Coloration par immunofluorescence à monture entière, imagerie confocale et reconstruction 3D du nœud sino-auriculaire et auriculo-ventriculaire chez la souris
22 décembre 2020
Nous fournissons un protocole étape par étape pour la coloration par immunofluorescence complète du nœud sino-auriculaire (SAN) et du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) dans les cœurs murins.
Ce protocole explique les étapes nécessaires pour effectuer une microdissection, une immunofluorescence complète, une coloration et une microscopie spécifiques pour le nœud sinusal et le nœud AV chez la souris. La méthodologie du montage complet est avantageuse pour aborder la localisation 3D exacte et la morphologie du sinus et du nœud AV et pour examiner la relation avec le tissu environnant. La morphologie des tissus est considérablement préservée avec seulement un minimum de déshydratation et de rupture physique des tissus.
Pour commencer, perforez le cœur avec une aiguille de calibre 27 dans la région de l’apex en enfonçant soigneusement l’aiguille dans le ventricule gauche et en injectant doucement cinq à 10 millilitres de PBS glacé pour profoncer le cœur. Soulevez délicatement le cœur à l’aide d’une pince à épiler et coupez les gros vaisseaux pour retirer le cœur. Placez le cœur dans une boîte de dissection remplie de PBS glacé sous le microscope de dissection.
Après avoir déterminé l’orientation du cœur, tournez le cœur de manière à ce que l’avant du cœur soit au fond du plat. Immobiliser le cœur en insérant de petites broches à travers l’apex et l’appendice auriculaire dans l’agarose au fond de la boîte de dissection. À l’aide d’une pince à épiler fine et de ciseaux, retirez soigneusement le tissu non cardiaque autour de la veine cave supérieure et inférieure.
Pour exposer la région intercave, retirez la majorité des ventricules en coupant parallèlement au sillon entre les ventricules et les oreillettes avec un micro ciseaux. Pour la fixation et la déshydratation, mettez l’échantillon dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transférez le cœur dans une solution de saccharose à 15 % et incubez-le pendant 24 heures à quatre degrés Celsius.
Après l’incubation, transférez le cœur dans une solution de saccharose à 30 % pendant encore 24 heures à quatre degrés Celsius. Lavez le cœur dans 1 % de Triton X-100 dilué dans du PBS. Ensuite, bloquez-le et perméabilisez-le dans une solution bloquante pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Placez le cœur dans un tube de 1,5 millilitre et incubez-le avec des anticorps anti-souris Connexin 43 de lapin et des anticorps HTN4 anti-souris de rat dilués avec une solution bloquante pendant sept jours à quatre degrés Celsius. Après sept jours, prélever la solution contenant les anticorps primaires à l’aide d’une pipette. Lavez le cœur avec une solution Triton X-100 à 1 % trois fois pendant une heure par lavage sur l’agitateur orbital.
Répétez les étapes de lavage après l’incubation avec des anticorps secondaires et du DAPI. Après avoir préparé des anneaux en plastique et les avoir remplis de pâte à modeler, placez le cœur dans la rainure de la pâte à modeler avec l’arrière du cœur vers le haut. Identifiez le SAN, qui est situé sur la face dorsale du cœur avec la région intercavale.
Ajoutez du PBS au cœur pour déplacer tout l’air dans la cavité jusqu’à ce que le cœur soit entièrement recouvert de PBS. Appliquez du silicone sur les bords de l’anneau en plastique. Appuyez doucement sur la partie environnante de l’échantillon dans la pâte à modeler pour fixer le cœur et recouvrez le cœur avec un lamelle.
Ensuite, appuyez doucement sur l’arrière de la pâte à modeler pour extraire une partie du PBS et fixez le cœur à la lamelle en prenant soin d’éviter toute bulle d’air dans la zone d’imagerie. Placez les échantillons de coloration à monture entière à l’envers sur la plate-forme du microscope confocal et procédez à l’imagerie comme décrit dans le manuscrit de texte. Les paramètres de chaque canal du microscope confocal sont réglés à l’aide du logiciel correspondant.
Ce protocole a été utilisé pour effectuer l’imagerie par microscopie confocale du ganglion sino-auriculaire et du ganglion auriculo-ventriculaire dans des cœurs murins. Une coloration spécifique du système de conduction et du myocarde fonctionnel avec des anticorps fluorescents, ciblant respectivement HCN4 et Connexin 43, permet d’identifier le ganglion sino-auriculaire et le nœud auriculo-ventriculaire au sein de l’anatomie intacte. Ce protocole de coloration à montage entier permet d’étudier l’interaction de différents types de cellules en utilisant divers anticorps.
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Aperçu
Ce protocole décrit les étapes de la coloration immunofluorescente en montage entier du nœud sinusal (SAN) et du nœud atrioventriculaire (AVN) dans les cœurs de souris. La méthodologie permet une localisation tridimensionnelle précise et l'examen de la morphologie de ces structures cardiaques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cardiovasculaire
- Techniques d'immunofluorescence
Contexte
- Le nœud sinusal (SAN) et le nœud atrioventriculaire (AVN) sont essentiels au fonctionnement cardiaque.
