Ingénierie et contrôle fiables des circuits génétiques optogénétiques stables dans les cellules de mammifères

Le protocole optogénétique standardisé est conçu pour les laboratoires intéressés à utiliser la lumière comme stimulus pour contrôler les propriétés cellulaires dans les systèmes cellulaires de mammifères modifiés. Ce protocole est facile à mettre en œuvre dans des laboratoires autrement peu familiers avec l’optogénétique et fournit des méthodes pour un contrôle spatial temporel précis des systèmes biologiques modifiés. Cette méthode a un large éventail d’applications dans des domaines de recherche spécifiques où l’information spatio-temporelle peut être importante, y compris la biologie du cancer, la biologie des systèmes et la différenciation tissulaire.

Pour commencer, sélectionnez les composants génétiques à combiner se lient en un seul circuit génique ou plasmide. Par exemple, les sites d’intégration de l’ADN des mammifères, les éléments sensibles à la lumière ou les gènes fonctionnels. Après avoir assemblé et examiné toutes les caractéristiques nécessaires telles que les codons de départ, les séquences réglementaires ou traduites, utilisez n’importe quel logiciel de génie génétique et de clonage moléculaire, annotez et stockez les séquences d’ADN pour une utilisation ultérieure et comme référence.

Validez les amorces par calcul pour la construction de plasmides grâce aux fonctionnalités intégrées du logiciel de clonage moléculaire, par exemple l’alignement des séquences. Pour générer une lignée cellulaire stable, transfecter les circuits géniques de conception et les cellules souhaitées à l’aide d’un mélange de liposomes de l’ADN du circuit génique avec la recombinase appropriée. Une fois que les cellules sont confluentes à 80 à 100 %, congelez les cellules dans un mélange de 45 % de milieux anciens, de 45 % de milieux frais et de 10 % de DMSO.

Transférez les cellules restantes dans un tube stérile et effectuez un tri unicellulaire pour isoler les cellules monoclonales dans une plaque de 96 puits. Environ deux à trois semaines après le tri monoclonal, les puits à l’intérieur de la plaque de 96 puits devraient avoir des foyers. Lorsque 50 à 60% de confluence est atteinte, divisez les cellules en une plaque de 12 puits.

Ajoutez le firmware au circuit LPA assemblé à l’aide d’un programmateur de microcontrôleur. Ensuite, combinez des pièces imprimées en 3D dans la carte de circuit imprimé assemblée à l’aide de la plaque de montage, de la carte de circuit imprimé, de l’entretoise LED, de l’adaptateur de plaque, d’une plaque à 24 puits, d’un couvercle de plaque, de boulons de montage, d’écrous d’aile et de composants d’empilage. Pour commencer une expérience optogénétique, utilisez le logiciel Iris disponible sur le site Web du Tabor Lab pour programmer une carte SD pour le LPA et explorer les conditions d’éclairage appropriées.

Ensuite, entrez les valeurs d’intensité avec les répliques techniques pour le contour expérimental souhaité. Ajouter environ 75 000 cellules par puits dans une plaque noire de 24 puits dans un volume total de 500 microlitres, puis placer les cellules dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone pour leur permettre de se déposer pendant deux à six heures. Après avoir transféré les cellules dans la hotte de culture tissulaire à la fin de l’incubation, retirez le couvercle en plastique et ajoutez une bande de film adhésif en haut de la plaque pour minimiser le transfert de lumière entre les puits afin que la lumière ne puisse entrer que par la LED située au fond du puits.

Placez la plaque dans les parties 3D ajustées du LPA, puis recouvrez la plaque avec le couvercle LPA imprimé en 3D qui s’adapte sur les vis de l’appareil à chaque coin. Branchez l’appareil à la source d’alimentation et appuyez sur le bouton de réinitialisation du dispositif LPA pour vous assurer que les paramètres d’expérience LPA mis à jour sont appliqués et incuber les cellules. Après l’incubation, à l’intérieur de la hotte de culture tissulaire, retirez la bande de feuille de la plaque et laissez la plaque reposer pendant une à deux minutes pour empêcher la condensation de se former sur le couvercle en plastique.

