Name: Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Découvrez le profilage polysome pour analyser l'efficacité traductionnelle de l'ARNm dans le cortex cérébral de souris en développement. Cette méthode économique et reproductible permet d'étudier la régulation traductionnelle au cours du développement cérébral.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ces travaux ont été financés par une subvention découverte du CSERN (RGPIN/04246-2018 à G.Y.). G.Y. est chaire de recherche du Canada. S.K. a été financé par mitacs Globalink Graduate Fellowship et ACHRI Graduate Student Scholarship.

Toute l’utilisation des animaux a été supervisée par le Comité de protection des animaux de l’Université de Calgary. Les souris CD1 utilisées pour l’expérience ont été achetées auprès d’un fournisseur commercial.
1. Préparation de solutions
REMARQUE Pour prévenir la dégradation de l’ARN, vaporisez l’établi et tout l’équipement avec la solution de décontamination RNase. Les conseils sans RNase sont utilisés pour l’expérience. Toutes les solutions sont préparées dans l’eau sans RNase.
<ol><li>Préparer la solution de bouillon de cycloheximide (100 mg/mL) dans DMSO et conserver à -20 °C.</li>
	<li>Préparez une solution de stock de saccharose de 2,2 M en ajoutant 75,3 g de saccharose à l’eau sans RNase et en recadrage du volume à 100 mL (pour une préparation de gradient ~ 16). La solution peut être maintenue à -20 °C pour le stockage à long terme.</li>
	<li>Préparer 10x solution de sel (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2).</li>
	<li>Préparez 60 % (w/v) solution de chasse au saccharose, contenant 30 g de saccharose, 5 mL de solution de sel 10x et garnir le volume jusqu’à 50 mL d’eau sans RNase.</li>
	<li>En option, ajoutez un grain de bromophénol bleu ou environ 5 μL de bleu bromophénol de 1 % dans de l’eau exempte de RNase à la solution de chasse. 1.6. Conserver les solutions à 4 °C.</li>
</ol>2. Préparation du gradient de saccharose
REMARQUE : La précision dans la préparation des gradients de saccharose est essentielle pour obtenir des résultats cohérents et reproductibles.
<ol><li>Pour préparer six gradients de saccharose de 10 à 50 %, diluez la solution de saccharose de 2,2 M comme dans le tableau 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Solution saccharose</td>
			<td>10%</td>
			<td>20%</td>
			<td>30%</td>
			<td>40%</td>
			<td>50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>2,2 M saccharose</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>6 mL</td>
			<td>8 mL</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de sel 10X</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cycloheximide</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eau</td>
			<td>11,5 mL</td>
			<td>9,5 mL</td>
			<td>7,5 mL</td>
			<td>5,5 mL</td>
			<td>3,5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume total</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Dilutions du saccharose pour la préparation des gradients de saccharose.
REMARQUE : Préparez toujours des gradients de saccharose en multiples de deux pour équilibrer le poids pendant l’ultracentrifugation.
<ol start="2"><li>Essuyez l’aiguille à extrémité émoussée en métal avec la solution de décontamination RNase. Rincez brièvement les tubes d’ultracentrifugeuse, les tubes et la seringue à l’aide d’eau sans RNase. Séchez à l’air les tubes de sorte qu’il ne reste pas de goutte d’eau dans les tubes car toute eau restante modifiera la concentration de saccharose.</li>
	<li>Placez l’aiguille métallique sur le support de pince et le tube de centrifugeuse sur le stade motorisé. Pour préparer les gradients de façon uniforme, un système assemblé à domicile a été utilisé qui contient une étape motorisée pour tenir le tube d’ultracentrifugeuse et une pompe à seringues pour injecter des solutions de saccharose(figure 1, voir l’étape 9 pour plus de détails).</li>
	<li>Remplissez une seringue de 30 mL avec ~16 mL de saccharose à 10% (assez pour six gradients), placez-la sur la pompe à seringues et connectez-la à l’aiguille. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue, les tubes et l’aiguille. Essuyez la pointe de l’aiguille pour enlever toute solution résiduelle.</li>
	<li>Déplacez le stade motorisé vers le haut de telle sorte que la pointe de l’aiguille touche le centre du tube au fond.</li>
	<li>Réglez la pompe à seringues à un débit de 2 mL/min pour un volume de 2,3 mL.</li>
