Name: Acétylation spécifique de la lysine des histones pour la reconstitution des nucléosomes à l’aide de l’expansion du code génétique chez Escherichia coli (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Découvrez l'incorporation spécifique d'acétyl-lysine dans l'histone H3 à l'aide du système MmAcKRS1/tRNA chez Escherichia coli. Cette méthode permet de produire des mononucléosomes acétylés pour étudier les mécanismes épigénétiques.

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Nous tenons à remercier le Dr Wesley Wang d’avoir jeté les bases de ce protocole et de son précieux mentorat. Ce travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (subventions R01GM127575 et R01GM121584) et la Fondation Welch (subvention A-1715).

1. Construction du plasmide
<ol><li>Commencez par décider quelle protéine d’histone sera acétylée et à quel site de lysine. Muter l’emplacement au codon ambrique (TAG) utilisant la mutagenèse dirigée par site. REMARQUE: Il existe quatre plasmides précédemment conçus utilisés pour l’expression de protéines histones. Chacun des quatre protéines d’histone a été cloné dans le vecteur pETDuet-1 avec une étiquette N-terminale d’histidine. L’histone H4 comprend également une étiquette SUMO, l’origine de la réplication colE1 avec un numéro de copie d’environ 40, résistante à l’ampicilline et un promoteur T7.<ol>
<li>Concevoir des amorces avant et arrière qui contiennent une mutation de TAG au site désiré (remplaçant un codon existant de lysine par le codon arrêt ambré) dans l’un des quatre plasmides de protéine d’histone.</li>
		<li>Utilisez la PCR à plasmide entier pour amplifier le plasmide contenant le TAG. Déterminez une température de recuit appropriée pour les amorces. En général, la température de fusion (Tm)des amorces moins 5 °C sera suffisante. Si des difficultés sont rencontrées pour obtenir un produit PCR, un gradient de température autour de Tm - 5 °C peut être utilisé pour optimiser la température de recuit pour l’amplification. REMARQUE: Dans cette expérience, une PFU polymérase exprimée en interne a été utilisée pendant 30 cycles dans les conditions suivantes: 94 °C pour 30 s (dénaturation), température de recuit pendant 30 s et 72 °C pendant 6 min (ou 1 min par paires kilobase). Pour plus de détails sur ce type de méthode PCR, voir Liu et Naismith7.</li>
		<li>Nettoyez le produit PCR avec un kit de nettoyage PCR en suivant le protocole du fabricant. Analyser le produit pcr par électrophorèse sur gel d’agarose et coloration subséquente au bromure d’éthidium.</li>
		<li>Ligater le plasmide en incubant avec de la T4 ligase pendant une nuit à 16 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transformez d’abord le plasmide contenant tag (AmpR)en Escherichia colichimiquement compétent. Choisissez un minimum de 4 colonies de la transformation et purifiez le plasmide. Faites des stocks de cellules de chacun avec du glycérol en utilisant des méthodes standard et stockez à -80 °C. Envoyer pour le séquençage pour confirmer la mutation tag désirée.</li>
	<li>Une fois la séquence confirmée, co-transformer le plasmide contenant tag (AmpR)avec pEVOL-AckRS (ChlR)en CobB chimiquement compétent (la seule histone lysine désacétylase connue dans E. coli.) délétion BL21 cellules en utilisant la méthode de choc thermique. pEVOL est un plasmide dont le nombre de copies est moyen à faible nombre de copies p15A. REMARQUE: La série pEVOL de plasmides a été construite sur la base d’études précédentes qui ont montré une expression accrue de la paire orthogonale aaRS / ARNtTyr était efficace pour diminuer la troncation des protéines et augmenter les rendements globaux des protéines mutantes8. Si les cellules de délétion cobB ne sont pas accessibles, procéder avec les cellules BL21 chimiquement compétentes. CobB est une histone de type sirtuine lysine désacétylase et nicotinamide peut être ajouté à une concentration finale de 5 mM au cours de l’expression de la protéine histone pour inhiber CobB comme une approche alternative9.</li>
	<li>Faites un stock de cellules et conservez-le à -80 °C.</li>
</ol>2. Expression de la protéine d’histone acétylée
<ol><li>Préparer 1 L de milieu autoclavé 2YT (ou volume de choix) dans une fiole de culture.</li>
	<li>Inoculer 20 mL de milieu 2YT contenant les antibiotiques appropriés avec le stock cellulaire co-transformé qui a le plasmide contenant tag (AmpR)et pEVOL-AckRS (ChlR) et se développer à 37 °C à OD = 0,6 (4-6 h).</li>
	<li>Ajouter les antibiotiques appropriés aux 1 L de milieu autoclavé de 2YT et inoculer avec la culture de démarrage de 20 mL. Cultiver à 37 °C à DO = 0,6-0,8 (2-3 h).</li>
	<li>Ajouter des agents inducteurs et de l’acétyllysine (AcK) aux concentrations finales d’IPTG 1 mM, d’arabinose à 0,2% et d’AcK 5 mM.</li>
	<li>Cultiver la culture à 37 °C pendant 6-8 h.</li>
