Un système de purification de protéines à haut débit économique et polyvalent à l’aide d’un adaptateur de plaque multicolonne

Un système de purification de protéines à haut débit économique et polyvalent à l’aide d’un adaptateur de plaque à plusieurs colonnes. Bonjour, la purification des protéines est impérative pour l’étude de la structure et de la fonction des protéines. Et il est généralement utilisé en combinaison avec des techniques biophysiques.

Ceci est particulièrement important à l’ère de la protéomique fonctionnelle qui nécessite une production de protéines à haut débit. Nous avons émis l’hypothèse qu’un adaptateur de plaque multicolonne, le MCPA, peut interfacer plusieurs colonnes de chromatographie de différentes résines avec des plaques multi-puits pour une purification parallèle. Avec cet adaptateur, nous avons développé une méthode économique et polyvalente de purification des protéines qui peut être utilisée sous gravité ou sous vide rival dans la vitesse d’un système automatisé.

Nous montrons ici cette méthode pour la chromatographie d’affinité au nickel et la chromatographie par échange d’ions. Assemblez le MCPA en plaçant un tapis d’étanchéité perforé sur une longue plaque d’égouttement, puis insérez le nombre souhaité de colonnes dans les trous du tapis d’étanchéité. Placez une plaque de collecte ouverte à la base du collecteur et fermez-la avec le haut du collecteur.

Fixez le tube et placez le MCPA assemblé avec des colonnes sur le dessus. Piper 1,2 mil de la solution de nickel-NTA dans les colonnes. Pendant le pipetage, assurez-vous que les perles restent entièrement mélangées.

Allumez la pompe et passez l’éthanol à 20% à travers les colonnes et dans la plaque de collecte ci-dessous. Éteignez la pompe une fois que le liquide est passé à travers. Jeter le contenu de la plaque de collecte dans une boîte à déchets.

Ajouter trois volumes de résine de tampon EDTA à toutes les colonnes. Allumez la pompe et passez le liquide à travers. Maintenant, lavez les colonnes avec trois volumes de résine de tampon d’hydroxyde de sodium 0,5 molaire.

Lavez les colonnes avec quatre volumes de résine de sulfate de nickel 100 millimolaires, puis 10 volumes de résine d’eau Mili-Q. Si une colonne fonctionne plus lentement, poussez le liquide à travers avec le piston de la seringue. Versez le contenu des plaques de collecte dans une boîte à déchets.

Ensuite, lavez les colonnes deux fois avec quatre volumes de résine de tampon de lavage imidazole 10 millimolaire et videz les plaques de collecte. Si plusieurs échantillons sont purifiés, remplacez les plaques de collecte ouvertes par des plaques de 48 puits. Avec le vide éteint, chargez les lysats dans les colonnes.

Utilisez un agitateur en plastique mince pour mélanger doucement les perles et les lysats dans la colonne pour maximiser la liaison. Allumez la pompe et passez le liquide à travers. Si une colonne est bloquée, transférer le mélange de résine lysat dans une colonne avec un filtre frais.

Congelez les plaques de collecte pour contenir votre flux. Remplacez par une plaque de collecte ouverte, puis lavez les colonnes avec neuf volumes de résine de tampon de lavage imidazole de 10 millimolaires. Répétez cette étape quatre ou cinq fois.

Pour éviter le débordement, videz périodiquement les plaques d’a déchets. Remplacez les plaques de collecte ouvertes par une plaque de 96 puits, en vous assurant que A1 se trouve dans le coin supérieur gauche. Pipet un volume de résine de tampon d’élution dénaturant dans les colonnes.

Faire passer le liquide à travers et vérifier la plaque de collecte pour s’assurer qu’il n’y a pas de contamination entre les puits. Pour la dilution suivante, répétez les étapes précédentes et collectez dans une assiette de collecte fraîche. Prenez une aliquote de 50 microlitres de chaque élution pour l’analyse de la pureté et de la concentration.

Ensuite, lavez les colonnes avec deux millilitres d’éthanol à 20%. Ajoutez deux autres mil d’éthanol à 20% aux colonnes et utilisez l’agitateur en plastique mince frais pour mélanger les perles dans l’éthanol avant de les transférer dans un tube de 50 mil pour le stockage à quatre degrés Celsius. Assemblez le MCPA dans un collecteur sous vide avec une plaque de collecte ouverte et des pistons de seringue dans toutes les colonnes.