	<li>Après avoir distribué 2,3 mL de solution de saccharose à 10 %, descendez le stade motorisé et répétez le processus pour les six gradients.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.4-2.7 pour ajouter la solution de saccharose de 20% au fond des tubes, suivies par 30%, 40% et 50% solutions de saccharose de même.</li>
	<li>Après la préparation du gradient, sceller le tube d’ultracentrifugeuse à l’aide d’un film de paraffine.</li>
	<li>Laissez les tubes pendant la nuit à 4 °C de sorte que les différentes couches de saccharose diffusent ensemble pour donner un gradient continu.</li>
</ol>3. Dissection tissulaire
REMARQUE : Les souris enceintes ont été euthanasiées par dislocation cervicale précédée par l’anesthésie avec 5% d’isoflurane.
<ol><li>Recueillir des embryons de souris CD1 au jour embryonnaire 12, ou d’autres points de temps au besoin, et placer les embryons dans une plaque de Ø 10 cm contenant la solution de sel équilibré (HBSS) de Hank glacé sur la glace pour conserver la viabilité cellulaire.</li>
	<li>Sous la portée de dissection, transférer un embryon dans une plaque de Ø 6 cm contenant du HBSS glacé.</li>
	<li>Utilisez des aiguilles de 21 à 23 G pour fixer la position de la tête en pénétrant dans les yeux à un angle d’environ 45 ° et appliquez de la force pour vous assurer que les aiguilles sont fixées sur la plaque (figure 2A).</li>
	<li>Utilisez des forceps n° 5 pour enlever la peau et le crâne, du milieu aux côtés.</li>
	<li>Utilisez des forceps pour couper les bulbes olfactifs et enlever les méninges pour exposer les tissus corticals.3.6.Use forceps incurvés pour couper les tissus corticals en 2-3 mL de milieu neurobasal sur la glace (Figure 2B). Mettre en commun les tissus corticals de différents embryons au besoin. Les tissus de 8 à 10 embryons donnent habituellement environ 200 μg d’ARN total.</li>
</ol>4. Lyse cellulaire
<ol><li>Le jour de la dissection des tissus, préparez un tampon de lyse cellulaire fraîche tel que décrit dans le tableau 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>solution</td>
			<td>Concentration finale</td>
			<td>volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCl (pH 7,5)</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
			<td>1% (v/v)</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Désoxycholate de sodium</td>
			<td>0,5% (w/v)</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol (TNT)</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cycloheximide</td>
			<td>100 μg/mL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase eau libre</td>
			<td></td>
			<td>Recharger jusqu’à 5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>total</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Préparation du tampon de lyse polysome.
REMARQUE : Compléter le tampon de lyse avec des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase.
<ol start="2"><li>Ajouter le cycloheximide au milieu neurobasal avec des tissus disséqués à une concentration finale de 100 μg/mL et incuber à 37 °C pendant 10 min. Cycloheximide bloque l’allongement de la traduction et, par conséquent, empêche le ruissellement ribosome 15.</li>
	<li>Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le supernatant.</li>
	<li>Lavez les tissus deux fois avec du salin tamponné de phosphate glacé (PBS) complété par du cycloheximide de 100 μg/mL.</li>
	<li>Ajouter 500 μL de tampon de lyse cellulaire complété par 4 μL d’inhibiteur de la RNase. Pipette de haut en bas pour résuspendre le tissu dans le tampon de lyse. Utilisez une aiguille à insuline pour lyser doucement le tissu.</li>
	<li>Incuber les tissus sur la glace pendant 10 min avec un bref vortex toutes les 2-3 min. REMARQUE : Pour prévenir la dégradation des tissus, assurez-vous que toutes les étapes de la lyse tissulaire sont effectuées sur la glace.</li>
	<li>Centrifugeuse à 2 000 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Transférer le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse sur la glace.</li>
	<li>Centrifugeuse à ~13 000 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Transférer le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse sur la glace.</li>
	<li>Mesurer la concentration d’ARN dans le lysate tissulaire à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis. REMARQUE : Si plusieurs échantillons sont inclus dans l’expérience, diluez les échantillons à la même concentration avec un tampon de lyse cellulaire supplémentaire pour minimiser les variations.</li>
