Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle normalisé de boucle intestinale

Le modèle intestinal est un moyen largement adaptable et physiologique de mesurer à quel point l’intestin est perméable et comment les leucocytes migrent dans l’intestin chez la souris, in vivo. Cette méthode permet de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l’augmentation de la perméabilité intestinale et à l’inflammation intestinale pathologique. La technique peut être employée pour aider à nos mécanismes de compréhension étant à la base de la fonction de barrière d’intestin, et inflammation pathologique, comme vu dans la colite ulcérative et Crohn' la maladie de s.

Ce modèle emploie un segment bien vascularisé et extériorisé d’entrailles, de l’iléon ou du côlon proximal, pour l’examen de la fonction de barrière intestinale ou du recrutement de cellules immunitaires chez la souris. Avec cette large application, le modèle de boucle intestinale peut fournir des informations sur les maladies résultant soit d’une barrière intestinale perméable ainsi que de la réponse inflammatoire. Les difficultés peuvent être surmontées en pratiquant les étapes chirurgicales.

Il est en critique important d’extérioriser un segment intestinal entièrement vascularisé et de choisir des endroits appropriés pour que les ligatures évitent le saignement. Le modèle de boucle intestinale est une technique microchirurgicale, ainsi, comme avec d’autres procédures chirurgicales, il bénéficie grandement d’une démonstration visuelle et d’une présentation étape par étape de la méthode. Après avoir atteint un plan chirurgical d’anesthésie, commencez par frotter la fourrure de la ligne médiane abdominale avec des tampons d’alcool ou une éponge de gaze imbibée d’éthanol à 70%.

Ne mouillez pas une large zone de fourrure avec de l’alcool pour prévenir l’hypothermie. À l’aide de ciseaux, effectuez une laparotomie médiane. Faites une incision horizontale au milieu de l’abdomen et exposez le péritoine, en prenant soin de ne pas blesser les organes intra-abdominaux.

Placez de la gaze de coton humide prédécoupée sur la cavité intra-abdominale exposée. Utilisez des cotons-tiges humides pour mobiliser et extérioriser le caecum et placez-le soigneusement sur de la gaze de coton humide. Ensuite, mobilisez et extériorisez doucement l’iléon.

Déployer au moins six centimètres d’iléon terminal sur la gaze de coton humide sans perturber les vaisseaux mésentériques et l’approvisionnement en sang. Gardez les tissus exposés humides en tout temps avec hbss chaud. Identifier l’artère principale fournissant l’iléon dans le mésentère, près du caecum.

Ensuite, localisez deux sites de ligature dans le mésentère qui sont exempts de vaisseaux sanguins critiques. Saisissez fermement l’iléon terminal avec une pince tissulaire émoussée et utilisez une pince à pointe fine pour fenêtrer le mésentère, en évitant les vaisseaux sanguins. Placez la suture de soie à travers la perforation et attachez un nœud chirurgical pour créer la première ligature.

Utilisez la règle pour mesurer quatre centimètres de la première ligature et créez la deuxième ligature. Coupez soigneusement à côté de chaque ligature avec de fines ciseaux pour isoler la boucle iléale de quatre centimètres, en gardant l’approvisionnement en sang et la membrane mésentérique intacts. Rincer doucement le contenu du segment de la boucle iléale avec hbss chaud à l’aide d’un tube d’alimentation jaune flexible attaché à une seringue de 10 millilitres.

Assurez-vous de rincer le contenu luminal de la cavité abdominale pour garder le site chirurgical propre. Liser les deux extrémités coupées de la boucle iléale rougie avec une suture de soie. Utilisez une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 30 pour injecter lentement 250 microlitres de réactif, tels que FITC-dextrans ou chimiokine, dans la lumière intestinale.

L’anse iléale va gonfler, provoquant une distension modérée de la muqueuse. Fermez la paroi abdominale à l’aide d’un porte-aiguille, d’une pince anatomique et de sutures de soie non absorbables 3.0 à l’aide d’une aiguille de coupe inversée. Après avoir séché l’animal pour prévenir l’hypothermie, placez-le dans une chambre d’anesthésie à température réglée pendant la période d’incubation.