Ensuite, remettez le couvercle en plastique d’origine sur la plaque et imagez les cellules avec le microscope à contraste de phase ou à fluorescence approprié. Après 24 à 72 heures après l’induction, suivie d’une trypsinisation, transférer tout le contenu de chaque puits d’environ 500 microlitres dans les tubes étiquetés équipés de la passoire cellulaire. Ensuite, à l’aide d’un logiciel d’instrument de cytométrie en flux approprié, créez une porte de diffusion vers l’avant et latérale pour capturer les cellules individuelles de la taille et de la granularité appropriées afin d’exclure les débris et les amas cellulaires.

Une fois la porte définie, capturez environ 10 000 cellules avec la porte appropriée et ajustez le nombre de cellules en fonction de la quantité de données cellulaires requises et répétez la capture de cellules expérimentales dans chaque tube. Après induction et trypsinisation, transférer tout le contenu de chaque puits d’environ 500 microlitres dans les tubes étiquetés. Centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 400 fois G.Après avoir jeté le surnageant, déplacez les échantillons vers une hotte chimique.

Remettre en suspension les cellules dans 750 à 1 000 microlitres de PFA à 4 % dilués dans du PBS et pipeter plusieurs fois de haut en bas pour briser les amas cellulaires. Après 15 minutes d’incubation, ajouter 750 à 1 000 microlitres de PBS et pipeter à nouveau plusieurs fois, puis granuler les cellules pendant cinq minutes à 400 fois à température ambiante. Après avoir jeté le surnageant, déplacez les échantillons vers une hotte chimique et remettez les cellules en suspension dans 750 à 1 000 microlitres de méthanol glacé comme démontré et laissez les cellules reposer pendant 30 minutes dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius.

Après l’incubation, ajoutez 750 à 1 000 microlitres de PBS tout en pipetant plusieurs fois. Ensuite, après avoir centrifugé les cellules pendant cinq minutes à 400 fois G, jetez le surnageant et déplacez les échantillons vers une hotte chimique. Remettre en suspension les cellules dans 100 microlitres ou toute autre dilution appropriée d’anticorps primaire marqué et pipette de haut en bas six à huit fois, puis incuber pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, ajoutez 750 à 1 000 microlitres du tampon d’incubation et de la solution de pipette de haut en bas plusieurs fois, puis centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 400 fois G.Ensuite, remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de PBS et brisez les amas en pipetant plusieurs fois. Transférer tout le contenu de chaque tube dans des tubes marqués avec des passoires à cellules. Amenez les cellules à des instruments de cytométrie en flux appropriés avec des lasers des longueurs d’onde correctes.

L’étalonnage optique a été effectué pour les appareils. À l’aide de l’image acquise, les valeurs de compensation pour les LED ont été calculées, le signal d’arrière-plan a été soustrait et l’intensité des pixels a été déduite. Le coefficient de variation était minime entre 96 puits.

Le logiciel d’étalonnage a démontré la variation de la LED par emplacement et a créé un réglage de l’échelle de gris afin que chaque LED soit normalisée à la même intensité. L’expression génique a été induite dans des cellules plus légères modifiées par microscopie à fluorescence à différentes durées d’impulsion lumineuse sur le LPA et les cellules ont été imagées pour l’expression du champ lumineux et du GFP. En utilisant la cytométrie en flux, les cellules ont été induites à différentes valeurs de longueur d’impulsion et ont montré une réponse dose de l’expression génique quantifiée au niveau de la population de plus de quatre fois le changement par rapport aux états non induits.

La rétroaction négative a permis de multiplier par cinq la réduction du bruit d’expression génique, comme le montre la comparaison de diverses valeurs d’intensité lumineuse pour le système plus léger par rapport à la lumière vive ou allumée. L’analyse qPCR a montré que les cellules plus légères modifiées exprimaient les niveaux d’ARN d’une manière sensible à la dose avec une induction plus de dix fois supérieure à partir d’états non induits, correspondant à la quantification de la cytométrie en flux. Le circuit génétique plus léger modifié a montré des quantités croissantes de lumière bleue qui ont entraîné une augmentation des niveaux de protéines KRAS et des niveaux d’ERK phosphorylés.

Plusieurs tests fonctionnels peuvent être effectués, y compris la croissance, la motilité cellulaire, la cicatrisation des plaies, la prolifération ou les tests d’invasion. Ces méthodes pourraient fournir des informations spécifiques sur les mécanismes de la biologie du cancer, de la différenciation tissulaire ou de la résistance aux médicaments.