</ol>5. Chargement de l’échantillon et ultracentrifugation
<ol><li>Pré-refroidir le rotor d’ultracentrifugation et les seaux pivotants à 4 °C, et réglez la température de l’ultracentrifugeuse à 4 °C.</li>
	<li>Gardez 20 μL du lysate tissulaire comme entrée totale d’ARN.</li>
	<li>Chargez des échantillons (ARN de 50-300 μg avec un volume égal) sur le dessus des gradients de saccharose en distribuant lentement le lysate aux parois des tubes d’ultracentrifugeuse.</li>
	<li>Placez délicatement les tubes d’ultracentrifugeuse dans le seau à balançoire. Assurez-vous que tous les seaux diamétralement opposés sont équilibrés.</li>
	<li>Chargez les seaux de balançoire sur le rotor. Réglez l’ultracentrifugeuse à 190 000 x g (~39 000 rpm) à 4 °C pendant 90 min.</li>
	<li>Placer délicatement les gradients sur la glace après centrifugation.</li>
</ol>6. Fractionnement et collecte d’échantillons
REMARQUE : Un système de fractionnement, d’enregistrement et de collecte assemblé à la maison est utilisé pour l’analyse et la collecte d’échantillons à partir des gradients(figure 3, voir composants de l’appareil).
<ol><li>Placez un tube d’ultracentrifugeuse vide sur le perceur de tube et pénètrez doucement le tube avec l’aiguille du fond.</li>
	<li>Allumez le moniteur UV et ouvrez le logiciel d’enregistrement de signaux numériques.</li>
	<li>Remplissez une seringue de 30 mL avec 25 mL de solution de chasse au saccharose à 60 %. Appuyez doucement sur la seringue de sorte que la solution de chasse remplit le tube vide et passer par le moniteur UV de 254 nm pour définir la ligne de base pour la détection.</li>
	<li>Appuyez automatiquement sur l’auto-zéro sur le moniteur UV pour enregistrer une ligne de base pour la détection. Appuyez sur jouer sur le logiciel pour commencer l’enregistrement.</li>
	<li>Une fois que le système établit une ligne de base, mettre en pause l’enregistrement sur le logiciel et rétracter la solution de poursuite. Assurez-vous qu’aucune solution de poursuite résiduelle ne reste dans le système. REMARQUE : Rincez le système à l’eau sans RNase pour éliminer les solutions de saccharose résiduelles restantes de la course précédente.</li>
	<li>Chargez un tube d’échantillon jusqu’au perceur à tubes. Pénétrer doucement le tube avec l’aiguille du fond.</li>
	<li>Commencez à enregistrer sur le logiciel. Démarrez la pompe à seringues (débit de 1 mL/min pour un volume de 25 mL) et le collecteur de fractions pour recueillir les fractions de polysome. Réglez les paramètres de fractionneur à 30 s. REMARQUE : Avant chaque course, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue ou le tube en appuyant doucement sur la seringue pour laisser la solution de chasse couler continuellement à travers l’aiguille.</li>
	<li>Recueillir les fractions en tubes de 1,5 mL (500 μL chacun) à l’aide d’un collecteur de fractions.</li>
	<li>Les fractions peuvent être traitées immédiatement ou stockées à -80 °C.</li>
	<li>Après la collecte des fractions, rincer le système avec de l’eau sans RNase pour enlever tout saccharose résiduel.</li>
</ol>7. Extraction de l’ARN
<ol><li>À chaque fraction, ajouter 10 ng de luciferase mRNA spike-in contrôle.</li>
	<li>Ajouter trois volumes de réagencé d’isolement commercial à base d’ARN à base d’hydrocholride de guanidium à chaque fraction.</li>
	<li>Vortex brièvement pendant 15 s.</li>
	<li>Extraire l’ARN à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN compatible avec la solution utilisée en 7.2.</li>
</ol>8. Transcription inversée et PCR en temps réel
<ol><li>Mesurer la concentration de l’ARN à l’aide du spectrophotomètre UV-Vis.</li>
	<li>Soumettons l’ARN à la transcription inverse à l’aide d’un kit de synthèse cDNA, selon le protocole du fabricant.</li>
	<li>Utilisez le PCR quantitatif en temps réel (QPCR) pour examiner la distribution polysomale de l’ARNm gapdh à titre d’exemple. qPCR a été réalisé à l’aide d’un système de détection qPCR et d’un réagent mastermix qPCR, avec les conditions de cycle suivantes : 95 °C pendant 10 min, puis 40 cycles de 95 °C pour 15 s, 60 °C pour 30 s, 72 °C pour 40 s, suivis de 95 °C pour 60 s.</li>
	<li>Obtenez les valeurs du cycle threshold (Ct) à partir des parcelles d’amplification et utilisez-les pour calculer le changement de pli à l’aide de la méthode ΔΔCt.</li>
</ol>9. Gradient de saccharose effectuant l’assemblage de système
