Découverte de régulateurs métastatiques à l’aide d’un modèle de membrane chorioallantoïque intravitale rapide et quantitative du poussin

Notre protocole permet une identification efficace des gènes ou des combinaisons de gènes qui bloquent l’invasion du cancer chez le spectateur. la surculture ne nécessite pas d’installations animales avancées pour l’entretien. Dans l’ensemble, en tant que générique ou général, les bibliothèques spéciales peuvent être projetées en quelques semaines en viewer.

Ce système de dépistage supérieur aidera les chercheurs à découvrir de nouvelles cibles de gènes thérapeutiques ou des combinaisons de cibles de gènes qu’il peut être utilisé pour bloquer les métastases cancéreuses. Pour l’injection IV, concentrer les cellules à 0,5 à 1 million de cellules par millilitre, en utilisant 1X PBS glacé pour diluer ou suspendre à nouveau les cellules. Attendez-vous à ce qu’environ un millilitre de suspension cellulaire soit nécessaire pour 10 embryons.

Pour assembler l’appareil d’injection, montez une aiguille sur la seringue, puis étendez l’aiguille de la seringue avec un tube de trois à cinq centimètres de long. Cassez l’extrémité de l’aiguille de borosilicate à l’aide d’une pince fine. Chargez la seringue avec 50 à 200 microlitres de la suspension de cellules cancéreuses.

Et insérez l’aiguille de borosilicate dans le tube. Inspectez l’aiguille pour le colmatage des cellules et les bulles d’air. Si un colmatage cellulaire est observé dans le capillaire, retirez le capillaire, re-suspendez les cellules et remplacez-le par un nouveau capillaire.

Utilisez le piston pour pousser les bulles. Retirez le couvercle du couvercle et transférez l’embryon sous le stéréoscope. Identifier la veine appropriée à injecter sur la surface camienne, qui n’est normalement que légèrement plus large que le diamètre de l’extrémité de l’aiguille en borosilicate et située à mi-chemin entre l’embryon et la paroi de la boîte de pesée.

Il est généralement plus facile d’injecter au point immédiatement adjacent à la bifurcation veineuse. Appuyez sur la pointe de l’aiguille contre la paroi des vaisseaux sanguins et appliquez une légère pression dans la même direction que le flux sanguin. Si nécessaire, utilisez un coton-tige pour aider à ancrer ou à stabiliser le récipient injecté.

Appuyez doucement sur le piston de la seringue pendant 2 à 10 secondes jusqu’à ce que le volume souhaité soit injecté. Jeter l’embryon si un saignement excessif ou une accumulation liquide claire apparaît au site d’injection. Retirez l’aiguille du CAM et tamponnez doucement le site d’injection avec un coton-tige pour enlever tout sang ou excès de cellules cancéreuses.

Couvrir l’embryon injecté dans le plat de pesée avec le couvercle et le retourner à l’incubateur. Répétez la procédure jusqu’à ce que tous les embryons soient injectés. Inspectez visuellement les embryons à la recherche de bactéries ou de moisissures contaminées ou de la mort.

Et jeter les embryons contaminés selon les procédures d’élimination en laboratoire. S’assurer que les colonies métastatiques semblent de forme uniforme pendant les trois premiers jours suivant l’injection. Et identifiez les colonies métastatiques invasives ou non invasives aux jours quatre à cinq après l’injection.

Au cinquième jour après l’injection, retirez les embryons de l’incubateur et inspectez et localisez les MCA embryonnaires pour la distribution des colonies métastatiques. Sous le microscope à dissection, tirez doucement le tissu CAM qui contient la colonie métastatique d’intérêt vers le haut à l’aide de pinces fines et coupez-le avec des ciseaux chirurgicaux. Transférer le tissu CAM dans un tube vide et stérile de 1,5 millilitre et fermer le couvercle du tube.

Répétez la procédure d’excision jusqu’à ce que toutes les colonies d’intérêt soient rassemblées dans des tubes séparés. Hachez délicatement le tissu CAM dans un tube de microcentrifugation, à l’aide d’une aiguille stérile séparée de calibre 18 pour chaque colonie. Ajouter 100 microlitres de solution de collagène-A 1X et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Faites tourner les cellules et le tissu CAM à 300 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Aspirer la solution de collagène-A et re-suspendre les cellules du milieu incomplet pour la lignée cellulaire d’intérêt. Ensuite, faites tourner à nouveau les cellules et les tissus.

Re-suspendez les cellules et les morceaux de tissu dans un millilitre de milieu complet et de facteur de sélection, le cas échéant. Ensuite, transférez dans un seul plat de culture tissulaire de 12 puits. Pendant les trois prochaines semaines, surveillez quotidiennement la croissance et la contamination des cellules cancéreuses.

Lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de la confluence, transférez-les dans une boîte de culture à plus grand volume. Passez au séquençage ou à la prochaine ronde de sélection, dès que le nombre adéquat de cellules cancéreuses est atteint. Des embryons présentant une accumulation de cellules cancéreuses due à une injection infructueuse peuvent être observés dans la plupart des capillaires.

Lorsque la concentration cellulaire optimale et la durée de l’injection sont atteintes, les cellules transduites post-injection du cinquième jour devraient produire une grande variété de phénotypes de colonies, la majorité des colonies étant invasives, déterminées par les cellules cancéreuses apparaissant dispersées dans le tissu CAM. Il faut faire attention aux colonies métastatiques qui semblent compactes et sont situées suffisamment loin des colonies voisines pour pouvoir être excisées avec des pinces et des ciseaux et un morceau de tissu CAM. Un écran positif isolé devrait afficher le phénotype de la colonie compacte lors de la réin injection.

Pour mesurer les contacts des vaisseaux sanguins des cellules cancéreuses, il faut prêter attention à la luminosité de la tache de la paroi vasculaire et la quantité appropriée de lectines doit être injectée pour le signal de la paroi vasculaire. Lorsque vous essayez ce protocole, évitez l’injection sous ou trop et éliminez les saignements excessifs ou l’accumulation de liquide. Plusieurs nouveaux gènes qui sont à l’origine de l’invasion des cellules cancéreuses chez le spectateur ont été identifiés à l’aide de cette technique.