractilité cardiaque.Par exemple, dans cette analyse, l’isoprotérénol a induit un effet significatif sur chaque fonction cardiaque mesurée et paramètre de contractilité cardiaque. En revanche, une réduction des paramètres diastoliques a été observée en réponse à l’augmentation des concentrations d’isoprotérénol. La mise en place précise du cathéter dans le ventricule gauche est cruciale pour obtenir des boucles reproductibles sans artefacts.Pour optimiser le placement du cathéter, nous préférons l’approche de la poitrine ouverte. Après des mesures de boucle PV, l’endyse allométrique peut être déterminée, et les tissus peuvent être isolés, pour identifier les altérations moléculaires et histopathologiques, causées par des traitements, et / ou des modifications génétiques. Cette technique ouvre la voie à l’analyse de la réserve bêta-adrénergique dans des modèles murins dans des conditions normales et pathologiques et peut être utilisée comme modèle pour tester d’autres stimuli.

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