REMARQUE : Suivez les étapes d’assemblage de chaque composant (tel que décrit dans le tableau 3) du fabricant de gradient saccharose (figure 1).
<ol><li>Monter deux supports verticaux (A2) sur la planche à pain de base (A1).</li>
	<li>Utilisez deux supports minces à angle droit (B2) pour monter l’actionneur de scène linéaire sur la planche à pain de base (A1).</li>
	<li>Utilisez le setcrew sur le poteau en aluminium Ø12.7 mm (C2) pour le fixer sur la planche à pain de base du support du tube (C1) comme support pour le support du tube.</li>
	<li>Assemblez l’angle droit Ø1/2 » à la pince post-Ø6 mm (C3) avec le poteau (C2) et le poteau optique de mini-série (C4).</li>
	<li>Utilisez le setcrew sur le poteau optique (C4) pour connecter une petite pince en V (C5) comme support de tube.</li>
	<li>Mettez un tube de centrifugeuse dans le support du tube et ajustez l’angle pour le rendre vertical. Marquez la position du tube et montez le porte-poteau du piédestal (C6) sur la planche à pain de base (C1) pour soutenir le tube.</li>
	<li>De l’autre côté de la planche à pain (A1), utilisez la taille du poteau en aluminium de Ø12,7 mm (D1) pour le fixer et connecter un poteau optique de mini-série (D3) à l’aide d’un angle droit Ø1/2 » à la pince post-Ø6 mm (D2).</li>
	<li>Connectez la pince en V miniature (D4) à l’aiguille à extrémité émoussée (D5) au poteau (D3). Ajustez l’angle de la pince pour régler l’aiguille verticalement et ajustez la longueur du poteau pour vous assurer que l’aiguille rencontre le tube de centrifugeuse.</li>
	<li>Connectez l’actionneur (B1) au conducteur du moteur stepper (E1) et utilisez le tableau de contrôle R3 de l’ONU et le module joystick du kit de démarrage de l’ONU (E2) pour contrôler l’actionneur. Un adaptateur de puissance (p. ex., adaptateur de puissance réglable 9-24 V AC/DC) peut être utilisé pour conduire le moteur séparément.</li>
	<li>Placez la pompe à seringues (F) à côté de la station de fabrication de gradient et connectez la seringue avec l’aiguille.</li>
	<li>Contrôlez le support du tube de haut en bas à l’aide du joystick.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>composant</td>
			<td>article</td>
		</tr>
<tr>
<td>B1 (en)</td>
			<td>Actionneur de scène linéaire</td>
		</tr>
<tr>
<td>E1 (E1)</td>
			<td>Conducteur de moteur de stepper</td>
		</tr>
<tr>
<td>E2 (e2)</td>
			<td>Kit de démarrage super projet de l’ONU</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1 (en)</td>
			<td>Planche à pain</td>
		</tr>
<tr>
<td>A2 (en)</td>
			<td>Support vertical</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2 (en)</td>
			<td>Support mince à angle droit</td>
		</tr>
<tr>
<td>C1 (C1)</td>
			<td>Mini-série planche à pain</td>
		</tr>
<tr>
<td>C5 (en)</td>
			<td>Petite pince en V</td>
		</tr>
<tr>
<td>D4 (en)</td>
			<td>Pince en V miniature</td>
		</tr>
<tr>
<td>C2 (C2)</td>
			<td>Poteau en aluminium de Ø12,7 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>C4, D3</td>
			<td>Mini-série de post optique</td>
		</tr>
<tr>
<td>D1</td>
			<td>Poteau en aluminium de Ø12,7 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>C3, D2</td>
			<td>Angle droit Ø1/2 » à Ø6 mm après pince</td>
		</tr>
<tr>
<td>C6 (en)</td>
			<td>Base de support de poteau de piédestal de mini-série</td>
		</tr>
<tr>
<td>D5 (en)</td>
			<td>Aiguille d’extrémité émoussée</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>Pompe à seringues</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Gradient making system components.
10. Fractionnement et détection de l’assemblage du système( figure 2).
<ol><li>Utilisez une pince rotette à mâchoire ronde régulière pour monter le module optique du moniteur UV sur le perceur de tube. Fixez une extrémité du tube (1 cm de long et 0,56 mm de diamètre interne) au raccordement du perceur de tube et l’autre extrémité au fluide au port du module optique. Connectez le port Fluid Out au fractionneur.</li>
	<li>Connectez le module optique avec l’unité de commande du moniteur UV selon le manuel du fabricant.</li>
	<li>Utilisez un câble d’éclatement pour connecter la prise de sortie du signal au convertisseur numérique au sol et les connexions d’entrée analogiques, selon le manuel du fabricant.</li>
	<li>Connectez le convertisseur numérique à un ordinateur portable à l’aide d’un câble USB ordinaire et enregistrez les signaux numériques convertis à l’aide d’un logiciel d’acquisition de données.</li>
</ol>

