Visualisation des adaptations cellulaires pulmonaires pendant les lésions pulmonaires aiguës murines induites par l’ozone et le LPS

Bonjour, je m’appelle Gurpreet. Notre laboratoire étudie les mécanismes de l’inflammation et de la réparation des poumons. Bonjour, je m’appelle Jessica et j’étudie les alvéoles de rat de laboratoire induites par l’ozone en utilisant des méthodes microscopiques fluorescentes.

Bonjour à tous, je m’appelle Manpreet. Et j’étudie l’inflammation pulmonaire avec des méthodes d’imagerie animale. Les poumons sont continuellement confrontés à des insultes directes et indirectes, résultant de la stérilité, telle que l’ozone, et des composants microbiens, tels que le lipopolysaccharide bactérien ou LPS.

Une réponse écrasante de centre serveur peut avoir comme conséquence la respiration compromise et la lésion pulmonaire aiguë comme caractérisé par le recrutement de neutrophile de poumon, dû à la retouche immunisée, coagulative, et de tissu non réglementée de centre serveur. Nous décrivons une analyse complète de divers compartiments, à savoir le fluide de lavage broncho-alvéolaire, c’est-à-dire BAL, le perfusat vasculaire de poumon, c’est-à-dire LVP, sections gauches de cryo de poumon, sang périphérique et moelle osseuse sternal et fémur. Pour les expositions à l’ozone, placez doucement les souris dans la boîte à induction personnalisée et exposez continuellement les souris à 0,05 PPM d’ozone pendant deux heures.

Pour les expositions au LPS, anesthésier les souris sous un léger mélange intrapéritonéal de kétamine et de xylazine. Maintenant, instillez 50 microlitres hors de la solution LPS dans les narines externes des souris. Instiller des souris témoins avec 50 microlitres de solution saline stérile.

À des moments précis, anesthésiez les souris avec la dose complète de mélange de kétamine et de xylazine. Ensuite, désinfectez les souris et vérifiez les réflexes de pédale, c’est-à-dire pincer l’un ou l’autre des doigts du membre postérieur, et observez la rétraction du membre. Pas de réflexe signifie anesthésie profonde.

Maintenant, faites une coupe sous le sternum et exposez le cœur. Placez une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue héparinisée dans le ventricule droit et prélevez du sang par ponction cardiaque. Recueillir le sang dans des seringues héparinisées et égoutter dans des tubes de microfuges pour un traitement ultérieur.

Utilisez soigneusement une pince à épiler ou une pince émoussé pour dégager la région trachéale du tissu qui s’en dégage. Maintenant, coupez à travers la cage thoracique pour exposer les poumons. Passez une ligature de coton sous la trachée et laissez-la telle pour le moment.

Étourdez la trachée, espacée à environ un tiers de sa longueur des poumons pour la trachéostomie. Insérez une canule en polyéthylène de calibre 28 dans la trachée. Attachez fermement la ligature de coton pour maintenir la canule en place.

Assurez-vous de ne pas réduire la canule. Maintenant, injectez progressivement 0,5 ml de PBS dans la canule à l’aide d’une seringue d’un mL. Après avoir injecté du PBS, aspirez la seringue tant qu’elle ne résiste pas à l’aspiration.

Recueillir le liquide aspiré dans un tube de microphage marqué, et répéter cette procédure deux fois de plus. Couper l’aorte thoracique descendante à l’emplacement entre les moitiés thoraciques et abdominales pour éviter toute sauvegarde pendant la perfusion de poumon. Éponger la cavité près de l’extrémité de l’aorte coupée libre de sang.

Ensuite, parcourez les poumons avec 0,5 ML de solution saline héparinisée à température ambiante, injectez-la à travers le ventricule droit. Recueillir le perfusat vasculaire de la cavité à l’extrémité coupée de l’aorte thoracique descendante. Après avoir ligature la bronche droite, laissez le poumon gauche gonfler avec 0,5 ML de paraformaldéhyde pendant cinq minutes.

Maintenant, désinfectez la partie abdominale. Coupez la partie abdominale et deskin de l’os pelvien. Recueillir l’os pelvien et isoler les os du fémur gauche et droit dans une boîte de Pétri remplie de solution saline conservée sur la glace.

Recueillir la cage thoracique ventrale et le sternum dans une boîte de Petri remplie de solution saline, qui est également conservée sur la glace. Impréparez les extrémités coupées des os avec quatre fois avec 0,5 ML de solution saline à l’aide d’aiguilles bien ajustées sur des seringues de 1 ML. Recueillir les fractions de chaque os dans des tubes Falcon étiquetés, munis de filtres et placés sur de la glace.