	<li>Cellules granulées à 2 700 x g pendant 15 min.</li>
	<li>Conservez la pastille cellulaire à -80 °C pendant la nuit.</li>
	<li>À partir de cette étape, gardez l’échantillon sur la glace en tout temps. Dissoudre le culot cellulaire dans 50 mL de tampon de lyse histone par 1 L de culture.</li>
	<li>Soniquer selon le cycle suivant: 1 s on, 1 s off, total sur le temps: 3 min à 60% d’amplitude.</li>
	<li>Corps d’inclusion de granulés à 41 600 x g pendant 45 min.</li>
	<li>Jeter les corps d’inclusion surnageants et ressusciter dans 30 mL de tampon de lyse histone. L’inclusion de granulés est de 41 600 x g pendant 30 min.</li>
	<li>Jeter les corps d’inclusion surnageants et remises en suspension dans 30 mL de tampon de lavage de granulés. Corps d’inclusion de granulés à 41 600 x g pendant 30 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant et dissoudre les corps d’inclusion dans 25 mL de tampon de chlorhydrate de guanidine 6 M (GuHCl). Incuber avec agitation à 37 °C pendant 1 h. REMARQUE: Si nécessaire, les corps d’inclusion peuvent être incubés avec agitation pendant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>L’inclusion de granulés est de 41 600 x g pendant 45 min. Incuber le surnageant avec 1 mL de résine Ni-NTA équilibré avec un tampon GuHCl 6 M pendant 2 h.</li>
	<li>Procéder à la purification ni-NTA dans des conditions dénaturées. Lavez la colonne avec 3 volumes de colonne de tampon de lavage de colonne. Elute protéine acétylée d’histone avec 10 ml de tampon d’élution. REMARQUE: Tenter de concentrer la protéine ici est une option, mais les histones acétylées sont très imprévisibles et peuvent facilement précipiter. Il n’est pas recommandé de se concentrer au-delà de 2 mL en volume total.</li>
	<li>Dialysez abondamment la protéine d’histone acétylée contre 5% tampon d’acide acétique pour éliminer les sels. Dialyser pendant 3 h à la fois à 4 °C, en échangeant contre un tampon frais au moins 6 fois. REMARQUE: Pour une meilleure pureté des protéines, il existe une option pour dialyser contre l’eau pure. Cependant, cela provoque une précipitation importante et une réduction du rendement qui peuvent être indésirables pour les protéines histones acétylées à faible rendement.</li>
	<li>Aliquote et lyophiliser les protéines et conserver indéfiniment à -80 °C. Les protéines histones de type sauvage donnent généralement 10-50 mg/L tandis que les protéines histones acétylées donnent moins de 10 mg/L selon le site spécifique de lysine. Par exemple, le H3K79Ac est en moyenne de 5 mg/L.</li>
</ol>3. Expression de la protéine histone de type sauvage
<ol><li>Pour assembler des nucléosomes complets, exprimez les 4 protéines d’histones. Lors de l’expression et de la purification d’histones de type sauvage, le protocole est le même que les histones acétylées, sauf les suivantes:<ol>
<li>N’effectuez pas de co-transformation. N’utilisez pas pEVOL-AcKRS pour l’expression d’histones de type sauvage. Ajustez les antibiotiques en conséquence.</li>
		<li>N’utilisez pas de lignée cellulaire de délétion cobB et n’ajoutez pas de nicotinamide, d’acK ou d’arabinose pendant l’induction de l’expression cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Préparation de l’ADN 601
REMARQUE: Une séquence d’ADN optimisée précédemment conçue pour diriger le positionnement des nucléosomes est assemblée avec des octamères d’histones pour produire un mononoyau à haute efficacité. Cette séquence est appelée ADN 601 ou séquence de Widom. Cette séquence est devenue la séquence d’ADN standard pour les études in vitro de nucléosomes, des essais de remodelage de la chromatine aux mesures d’une seule molécule10.
<ol><li>Pour préparer des quantités importantes d’ADN 601 pour l’assemblage de nucléosomes, transformez pGEM-3z/601 en cellules Top 10 et cultivez 10 mL de culture pour l’amplification et l’extraction du plasmide. Utilisez une trousse d’extraction plasmidique et suivez les recommandations du fabricant.</li>
	<li>Utilisez une PFU polymérase exprimée interne (plus efficace) pour ce protocole d’amplification. Configurer une réaction PCR : Pour une réaction de 250 μL, utilisez 207,5 μL de MQ H2O autoclavé, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer : ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Reverse Primer : acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2,5 μL DFU enzyme. Nous exécutons généralement 60 réactions à la fois pour obtenir suffisamment d’ADN pour s’assembler.</li>
	<li>Utilisez une température de recuit de 52 °C pendant 30 s et un temps d’extension de 30 s si vous utilisez de la PFU polymérase. Sinon, suivez les conditions recommandées par les fabricants.</li>
	<li>Une fois la PCR terminée, utilisez une trousse de nettoyage par PCR de votre choix pour purifier le produit de PCR.</li>
</ol>5. Assemblage de l’octamère des histones