<ol><li>Götz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li>
<li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li>
<li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li>
<li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+neurogenesis%3A+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359(2012).</li>
<li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li>
<li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eIF4E1%2F4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li>
<li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018(2020).</li>
<li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li>
<li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+on+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295(2014).</li>
<li>Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15(2017).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%3A+Official+Journal+of+Society+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455(2014).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Le profilage polysome est une technique couramment utilisée et puissante pour évaluer l’état translationnel à la fois au niveau d’un seul gène et à l’échelle dugénome 14 . Dans ce rapport, nous présentons un protocole de profilage polysome à l’aide d’une plate-forme assemblée à domicile et son application pour analyser le cortex de souris en développement. Cette plate-forme rentable est facile à assembler et à générer des gradients de saccharose robustes et reproductibles et un profilage polysome ...

Pendant le développement du cerveau des mammifères, les cellules souches neurales prolifèrent et se différencient pour générer des neurones et desgliales 1,2 . La perturbation de ce processus peut mener aux changements dans la structure et la fonction de cerveau, comme vu dans beaucoup de désordres neurodevelopmental3,4. Le bon comportement des cellules souches neurales nécessite l’expression orchestrée de gènes spécifiques5. Tandis que le contrôle épigénétique et transcriptionnel de ces gènes a été intensivement étudié, les résultats récents suggèrent que la régulation de gène à d’autres niveaux contribue également à la coordination de la prolifération et de la différenciation neuralesde cellules souches 6,7,8,9,10. Ainsi, la résolution des programmes de contrôle translationnel fera grandement progresser notre compréhension des mécanismes sous-jacents à la décision sur le sort des cellules souches neurales et au développement du cerveau.
Trois techniques principales avec des forces différentes ont été largement appliquées pour évaluer l’état translationnel de l’ARNm, y compris le profilage ribosome, la traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) et le profilage polysome. Le profilage ribosome utilise le séquençage de l’ARN pour déterminer les fragments d’ARNm protégés par le ribosome, ce qui permet à l’analyse globale du nombre et de l’emplacement des ribosomes de traduction sur chaque transcription d’inférer indirectement le taux de traduction en le comparant à l’abondance detranscription 11. TRAP tire parti des protéines ribosomiques marquées d’épitope pour capturer les ARNM ribosome-liés12. Étant donné que les protéines ribosomiques étiquetées peuvent être exprimées dans des types de cellules spécifiques à l’aide d’approches génétiques, TRAP permet l’analyse de la traduction d’une manière spécifique au type de cellule. En comparaison, le profilage polysome, qui utilise la fractionnement du gradient de densité saccharose pour séparer la partie libre et mal traduite (monosomes plus légers) de ceux qui sont activement traduits par des ribosomes (polysomes plus lourds), fournit une mesure directe de la densité ribosome surl’ARNm 13. Un avantage de cette technique est sa polyvalence pour étudier la traduction de l’ARNm spécifique d’intérêt ainsi que l’analyse du traduislatome à l’échelledu génome 14.
Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé de profilage polysome pour analyser le cortex cérébral de souris en développement. Nous utilisons un système assemblé à domicile pour préparer les gradients de densité du saccharose et recueillir des fractions pour les applications en aval. Le protocole présenté ici peut être facilement adapté pour analyser d’autres types de tissus et d’organismes.