Visualisation du SARS-CoV-2 à l’aide de l’hybridation in situ par immuno-ARN-fluorescence

Ce protocole a permis de visualiser l’ARN du SRAS-CoV-2 dans des lignées cellulaires et dans des cultures tridimensionnelles d’épithélium des voies respiratoires humaines entièrement différenciées, fournissant ainsi un outil pour mieux comprendre la pathogenèse et la réplication virales au niveau de la cellule unique. En raison de sa spécificité, de sa sensibilité et de sa résolution élevées, cette méthode est utile non seulement pour les études scientifiques fondamentales du SRAS-coronavirus-2, mais aussi pour les projets applicatoires, tels que les diagnostics. Agnieszka Suder, une étudiante au doctorat de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Après avoir fixé et perméabilisé les cellules comme décrit dans le manuscrit de texte, retirez la solution 1X PBS des puits et ajoutez au moins 300 microlitres de tampon d’amplification dans chaque puits. Incuber les échantillons pendant 30 minutes à température ambiante. Préparez chaque épingle à cheveux HCR en refroidissant le volume souhaité dans des tubes séparés.

Pour préparer 300 microlitres de solution d’amplification, utilisez 18 picomoles de chaque épingle à cheveux. Transférez la solution en épingle à cheveux dans des tubes et incubez-les à 95 degrés Celsius pendant 90 secondes. Puis laisser refroidir à température ambiante pendant 30 minutes à l’obscurité.

Préparez un mélange d’épingles à cheveux en ajoutant les épingles à cheveux H1 et H2 refroidies par pression au tampon d’amplification. Placez des gouttes de 30 à 50 microlitres de mélange d’épingle à cheveux sur Parafilm. Placez les lamelles avec les cellules sur les gouttes de mélange d’épingle à cheveux et incubez les échantillons pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante.

Pour monter les diapositives, placez deux gouttes de 10 microlitres de support de montage sur une diapositive, en vous assurant que les gouttes sont suffisamment séparées pour permettre de placer deux lamelles sur une seule lame. Retirez l’excès de liquide en tapotant les lamelles sur une serviette propre. Placez-les ensuite dans un support de montage anti-décoloration avec les cellules vers le bas.

Placez les échantillons montés sur une surface sèche et plane dans l’obscurité et laissez-les durcir. Après avoir fixé et perméabilisé les cellules AOH comme décrit dans le manuscrit textuel, préamplifiez les échantillons en les incubant avec un tampon d’amplification pendant 30 minutes à température ambiante. Utilisez 30 picomoles de chaque épingle à cheveux pour préparer 500 microlitres de solution d’amplification.

Transférez la solution d’épingle à cheveux dans les tubes et incubez-les à 95 degrés Celsius pendant 90 secondes. Ensuite, refroidissez-les à température ambiante pendant 30 minutes à l’obscurité. Préparez la solution d’épingle à cheveux en ajoutant toutes les épingles à cheveux refroidies par pression à 500 microlitres de tampon d’amplification à température ambiante.

Retirez la solution de préamplification et ajoutez la solution complète en épingle à cheveux. Ensuite, incubez les échantillons pendant la nuit à température ambiante dans l’obscurité. Placez la membrane découpée des inserts Transwell sur 10 microlitres de produit de montage anti-évanouissement avec les cellules vers le haut, et ajoutez un produit de montage supplémentaire à la membrane.

Recouvrir ensuite les membranes avec des lamelles. Ce protocole immuno-ARN-FISH a été réalisé dans deux systèmes cellulaires, une lignée cellulaire Vero et une culture d’épithélium des voies respiratoires humaines en 3D. La localisation de l’ARN sous-génomique du SRAS-coronavirus-2 dans les cellules Vero infectées et inoculées est illustrée ici.

L’ARN viral est visible en rouge. La localisation de l’ARN subgénomique du SRAS-coronavirus-2 dans les cellules épithéliales des voies respiratoires humaines infectées et inoculées est illustrée ici. Le protocole de perméabilisation a été optimisé dans les cellules Vero.

La perméabilisation avec un détergent donne un signal clair et spécifique pour l’ARN subgénomique du SRAS-coronavirus-2, tandis que l’utilisation de l’éthanol donne une image floue et floue. Lors du montage des lames avec des cellules Vero, il est important de placer une lamelle avec les cellules vers le bas. Lors du montage des lames AOH, la membrane doit être placée avec les cellules vers le haut.

Cette technique peut être facilement modifiée pour permettre la détection de tout ARN, y compris les ARN non codants et les virus à ARN qui pourraient émerger à l’avenir. Couplé à l’immunofluorescence, il peut être utilisé pour étudier les interactions protéine-ARN au niveau de la cellule unique.