<ol><li>Dissoudre les aliquotes des pastilles de protéines histones H2A, H2B, H3 et H4 afin qu’il y ait un stock distinct de chaque protéine histone dans guHCl Buffer avec un volume total de 100 μL.</li>
	<li>Calculer la concentration de chaque protéine histone en mesurant l’absorbance A280.</li>
	<li>Si l’absorbance est supérieure à 1 pour n’importe quelle protéine, diluer avec le tampon GuHCl pour obtenir une concentration plus précise.</li>
	<li>Combiner les protéines H2A et H2B dans un rapport molaire de 1:1 et diluer pour atteindre une concentration totale en protéines de 4 μg/μL. Répéter pour H3 et H4.</li>
	<li>Dialyser séquentiellement à 4 °C contre un tampon 2 M TE pendant la nuit, un tampon 1 M TE pendant 2 h et un tampon TE 0,5 M pendant 5 h. REMARQUE: Les deuxième et troisième étapes de la dialyse provoquent des conformations instables de protéines à précipiter. On s’attend à de fortes précipitations à ces étapes.</li>
	<li>Éliminer les précipités par centrifugation à 16 800 x g à 4 °C.</li>
	<li>Encore une fois, calculer la concentration de dimères histones (mélange H2A/H2B) et de tétramères (mélange H3/H4) en mesurant l’absorbance A280.</li>
	<li>Mélanger les dimères et les tétramères dans un rapport molaire de 1:1 et ajuster NaCl à 2 M par l’ajout de NaCl solide.</li>
	<li>L’octamère histone peut être stocké à 4 °C et est plus stable que les dimères et les tétramères. Ne figez jamais l’octamère des histones car cela peut provoquer un démontage.</li>
	<li>Si vous assemblez avec des histones acétylées, remplacez simplement la protéine de type sauvage par la protéine acétylée dans la procédure.</li>
</ol>6. Assemblage de nucléosomes
<ol><li>Utilisez un tampon TE 100x et du NaCl solide pour ajuster l’ADN 601 au tampon 2M TE. Ajouter l’ADN 601 dans le tampon 2M TE à l’octamère des histones dans un rapport molaire de 0,85:1 à 0,90:1. Un rapport inférieur d’ADN peut être ajouté si l’ADN libre est présent dans l’analyse de gel shift.</li>
	<li>Transférer le mélange ADN-histone dans un sac de dialyse et placer dans environ 200 mL de tampon 2M TE (ou plus si l’assemblage de plusieurs échantillons) et remuer très doucement à 4 °C.</li>
	<li>Réglez une pompe péristaltique à purger pour qu’elle s’égoutte lentement dans aucun tampon de SEL TE. Lorsque le volume a à peu près doublé, versez la moitié du volume. Faites-le au moins 4 fois au total. Avec une pompe, cela peut prendre 4-8 h en fonction du volume de départ. Les nucléosomes se forment lorsque la concentration en sel est réduite à 150 mM (mesurée par salinitémètre).</li>
	<li>Une fois la concentration en sel réduite à 150 mM, dialysez-le contre un tampon TE de 20 mM pendant la nuit.</li>
	<li>Éliminer les précipités par centrifugation et mesurer la concentration des nucléosomes par lecture A260 à l’aide d’un lecteur de plaque.</li>
	<li>Ajouter la protéase His-TEV (TEV : nucléosome 1:30, w:w) et incuber pendant la nuit à 4 °C pour enlever toutes les étiquettes d’histidine. Éliminer les impuretés de l’étiquette histidine de la solution de nucléosome par la résine Ni-NTA tirer vers le bas.</li>
	<li>Pour positionner le nucléosome et homogénéiser l’échantillon, incuber à 60 °C pendant 1 h. REMARQUE: Pour les sites acétylés qui sont particulièrement instables, cette étape peut ne pas être conseillée.</li>
	<li>Conserver les nucléosomes à court terme (quelques semaines) à 4 °C.</li>
	<li>Pour le stockage à long terme, dialysez les nucléosomes contre le tampon de stockage et stockez-les à -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea%3A+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li>
<li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysyl-tRNA+synthetase%3A+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li>
<li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li>
<li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuins+1+and+2+are+universal+histone+deacetylases%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+to+reveal+Sirt6-targeted+histone+H3+sites+in+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes.</a> ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91(2008).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689(2017).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li>
<li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li>
<li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+DNA+sensing+pathways%3A+STING%2C+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li>
<li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGAS+produces+a+2%27-5%27-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li>
<li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+%5BG%282%27%2C5%27%29pA%283%27%2C5%27%29p%5D+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+PLPLRT%2FSD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li>
</ol>