Retirez tous les pistons de seringue de la première rangée. Retirez le joint en caoutchouc d’un piston de seringue de cinq mil, puis percez un trou au centre. Ensuite, poussez le fond d’une colonne ouverte à travers le joint en caoutchouc perforé.

Répétez ces étapes et insérez-les dans la première rangée de colonnes. Assurez-vous que les perles de sépharose Q sont entièrement mélangées. Et avec la pointe de pipette bleue qui est coupée à deux centimètres du bas, pipet 800 microlitres des perles de sépharose Q dans les colonnes ouvertes.

Une fois que les perles se sont installées au fond des colonnes, allumez suffisamment la pompe à vide pour faire fonctionner l’éthanol à 20%. Lavez les colonnes deux fois avec deux mil de Tris 10 millimolaires. Éteignez la pompe juste avant que le tampon Tris n’ait traversé pour empêcher le dessèchement de la résine.

Le ruissellement peut être jeté et remplacé par des plaques de collecte de 48 puits. Transférer tous les échantillons à purifier dans les colonnes Q Sepharose de la première rangée et utiliser un agitateur en plastique mince pour mélanger les échantillons et les perles pendant environ deux minutes avant d’allumer la pompe à vide. Stockez ou figez votre flux pour une analyse ultérieure.

Avec une plaque de collecte ouverte, lavez les colonnes deux fois avec deux mil de Tris 10 millimolaires. Remplacez les plaques de collecte ouvertes par la plaque de 96 puits. La première fraction d’élution peut être collectée dans la première rangée ou dans la deuxième rangée.

Pour éluer dans la deuxième rangée, retirez les pistons de seringue de ces positions. Déplacez les colonnes Q Sepharose dans ces positions, puis placez les pistons de seringue dans les colonnes ouvertes de la première rangée. Piper un millilitre des premières concentrations de sel dans les colonnes Q Sepharose.

Allumez la pompe et récupérez l’élution. Pour recueillir l’élution suivante, retirez les pistons de seringue des positions suivantes, déplacez les colonnes Q Sepharose dans ces positions, puis remplacez les pistons dans les positions précédentes. Répétez ces étapes pour chaque concentration successive de sel utilisée pour éluer.

Assurez-vous qu’une nouvelle plaque de collecte est utilisée pour quatre élutions et que chaque plaque est étiquetée et entreposée. Avec une plaque de collecte ouverte, lavez les colonnes avec deux mil de quatre molaires de chlorure de sodium, 10 trisolaires millimolaires. Pipet deux mil d’éthanol à 20% et passez-le à travers jusqu’à ce qu’il soit juste au-dessus des perles, puis scellez les colonnes pour le stockage.

À titre d’exemple, le MCPA a réussi à purifier 14 mutants AbpSH3 dans des conditions de dénaturation par un nickel-NTA. Un petit contaminant peut être vu à 25 kilodaltons, bien que la protéine soit encore largement pure. Les petits contaminants observés dans des conditions de dénaturation sont éliminés dans des conditions indigènes.

Ceci a été montré quand 11 domaines SH3 différents ont été purifiés. Cela montre que le MCPA peut être utilisé pour comparer les conditions de purification. AbpSH3 peut être séparé de la majorité des contaminants par purification par échange d’ions à partir de lysats.

De bons rendements de protéine AbpSH3 considérablement pure ont été récupérés avec divers contaminants de poids moléculaires plus élevés. La purification des échantillons post-nickel-NTA à l’aide de l’échange d’ions avec le MCPA a permis d’éliminer ces contaminants de poids élevé. Bien qu’il y ait encore une légère contamination, les fractions sont encore en grande partie pures et ont donné de bonnes données biophysiques à l’aide de rmn et d’essais de dnaturation chimique thermique.

En conclusion, nos résultats montrent que notre hypothèse est correcte et que le MCPA peut purifier avec succès des quantités de milligramme de protéines en utilisant différentes techniques de chromatographie. Le système MCPA peut être configuré de plusieurs manières au cours des mêmes exécutions pour optimiser les conditions de purification. La configuration est simple, bon marché et facile à former des utilisateurs inexpérimentés, en particulier dans les laboratoires qui ne purifient pas systématiquement les protéines.