Approches de visualisation et d’analyse tridimensionnelles et quadridimensionnelles pour étudier l’allongement et la segmentation axial des vertébrés

Les stades de l’organogenèse chez les embryons de souris restent mal étudiés, en partie en raison de la visualisation difficile des structures complexes embryonnaires. Ce protocole décrit les techniques qui permettent la visualisation et l’analyse 3D et 4D d’embryons de souris lors de l’extension axiale et de la segmentation. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux chercheurs d’étudier et de montrer les structures complexes de l’embryon de souris en tant qu’objets dynamiques 3D.

Ce protocole contient des techniques qui peuvent être utilisées dans l’étude des malformations congénitales affectant la vertèbre et la moelle épinière des mammifères, telles que la scoliose. Ces techniques peuvent également être utilisées avec des systèmes modèles in vitro, permettant ainsi l’étude du développement embryonnaire humain. Pour préparer les embryons de souris entre le jour embryonnaire 8.25 et le jour embryonnaire 10.5 pour l’imagerie vivante, disséquez les embryons dans un milieu M2 préchauffé à 37 degrés Celsius.

Retirez doucement le sac vitellin à l’aide d’une pince propre et lavez l’embryon une fois avec un milieu M2 frais pour éliminer le sang et les débris produits lors de la dissection. Au cours de la procédure d’imagerie en direct, incuber des embryons dans un milieu DMEM à faible teneur en glucose complété par un FBS défini par HyClone à 10%, deux millimolaires L-glutamine et 1% de streptomycine à la pénicilline dans une chambre chauffée à 37 degrés Celsius et un oxygène à 65% avec un environnement à 5% de dioxyde de carbone. Pour préparer des embryons de souris de stade similaire pour la microscopie d’immunofluorescence, au lieu d’utiliser du M2 chauffé, disséquez les embryons dans du PBS froid et fixez-les dans du paraformaldéhyde à 4%.

Après avoir effectué l’ensemble du protocole de coloration par immunofluorescence de montage tel que décrit dans le manuscrit du texte, la clairance tissulaire peut être obtenue à l’aide de RapiClear. Tout d’abord, placez les embryons au centre d’une lame de verre concave de dépression de 75 x 25 millimètres, retirez tout le PBST dans la lame de dépression du microscope et ajoutez 200 microlitres de solution de nettoyage, puis couvrez la préparation de la lame avec une boîte. Après 10 minutes à l’abri de la lumière, lorsque les embryons commencent à devenir transparents, remplacez la solution de nettoyage et attendez 20 minutes supplémentaires.

Recouvrez l’embryon d’une lèvre de couverture partant d’un côté et se déplaçant doucement vers l’autre. L’échantillon est maintenant prêt pour l’imagerie. Pour le nettoyage à l’aide de salicylate de méthyle ou de BABB, assurez-vous que les embryons sont complètement déshydratés dans du méthanol à 100%, puis commencez la série de BABB et de méthanol avec des augmentations successives de concentration de 20% et une incubation de 20 minutes pour chaque étape.

Lorsque la solution BABB atteint 100 %, apportez deux modifications supplémentaires pour une nouvelle solution. Préparez une lame de verre de couverture de 20 x 60 millimètres 1,5 pour monter les embryons afin d’éviter de comprimer l’échantillon. Ajoutez des entretoises fabriquées à partir de rondelles métalliques minces.

Transférez les embryons dégagés sur les lames du microscope à l’aide d’un cure-dent, d’une pointe de coton fin ou d’une pipette Pasteur. Ajoutez ensuite une goutte de support de montage, couvrez avec un autre verre de couverture similaire et scellez avec de la paraffine fondue pour mieux stabiliser la préparation afin d’éviter les bulles. Placez le couvercle d’un côté, puis faites-le glisser progressivement et doucement sur le côté, en ajoutant plus de médium si nécessaire.

L’échantillon est maintenant prêt à être imagé au microscope. Utilisez Fidji/ImageJ pour repositionner l’embryon dans une position normalisée de l’axe antérieur-postérieur et dorsal-ventral après l’imagerie. Réduisez la taille du jeu de données dans l’image de Fidji, puis mettez à l’échelle et insérez les valeurs d’échelle X, Y et Z nécessaires pour réduire le jeu de données à moins de 200 mégaoctets.

Assurez-vous que l’option Créer une nouvelle fenêtre est cochée. Ensuite, allez dans les plugins et ouvrez 3D Viewer. Dans la fenêtre de la visionneuse 3D, cliquez sur l’embryon pour le sélectionner, ce qui provoque l’apparition d’une boîte 3D rouge.

Lorsque vous utilisez ce mode, contrôlez la rotation du jeu de données avec une souris. Après avoir assuré la position parfaite de l’embryon, sélectionnez Modifier, transformer l’image et exporter l’image transformée dans la fenêtre visionneuse 3D. Inspectez les différents plans orthogonaux, puis accédez à l’image, puis empilez et sélectionnez des vues orthogonales.

Lorsque l’embryon est correctement positionné, sélectionnez le menu de la fenêtre visionneuse 3D, puis modifiez, transformez et enregistrez la matrice de transformation dans un fichier texte avec une extension de tapis. Ouvrez le fichier texte à l’aide de Fiji/ImageJ, supprimez les deux premières lignes et enregistrez-les à nouveau. Cela crée un fichier de matrice de transformation compatible avec le plugin TransformJ.