Aucun des auteurs n’a d’intérêts financiers concurrents à déclarer.

Il est essentiel de suivre ce protocole dans les moindres détails lors d’une expérience. Les nucléosomes ne sont pas très stables et beaucoup d’essais et d’erreurs ont été consacrés à la détermination de ce protocole. Il est essentiel d’éliminer les précipités à chaque étape (ou chaque fois qu’elles sont observées), car les particules peuvent facilement interférer avec les processus d’assemblage. Gardez toujours les échantillons d’histones sur la glace. Si les nucléosomes sont stockés à 4 °C pendant trop longtemps, ils p...

Nous avons utilisé PylRS et tRNAPyl pour synthétiser et assembler des mononucléosomes reconstitués avec des histones acétylées spécifiques au site. PylRS s’est avéré inestimable en tant qu’outil d’expansion du code génétique pour produire des protéines avec des modifications post-traductionnelles (PTM) et a été génétiquement évolué pour incorporer environ 200 NCA différents. PylRS incorpore au codon ambré, éliminant la concurrence d’autres acides aminés pendant la traduction. PylRS a été découvert pour la première fois dans les archées méthanogènes, et a depuis été utilisé en biologie chimique pour incorporer de nouveaux groupes chimiques réactifs dans les protéines1,2.
MmAcKRS1 a été développé à partir de Methanosarcina mazei PylRS et fréquemment utilisé dans notre laboratoire pour la synthèse de protéines acétylées3,4,5,6. MmAcKRS1 délivre ack à un site de mutation ambrée dans l’ARNm de choix pendant la traduction dans Escherichia coli. Cette technique a été précédemment utilisée pour incorporer AcK aux sites de lysine K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 et K79 de l’histone H3 afin d’étudier l’activité de la sirtuine 1, 2, 6 et 7 sur les mononucléosomes acétylés4,5,6. Ici, nous détaillons cette méthode pour exprimer les histones acétylées et reconstituer les nucléosomes acétylés.