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL de microtubes sans ARN</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Antenne de 10 cm</td><td>Greiner-Bio</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>21-23G aiguille</td><td>BD</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM8640G</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 30 mL</td><td>BD</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>Extrémité émoussée aiguille</td><td>VWR</td><td>20068-781</td><td></td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>MB2530/M</td><td></td></tr><tr><td>Bleu bromophénol</td><td>Sigma</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>souris CD1</td><td></td><td>Charles River Laboratory Pince</td><td></td></tr> à <tr><td>pointe courbe</td><td>Sigma</td><td>#Z168785</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>66-81-9</td>Logiciel d’acquisition de <td></td></tr><tr><td>données TracerDAQ</td><td>Mesure Calcul Convertisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> numérique <td>Mesure Informatique</td><td>USB-1208LS</td></tr><tr><td>Direct-zol RNA miniprep kit</td><td>Zymo</td><td>R2070</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-basic</td><td>12-03-3483</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Bioshop</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.5 pince</td><td>Sigma</td><td>#F6521</td><td></td></tr><tr><td>Collecteur de fractions</td><td>Bio-Rad</td><td>Modèle 2110</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Wisent</td><td>311-513-CL</td><td></td></tr><tr><td>Actionneur à étage linéaire</td><td>Rattmmotor</td><td>CBX1605-100A</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase control RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td></td></tr><tr><td>Maxima first brin kit de synthèse d’ADNc</td><td>Themo Fisher</td><td>M1681</td><td></td></tr><tr><td>Miniature V-clamp</td><td>Thorlabs</td><td>VH1/M</td><td></td></tr><tr><td>Mini-série</td><td>Breadboard Thorlabs</td><td>MSB7515/M</td><td></td></tr><tr><td>Mini-série poteau optique</td><td>Thorlabs</td><td>MS2R/M</td><td></td></tr><tr><td>Mini-série</td> socle support de poteau <td>Thorlabs</td><td>MBA1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-basic</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal media</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash ; Poteau en aluminium 12,7 mm</td><td>Thorlabs</td><td>TRA150/M</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td><td>Quanta Bio</td><td>CA101414-274</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Bioshop</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Pince à angle droit</td><td>Thorlabs</td><td>RA90/M</td><td></td></tr><tr><td>Angle droit & Oslash ; 1/2" à & Oslash ; Pince de poteau 6 mm</td><td>Thorlabs</td><td>RA90TR/M</td><td></td></tr><tr><td>Rnase AWAY</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>Pointes sans RNase</td><td>Frogga Bio</td><td>FT10, FT200, FT1000</td><td></td></tr><tr><td>RNase d’eau</td><td>libre Wisent</td><td>809-115-CL</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>Support mince à angle droit</td><td>Thorlabs</td><td>AB90B/M</td><td></td></tr><tr><td>Petite pince en V</td><td>Thorlabs</td><td>VC1/M</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma</td><td>302-95-4</td><td></td></tr><tr><td>Pilote de moteur pas à pas</td><td>SongHe</td><td>TB6600</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Bioshop</td><td>57501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à seringue</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Pousse-seringue</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Bio-basic</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tube piercer</td><td>Brandel</td><td>BR-184</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>L8-70M</td></tr><tr><td>Tubes ultracentrifuges</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>UNO project super starter kit</td><td>Elegoo</td><td>EL-KIT-003</td><td></td></tr><tr><td>Moniteur UV</td><td>Bio-Rad</td><td>EM-1 Econo</td><td></td></tr><tr><td>Support vertical</td><td>Thorlabs</td><td>VB01A/M</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Le bon développement du cerveau mammifère repose sur un équilibre fin de la prolifération et de la différenciation des cellules souches neurales en différents types de cellules neurales. Cet équilibre est étroitement contrôlé par l’expression des gènes qui est peaufinée à plusieurs niveaux, y compris la transcription, la post-transcription et la traduction. À cet égard, un nombre croissant de preuves mettent en évidence un rôle essentiel de la régulation translationnelle dans la coordination des décisions relatives au sort des cellules souches neurales. La fractionnement polysome est un outil puissant pour l’évaluation du statut translationnel de l’ARNm aux niveaux génétique global et individuel. Ici, nous présentons un pipeline interne de profilage polysome pour évaluer l’efficacité translationnelle dans les cellules du cortex cérébral de souris en développement. Nous décrivons les protocoles pour la préparation de gradient de saccharose, la lyse de tissu, l’ultracentrifugation et l’analyse fractionnée-basée de l’état translationnel d’ARNm.