Basculez vers le jeu de données pleine résolution et exécutez les plugins d’opération TransformJ et TransformJ affine. Dans la nouvelle fenêtre, recherchez le fichier matriciel précédemment enregistré, sélectionnez l’interpolation B-spline cubique et rééchantillonnez isotropement, puis cliquez sur OK. Après avoir correctement repositionné l’embryon, coupez la majeure partie de l’espace vide créé. Pour effectuer une image de projection Z complète, cliquez sur piles, Projet Z et choisissez intensité maximale.

Dessinez ensuite le retour sur investissement minimum qui contient l’embryon entier dans X et Y.Basculez vers les fenêtres d’image du jeu de données d’origine en cliquant sur modifier, sélectionner, restaurer la sélection et recadrer en sélectionnant l’image. Coupez les tranches au début et à la fin qui n’intersectent pas les tissus embryonnaires en sélectionnant l’image et en ouvrant les piles, cliquez sur les outils, sélectionnez le dissolvant de tranche et spécifiez la première et la dernière tranche à supprimer, en vous assurant de changer l’incrément en un. Si vous le souhaitez, effectuez des analyses supplémentaires et des reconstructions 3D en utilisant les instructions du manuscrit textuel.

Pour effectuer une analyse 3D d’embryons plus développés, disséquer les fœtus embryonnaires du jour 18,5 dans le PBS froid, enlever toutes les membranes embryonnaires supplémentaires, puis laver les fœtus plusieurs fois dans du PBS frais pour éliminer le sang et les débris produits pendant la procédure de dissection. Fixer les fœtus dans 4% PFA fabriqué dans PBS à quatre degrés Celsius pendant cinq à sept jours. Après avoir lavé l’embryon plusieurs fois dans du PBS, déshydratez les fœtus en incubant dans des augmentations successives de 10%10 de solutions de méthanol jusqu’à ce que 100% de méthanol soit atteint.

Effectuez chaque incubation pendant 25 minutes sur un agitateur à température ambiante. Ensuite, incuber les fœtus séparément sur un agitateur d’abord pendant une journée dans du peroxyde d’hydrogène à 5% dans du méthanol, puis dans du peroxyde d’hydrogène à 10% dans du méthanol pendant trois jours jusqu’à ce que les embryons perdent toute pigmentation naturelle. Réhydrater progressivement les embryons dans une série de méthanol inversé dans de l’eau déminéralisée à chaque incubation pendant 20 minutes sur un agitateur à température ambiante, puis laver les embryons trois fois pendant 30 minutes par lavage dans de l’eau déminéralisée.

Pour intégrer les fœtus dans des blocs d’agarose à 1%, remplissez un tube ou une seringue en plastique de 50 millilitres avec de l’agarose fondue, puis placez le fœtus dans l’agarose en position verticale et maintenez cette position avec une pince pendant la solidification de l’agarose. Placez la moisissure avec le bloc à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes pour que l’agarose se gélifie complètement, puis retirez le bloc d’agarose avec le fœtus de la moisissure et placez-le dans un récipient avec de l’eau démoralisée. Effectuer la déshydratation du fœtus progressivement avec une augmentation de 10% de la concentration de méthanol dilué dans de l’eau déminéralisée ou PBS, en gardant l’échantillon en concentration de méthanol pendant au moins 45 minutes à température ambiante sur un agitateur jusqu’à ce que 100% de méthanol soit atteint.

Éliminez les fœtus en les déplaçant à travers une solution BABB en série et du méthanol pendant 2,5 heures dans chaque concentration avec une augmentation de 25% de la concentration BABB jusqu’à atteindre 100% BABB. Remplacez la solution BABB par une solution fraîche tous les jours jusqu’à ce que le fœtus soit complètement transparent. Ce processus peut prendre de trois à cinq jours.

Utilisez de la colle pour fixer le bloc d’agarose dégagé à l’axe moteur du scanner OPT, puis ajustez l’optique pour obtenir une image du fœtus entier et procédez à l’acquisition d’un ensemble de données de projection complet. La technique d’imagerie en direct 4D permet l’analyse dynamique de l’expression du rapporteur LuVeLu et des embryons knockout conditionnels Snai1 du jour embryonnaire 8,5. Avec le signal LuVeLu normal sur le mésoderme présomitique, les embryons knockout conditionnels Snai1 présentent une expression LuVeLu dans le renflement ectopique qui résulte de la traînée primitive.

Les tests d’immunofluorescence de montage entier permettent de détecter les NMP potentiels et les principaux régulateurs de la différenciation du mésoderme. Les flèches blanches et jaunes mettent en évidence les différences entre les embryons mutants et sauvages. Le rendu 3D d’immunocolorations de monture entières permet une meilleure compréhension du tissu ou de la structure dans l’étude.

Dans ce cas, l’emplacement des PNM potentiels dans le bourgeon de queue a été étudié. Les reconstructions tissulaires 3D sont également importantes pour comprendre et caractériser les défauts morphologiques des embryons de souris. La visualisation interactive de la reconstruction 3D peut également être construite dans des formats conviviaux.

Par exemple, dans un fichier PDF. Ces structures caudales embryonnaires 3D peuvent être utilisées pour illustrer la puissance des modèles 3D à un public plus général et pour aider à l’étude dans l’enseignement de l’allongement et de la segmentation axials d’un vertébré. Enfin, la visualisation 3D in toto d’embryons de souris plus développés est possible en utilisant la technique de microscopie OTP.

Des rendus animés sont montrés ici, mettant en évidence des tranches clés de fœtus embryonnaires de jour 18,5. La chose la plus importante à retenir est que le résultat doit rester une représentation fidèle de ce qui est observé dans l’embryon. Les chercheurs peuvent utiliser ces méthodes pour aller au-delà de la simple présentation statique aux images, mais aussi inclure des vidéos, des reconstructions tridimensionnelles et même des modèles 3D interactifs de leurs données.