<table><tbody><tr><td>0,5 M Tampon TE</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0,5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr> 1 <tr><td>M Tampon TE</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>100x TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>2 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>20 mM TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>6 M GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M chlorure de guanidinium, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,0</td></tr> Tampon de lavage sur colonne <tr><td>d’acétyllysine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>NA</td><td></td><td>NA 6 M urée, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7,8</td></tr><tr><td>Tampon à élution</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp ; Pompe de transfert de produits chimiques à débit variable</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>Protéase</td><td></td><td></td><td></td>His-TEV</tr><tr><td>Tampon de lyse des histones</td><td>NA</td><td></td><td>NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5 % Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8,0</td></tr><tr><td>Résine</td><td></td><td></td> Ni-NTA <td>6 M urée, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7,8</td></tr><tr><td>Kit de nettoyage PCR</td><td>Epoch Life</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lavage des granulés</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de stockage</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 % glycérol, pH 7,8</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acétylation spécifique de la lysine des histones pour la reconstitution des nucléosomes à l’aide de l’expansion du code génétique chez escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Les protéines histones acétylées peuvent être facilement exprimées dans Escherichia coli codant pour un mutant, Nε-acétyl-lysine (AcK)-methanosarcina mazi pyrrolysine ARNt-synthétase (MmAcKRS1) et son ARNt apparenté (ARNtPyl)pour assembler des mononucléosomes reconstitués avec des histones acétylées spécifiques au site. MmAcKRS1 et tRNAPyl délivrent AcK à un emplacement ambré de mutation dans l’ARNm de choix pendant la traduction dans Escherichia coli. Cette technique a été largement utilisée pour incorporer AcK aux sites de lysine H3. La pyrrolysyl-ARNt synthétase (PylRS) peut également être facilement évoluée pour incorporer d’autres acides aminés non canoniques (NCAAs) pour la modification ou la fonctionnalisation des protéines spécifiques au site. Ici, nous détaillons une méthode pour incorporer AcK en utilisant le système MmAcKRS1 dans l’histone H3 et intégrer les protéines H3 acétylées dans les mononucléosomes reconstitués. Les mononucléosomes reconstitués acétylés peuvent être utilisés dans les tests biochimiques et de liaison, la détermination de la structure, etc. L’obtention de mononucléosomes modifiés est cruciale pour concevoir des expériences liées à la découverte de nouvelles interactions et à la compréhension de l’épigénétique.

Les dimères, les tétramères et les octamères peuvent être évalués en exécutant un gel PAGE SDS à 12 %(figure 1 et figure 2). Ici, vous pouvez voir que certains des tétramères acétylés ont un rendement inférieur à d’autres (Figure 1). En fait, plus on se rapproche de la région centrale, plus le rendement observé est faible. Cela est probablement dû à l’acétylation interférant avec l’assemblage du tétr...

Nous présentons ici une méthode pour exprimer les protéines histones acétylées en utilisant l’expansion du code génétique et assembler des nucléosomes reconstitués in vitro.

Acétylation spécifique de la lysine des histones pour la reconstitution des nucléosomes à l’aide de l’expansion du code génétique chez Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