Préparez la souris pour la chirurgie et extériorisez le caecum comme démontré précédemment. À l’aide de cotons-tiges humides, extériorisez tout l’iléon et placez-le sur une gaze de coton humide. Identifier le côlon proximal et l’approvisionnement en sang situé dans le mésocolon.

Mobiliser les deux points proximaux et créer la première ligature dans une zone exempte de vaisseaux dans le mésocolon à environ 0,5 centimètre distal du caecum. Mesurer deux centimètres à partir de la première ligature et créer une deuxième ligature à une zone exempte d’apport sanguin dans le mésocolon. À l’aide de ciseaux fins, coupez soigneusement à côté de chaque ligature pour isoler un pcLoop de deux centimètres de long.

Rincer doucement le pcLoop avec du HBSS chaud pour éliminer les matières fécales à l’aide d’un tube d’alimentation jaune flexible fixé à une seringue de 10 millilitres. Assurez-vous de rincer le contenu luminal de la cavité abdominale pour garder le site chirurgical propre. Ensuite, léguez les deux extrémités coupées du pcLoop rincé à l’aide d’une suture de soie.

Utilisez une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 30 pour injecter lentement 200 microlitres de réactif, tels que le FITC-dextrane ou la chimiokine, dans la lumière intestinale. Le pcLoop va gonfler, provoquant une distension modérée de la muqueuse. Utilisez des cotons-tiges humides pour remettre doucement le pcLoop, l’iléon et le caecum ligurés.

Fermez la paroi abdominale à l’aide d’un porte-aiguille, d’une pince anatomique et de sutures de soie non absorbables 3.0 à l’aide d’une aiguille de coupe inversée. Après la période d’incubation, euthanasier la souris anesthésiée et recueillir des tissus pour analyse. Afin de vérifier l’exactitude du modèle de boucle I pour l’évaluation de la perméabilité intestinale, un essai de PCLoop de FITC-dextrane a été exécuté pour évaluer le rôle de la protéine jam-a associée de jonction serrée dans le règlement de la fonction intestinale de barrière in vivo.

Avec le modèle pcLoop, une augmentation de 2,5 fois des niveaux de sérum FITC-dextrane a été quantifiée chez les souris jam-a nulles comparées aux contrôles. Des résultats semblables ont été obtenus avec des souris hébergeant la perte sélective de Jam-a sur les cellules épithéliales intestinales. Le modèle pcLoop a été utilisé pour étudier le recrutement de neutrophiles polymorphonucléaires, ou PMN, dans la muqueuse intestinale et la migration transépithéliale ultérieure in vivo.

Le nombre de PMN dans le contenu luminal du pcLoop a été quantifié par analyse cytométrique de flux. Le nombre de PMN présent dans le segment des deux points proximaux était bas dans des conditions physiologiques. Le traitement préparatoire avec les cytokines pro-inflammatoires, l’alpha de TNF et le gamma d’IFN, avant la chirurgie, a eu comme conséquence des nombres augmentés de PMN recrutés dans le lumen de pcLoop.

L’administration de l’attractif de chimio PMN LTB4 a mené à une augmentation spectaculaire des comptes de PMN. La souillure d’Immunohistochemical de PMN dans le mucosa du côlon corrobore le recrutement élevé de PMN après stimulation avec des cytokines et LTB4. La contribution de Jam-a à la migration transépithéliale de PMN a été étudiée utilisant le modèle de pcLoop sur des souris hébergeant la perte sélective de Jam-a sur les cellules épithéliales intestinales.

La perte de Jam-A épithélial a mené à un nombre réduit de PMN transmigrated dans le lumen du côlon comparé aux commandes de littermate. Un aspect critique de cette technique est de se rappeler de préserver l’approvisionnement en sang au segment intestinal extériorisé lors de l’exécution de la chirurgie. Suivant ce protocole, d’autres méthodes telles qu’un essai de perméabilité intestinale et un essai transepithelial de migration de neutrophile peuvent être exécutées pour étudier la perte d’intégrité de barrière et l’inflammation intestinale in vivo.