Centrifuger tous les échantillons pendant 10 minutes à 3000 RPM. Collectez les surnageants et congelez-les instantanément. Reconstituer les cellules dans un minimum de 200 microlitres de PBS.

Effectuer le comptage total des leucocytes. Colorez un autre liquide de BAL avec un mélange de vert de calcénium et d’homodimer rouge d’ethidium une tache. Analyser le surnageant pour les chimiokines et la concentration totale en protéines.

Centrifuger les cellules pour préparer deux cytospins sur chaque lame et la tache pour les protéines biochimiques et immunitaires. Effectuer des colorations H et E modifiées sur les cryosections pulmonaires pour tous les groupes. Contours manuellement de 150 à 200 cellules dans le panneau d’image fusionné.

Copiez les régions d’intérêt décrites sur tous les canaux. Mesurez les paramètres prédéfinis pour tous les canaux. Diviser l’intensité fluorescente de la molécule colorée par celle de DAPI ou CD61.

Ceux-ci sont appelés DAPI ou CD 61 rapports d’intensité fluorescente normalisés. Tracez ensuite les paramètres pour évaluer les modifications éventuelles après l’exposition. Bien que les expositions combinées n’aient induit aucun changement dans le nombre total de cellules de BAL, de LVP ou de moelle osseuse sternale, les souris ont montré le leukocytosis systémique à 24 heures, qui a été suivi de leukopenia à 72 heures après exposition.

Ceux-ci sont affichés dans le nombre de cellules sanguines périphériques. Le nombre de cellules de moelle osseuse du fémur montre le pic tardif à 72 heures par rapport à tous les points de temps. Veuillez noter l’absence de coloration Siglec-F et CX3CRI dans les cellules polymorphonucléaires à 24 heures sur l’image de la cytospine BAL.

Bal et LVP cytospins ont montré la présence des grandes cellules mononucléaires positives CD11b et GR1 à zéro heure. Les cellules polymorphonucléaires se sont présentées comme un type prédominant de cellules dans tous les compartiments après exposition. La teneur totale en protéines de BAL était la plus élevée à 36 heures après exposition combinée.

Cependant, la protéine LVP était inchangée après exposition. Les niveaux d’eotaxin-2 et d’interleukin-2 étaient les plus élevés aux quatre heures dans LVP. Ces chemokines ont été réduits dans la fraction de BAL.

Intéressant, la neutrophile alarmant IL-16 et beaucoup de chemokines innés ont été changés dans le LVP, mais pas la fraction de BAL. À la ligne de base plus de 95% des cellules de BAL étaient mono nucléaire montrant l’actine corticale, le lamellipodia, l’effort et les fibres de tubuline, et ils étaient fortement positifs pour la souillure réduite de mitotracker. À quatre heures, nous avons observé les cellules circulaires de BAL, qui avaient perdu l’actine, mais ont montré un réseau étalé de microtubule suivant les indications de la souillure réduite rouge et inférieure de mitotracker.

Tôt après l’exposition combinée, les cellules de BAL ont semblé double positif pour la calcénine et l’ethidium homodimer-1, qui indique les cellules partiellement compromises. À 36 heures, les cellules BAL étaient largement viables, c’est-à-dire vertes. Nous avons observé l’alpha discret d’ATP et la souillure Ly6G dans les macrophages alvéolaires de BAL, et les neutrophiles.

Nous avons observé une réduction de l’alpha normalisé de DAPI d’ATP et une augmentation de contenu intracellulaire de protéine de Ly6G. Les expositions combinées ont induit des expressions transitoires de Bal, de cellule tueuse naturelle et de K1.1, d’ATP neutrophile, de PETA de sous-unité, de facteur de prolifération, de Ki-67 et d’expressions soutenues de neutrophile GR1, de plaquette CX3CRI et de la protéine angiostatine anti-angiogénique dans les cellules BAL après exposition. Bien que des dommages septaux bronchiolaires et alvéolaires étaient prévus, il était surprenant d’observer des agrégats cellulaires dans de plus grands navires à 36 heures après exposition.

Enfin, nous avons des résultats de synthèse dans ce tableau. Nous espérons que notre modèle murin servira de prototype facilement accessible qui peut être reproduit dans des laboratoires de confinement de niveau deux pour étudier les mécanismes de la mort cellulaire invasive et des infections. Merci.