À titre de démonstration, le lysate cortical contenant 75 ARN μg (mis en commun à partir de 8 embryons) a été séparé par le gradient de saccharose en 12 fractions. Pics d’absorption UV à 254 nm fractions identifiées contenant le sous-unité 40S, sous-unité 60S, monosome 80S et polysomes (Figure 4A). Analyse des fractions par tache occidentale pour la grande sous-unité ribosomique, Rpl10 a montré sa présence dans la sous-unité 60S (fraction 3), monosome (fraction 4) et polysomes (fractions 5-1...

Le développement du cerveau mammifère nécessite un contrôle approprié de l’expression des gènes au niveau de la traduction. Ici, nous décrivons un système de profilage polysome avec une plate-forme facile à assembler de gradient de saccharose et de fractionnement pour évaluer l’état translationnel des ARNM dans le cerveau en développement.

Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

La régulation translationnelle joue un rôle important dans le développement du cerveau. Le profilage polysome fournit un outil utile et puissant pour évaluer l’état translationnel de l’ARNm, ce qui permet d’examiner les fonctions de contrôle translationnel pendant le développement du cerveau. Cette méthode est une approche facile et peu coûteux pour faire des gradients de saccharose et évaluer la fractionnement polysome.Dans ce protocole, il est utilisé pour analyser le cortex de la souris en développement. Cependant, il peut être facilement adapté pour étudier d’autres systèmes. Commencez par diluer 2,2 saccharose molaire pour préparer six gradients de saccharose de 10 à 50 %.Remplissez une seringue de 30 millilitres d’environ 16 millilitres de saccharose à 10 %, placez-la sur la pompe à seringues et connectez-la à l’aiguille. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue, le tube ou l’aiguille, et essuyez le bout de l’aiguille pour enlever toute solution résiduelle. Déplacez le stade motorisé vers le haut de telle sorte que la pointe de l’aiguille touche le centre du tube au fond.Réglez la pompe à seringues à une vitesse d’écoulement de deux millilitres par minute

analysis-translation-developing-mouse-brain-using-polysome

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l'évolution de l'initiation de la traduction de l'ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.

Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Ce protocole illustre modifications essentielles de polyribosome fractionnement afin d'étudier la translatome de vivo échantillons dans le SNC. Il permet une évaluation globale de la régulation de la traduction et de la transcription par l'isolement et la comparaison de l'ARN total à ribosome fractions d'ARN liés.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Les ribosomes jouent un rôle central dans la synthèse des protéines. Polyribosome (polysome) fractionnement par gradient de saccharose de densité centrifugation permet la détermination directe de l'efficacité de la traduction des ARNm individuels à l'échelle du génome entier. En outre, cette méthode peut être utilisée pour l'analyse biochimique des ribosomes et des facteurs de polysomes associées telles que les chaperons et les molécules de signalisation.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

La capacité des cellules à s’adapter au stress est cruciale pour leur survie. La régulation de la traduction de l’ARNm est l’une de ces stratégies d’adaptation, permettant une régulation rapide du protéome. Ici, nous fournissons un protocole standardisé de profilage des polysomes pour identifier des ARNm spécifiques qui sont traduits sélectivement dans des conditions de stress.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Le contrôle de la synthèse des protéines se produit principalement à l’étape d’initiation de la traduction, dont les déficiences sont liées à divers troubles. Pour mieux comprendre leur étiologie, nous avons décrit ici un protocole utilisant des ovocytes de Xenopus laevis évaluant la traduction du transcrit mos en présence d’un mutant du facteur d’initiation de traduction eIF4G1.

Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation

Bien que la structure des ribosomes ait été largement caractérisée, l’organisation des polysomes est encore sous-étudiée. Pour pallier ce manque de connaissances, nous présentons ici un protocole de préparation détaillé pour l’imagerie précise des polysomes de mammifères par microscopie à force atomique (AFM) dans l’air et dans les liquides.

Peering au cerveau polysomes avec Atomic Force Microscopy

L’objectif global de la technique de profilage polysome est analyse de l’activité traductionnelle de différents mRNAs ou transcriptome ARNm au cours de la synthèse des protéines. La méthode est importante pour les études de règlement de la synthèse de protéine, l’activation de la traduction et répression en santé et les maladies humaines multiples.

Polysome profilage en Leishmania, les cellules humaines et des testicules de souris

Nous présentons ici un protocole pour effectuer le polysome profilage sur le cœur isolé perfusé souris. Nous décrivons des méthodes pour la perfusion cardiaque polysome profilage et analyse des fractions polysome en ce qui concerne les ARNm, miARN et le protéome polysome.

Dynamique de protéomique et de miRNA analyse des Polysomes d’isolé souris coeur après Perfusion de Langendorff

Ici, nous décrivons l’immunoprécipitation des ribosomes et de l’ARN associé de populations choisies de cellules mâles adultes de germe de souris utilisant le système de RiboTag. La reproduction stratégique et l’immunoprécipitation soigneuse donnent des résultats propres et reproductibles qui informent sur le translatome des cellules germinales et donnent un aperçu des mécanismes des phénotypes mutants.

Immunoprécipitation de RiboTag dans les cellules germinales de la souris mâle

Ce protocole décrit une analyse de journaliste pour étudier le règlement de la traduction d’ADN messagère dans les ovocytes simples pendant la maturation in vitro.

Définition du programme de traduction de l’ARNm maternel au cours de la maturation in vitro à l’aide d’un test de rapporteur d’ovocytes unique

Ce protocole décrit comment générer un profil polysomique sans utiliser de générateurs de gradient automatisés ou de systèmes de fractionnement de gradient.

Profilage des polysomes sans générateurs de gradient ni systèmes de fractionnement

Découvrez le profilage polysome pour analyser l'efficacité traductionnelle de l'ARNm dans le cortex cérébral de souris en développement. Cette méthode économique et reproductible permet d'étudier la régulation traductionnelle au cours du développement cérébral.

Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

Explorer plus de vidéos