- L'immunofluorescence en préparation complète permet d'obtenir des informations sur la morphologie de ces nœuds.
- Cette technique préserve la morphologie tissulaire avec un minimum de déshydratation.
- Comprendre la relation entre ces nœuds et les tissus environnants est essentiel pour la recherche cardiaque.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour la coloration du nœud sinusal (SAN) et du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) dans les cœurs de souris.
- Faciliter l'étude de la localisation tridimensionnelle des nœuds cardiaques.
- Approfondir la compréhension des interactions des tissus cardiaques.
Méthodes utilisées
- Microdissection de cœurs de souris.
- Coloration immunofluorescente en montage entier.
- Microscopie pour la visualisation des tissus colorés.
- Utilisation de PBS glacé pour la préservation des tissus.
Résultats principaux
- Coloration réussie du nœud sinusal et du nœud auriculo-ventriculaire dans les cœurs de souris.
- Préservation de la morphologie tissulaire observée.
- Visualisation claire de la localisation tridimensionnelle obtenue.
- Compréhension améliorée des relations entre les nœuds cardiaques et les tissus environnants.
Conclusions
- Le protocole est efficace pour l'étude du nœud sinusal et du nœud auriculo-ventriculaire chez la souris.
- L'immunofluorescence en montage complet est une technique précieuse en recherche cardiaque.
- Des études supplémentaires peuvent s'appuyer sur cette méthodologie pour obtenir des connaissances plus approfondies.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La visualisation 3D à haute résolution des nœuds sinusal et atrioventriculaire dans des modèles murins comble une lacune critique dans la recherche en électrophysiologie cardiaque, permettant une cartographie anatomique et cellulaire précise. Cette capacité renforce la confiance prédictive dans la validation précoce des cibles pour les mécanismes d'arythmie et soutient la continuité translationnelle depuis la découverte jusqu'aux études cardiaques précliniques. La préservation de l'intégrité tissulaire et la possibilité d'analyser multiplex des types cellulaires positionnent ce protocole comme un atout réutilisable pour les portefeuilles de recherche et développement cardiovasculaires.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation des cibles
- Permet une analyse détaillée des populations cellulaires du système de conduction et des cellules marquées in situ.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en précisant les relations structure-fonction au niveau nodal.
- Permet d'identifier avec confiance des cibles pertinentes pour la pathologie dans l'arythmogenèse.
- Fournit un contexte anatomique aux études fonctionnelles et à la vérification d'hypothèses.
Développement de tests et criblage
- Prépare des systèmes tissulaires cardiaques intègres et validés pour des flux de travail d'imagerie et d'analyse en aval.
- Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs en immunofluorescence pour les marqueurs nodaux et myocardiques.
- Permet une étiquetage multiplexé par anticorps afin d'évaluer plusieurs types cellulaires au sein d'un même échantillon.
- Prend en charge la standardisation et l'extensibilité des tests pour des études comparatives.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne des données anatomiques 3D avec des modèles précliniques pertinents pour la maladie des troubles de la conduction cardiaque.
- Assure la continuité entre la découverte moléculaire et la validation au niveau tissulaire.
- Permet la progression ajustée au risque des cibles candidates en se fondant sur des preuves structurales et cellulaires.
- Facilite le développement de biomarqueurs en cartographiant les interactions entre cellules nodales et cellules non myocytaires.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole d'imagerie par immunofluorescence en préparation entière et par microscopie confocale relie la découverte précoce, la validation des cibles et la recherche cardiaque préclinique en fournissant des données anatomiques quantitatives riches en informations.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification des hypothèses et la clarification des voies dans la recherche sur la conduction cardiaque.
- Écrantage : Fournit des lectures reproductibles et quantitatives par immunofluorescence pour l'identification des nœuds.
- Analytique : Permet la reconstruction 3D et l'analyse comparative des régions nodales et myocardiques.
- Recherche translationnelle : Assure la continuité anatomique et cellulaire pour les modèles précliniques d'arythmie.
- Réutilisation en entreprise : Établit une plateforme normalisée d'imagerie et d'analyse pour les équipes de recherche et développement cardiovasculaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles cardiaques.
- Valeur opérationnelle : Standardise la préparation des tissus et l'imagerie pour des résultats reproductibles et évolutifs.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt et l'efficacité du capital dans les programmes de découverte cardiaque.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles et modèles du système de conduction.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection cardiaque, en immunofluorescence et en microscopie confocale.
- Exige un accès à des plateformes d'imagerie avancées et à des logiciels d'analyse d'images.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de manipulation des tissus et des anticorps.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les modèles cardiaques ou les espèces utilisés.
- La taille des échantillons et la pénétration des anticorps peuvent limiter le débit dans les études à grande échelle.