L’obtention de mononucléosomes modifiés est cruciale pour la conception d’expériences épigénétiques. Notre protocole fournit des mononucléosomes reconstitués acétylés qui peuvent être utilisés dans des tests biochimiques et de liaison, la détermination de la structure, etc. Le premier avantage de notre technique est sa polyvalence.Ce système peut être facilement modifié pour incorporer de nombreux types de modifications dans les mononucléosomes. Commencez par préparer un litre de milieu autoclavé 2YT dans une fiole de culture. Inoculez 20 millilitres de milieu contenant des antibiotiques appropriés avec le stock cellulaire co-transformé qui a l’étiquette contenant le plasmide et le pEVOL-AckRS et cultivez-les à 37 degrés Celsius pour obtenir une DO de 0,6.Ajoutez des antibiotiques appropriés dans un litre de milieu 2YT autoclavé et inoculez-le avec 20 millilitres de culture de démarrage. Cultivez la culture à 37 degrés Celsius pendant deux à trois heures pour obtenir une DO de 0,6, 2,8. Ajouter des agents inducteurs et de l’AcK pour obtenir une concentration finale d’un IPTG millimolaire, de 0,2 % d’arabinose et de cinq millimolaires d’AcK.Cultivez la culture à 37 degrés Celsius pendant six à huit heures. Ensuite, granulez les cellules à 2 700 x g pendant 15 minutes et stockez-les pendant la nuit à moins 80 degrés Celsius. Dissoudre la pastille dans 50 millilitres de tampon de lyse des histones par litre de culture et sonicer les cellules à 60 % d’amplitude pendant trois minutes avec des intervalles d’une seconde et d’une seconde.Corps d’inclusion de granulés à 41, 600 x g pendant 45 minutes. Jetez le surnageant, puis remettez en suspension les corps d’inclusion dans 30 millilitres de tampon de lyse des histones, puis centrifugez à nouveau pendant 30 minutes. Remettez à nouveau en suspension les corps d’inclusion dans 30 millilitres de tampon de lavage des granulés et répétez la centrifugation.Ensuite, dissoudre les corps d’inclusion dans 25 millilitres de tampon de chlorhydrate de guanidine à six molaires. Incuber avec agitation à 37 degrés pendant une heure, puis centrifuger pendant 45 minutes. Incuber le surnageant avec un millilitre de résine nickle-NTA équilibrée avec un tampon de chlorhydrate de guanidinium à six molaires pendant deux heures et procéder à la purification du nickle-NTA dans des conditions dénaturées.Lavez la colonne avec trois volumes de tampon de lavage, puis éluez la protéine histone acétylée avec 10 millilitres de tampon d’élution. Dialysez la protéine d’histones acétylée contre un tampon d’acide acétique à 5 % pour éliminer les sels pendant trois heures à quatre degrés Celsius, en changeant le tampon au moins six fois. Aliquote et lipolyze et stocké indéfiniment à moins 80 degrés.Dissoudre les aliquotes des pastilles de protéines d’histones H2A, H2B, H3 et H4 afin qu’il y ait un stock séparé de chaque protéine d’histones dans un tampon de chlorhydrate de guanidinium pour un volume total de 100 microlitres. Calculez la concentration de chaque protéine d’histones en mesurant les absorbants à 280 nanomètres. Si l’absorbance est supérieure à un pour une protéine, diluer avec un tampon de chlorhydrate de guanidinium pour obtenir une concentration plus précise.Combinez H2A avec des protéines H2B et H3 avec des protéines H4 dans un rapport molaire de un pour un et diluez à une concentration totale de protéines de quatre microgrammes par microlitre. Dialyser séquentiellement à quatre degrés Celsius contre deux tampons TE molaires pendant la nuit, un tampon TE molaire pendant deux heures et un tampon TE 0,5 molaire pendant cinq heures. Une fois terminé, centrifuger à 16, 800 x g à quatre degrés Celsius pour éliminer le précipité.Calculez la concentration des dimères d’histones et des tétramères en mesurant l’absorbance à 280 nanomètres. Mélangez les dimères et les tétramères à un rapport molaire de un à un et ajustez la concentration de chlorure de sodium à 2M. Ajustez l’ADN 601 à un tampon TE à deux molaires à l’aide d’un tampon TE 100X et de chlorure de sodium solide.Ajoutez la solution à l’octamère d’histones à un rapport molaire de 0,85, 2,9 à un. Transférez le mélange d’histones d’ADN dans un sac de dialyse et placez-le à environ 200 millilitres de tampon TE à deux molaires en agitant très doucement à quatre degrés Celsius. Installez la pompe péristaltique pour qu’elle s’égoutte lentement dans un tampon TE sans sel.Lorsque le volume a à peu près doublé, versez la moitié du volume. Faites-le au moins quatre fois, ce qui peut prendre de quatre à huit heures selon le volume de départ. Une fois que la concentration en sel est réduite à 150 millimolaires, dialysez pendant la nuit avec un tampon TE de 20 millimolaires.Éliminer les précipités par centrifugation et mesurer la concentration des nucléosomes à l’aide d’un lecteur de plaques. Ajoutez la protéase his-TEV et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius pour éliminer toutes les étiquettes d’histidine. Retirez ensuite les impuretés de l’étiquette histidine de la solution de nucléosome avec la résine nickel-NTA tirée vers le bas.Incuber à 60 degrés Celsius pendant une heure pour positionner le nucléosome et homogénéiser l’échantillon. Stockez les nucléosomes à quatre degrés Celsius à court terme. Pour un stockage à long terme, dialysez les nucléosomes contre le tampon de stockage et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.Certains tétramères acétylés avaient un rendement inférieur à d’autres, comme évalué par l’application d’un gel SDS-PAGE à 12 %. Plus on se rapproche de la région centrale, plus le rendement observé est faible. Cela était probablement dû à l’acétylation, qui interférait avec l’ensemble de l’octamère.Après avoir assemblé des octamères avec la séquence d’ADN 601, le nucléosome peut être évalué à l’aide d’un gel PAGE natif TBE-5 %1X, suivi d’une coloration au bromure d’éthidium. Avant le positionnement thermique, les bandes de nucléosomes observées sont très larges et peuvent être striées. Lors de l’exécution de ce protocole, gardez les protéines sur de la glace à tout moment.Il est crucial de maintenir les dimères, les tétramères et les nucléosomes assemblés. Cette procédure a permis aux chercheurs d’installer les sites acétyllysine, en particulier dans les mononucléosomes, ouvrant la porte à l’étude des modifications post-traductionnelles dans un contexte chromainien. Il peut être facilement adapté pour installer n’importe quel nombre d’acides aminés non canoniques.

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