Name: Génération d’équivalents de peau humaine vascularisée auto-assemblés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Découvrez la génération d'équivalents de peau humaine vascularisée pour l'ingénierie tissulaire. Cette méthode permet la construction de modèles cutanés physiologiquement pertinents pour étudier les maladies, le vieillissement et la médecine personnalisée.

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Les auteurs remercient le Dr Jim Rheinwald59 et le Dr Ellen H. van den Bogaard20 pour leur généreux don de lignées cellulaires N/TERT. Ce travail a été soutenu par l’American Heart Association (19IPLOI34760636).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole a démontré une méthode simple et reproductible pour la génération de VHSEs et leur analyse tridimensionnelle. Il est important de faire en sorte que cette méthode repose sur quelques techniques ou pièces d’équipement spécialisées, ce qui la rend accessible à une gamme de laboratoires. De plus, les types de cellules peuvent être remplacés par des changements limités dans le protocole, ce qui permet aux chercheurs d’adapter ce protocole à leurs besoins spécifiques.
La gélification appropriée du collagène est une étape difficile dans l’établissement de la culture de la peau. Surtout lors de l’utilisation de préparations brutes sans purification, des contaminants traces pourraient influencer le processus de gélification. Pour aider à assurer la cohérence, des groupes d’expériences doivent être effectués avec le même stock de collagène qui sera utilisé pour la génération de VHSE. De plus, la gélification devrait idéalement se produire à un pH de 7-7,4, et les contaminants traces peuvent modifier le pH. Avant d’utiliser un stock de collagène, un gel acellulaire de pratique doit être fabriqué à la concentration souhaitée et le pH doit être mesuré avant la gélification. L’achèvement de ce contrôle de qualité du collagène avant de commencer l’ensemencement des composants cutanés permettra d’identifier les problèmes de gélification et d’homogénéité du collagène avant de mettre en place une expérience complète. Au lieu d’ensemencer du collagène acellulaire directement sur un insert de culture, ensemencez du collagène sur une bande de pH qui évalue toute l’échelle de pH et vérifie un pH de 7-7,4. La gélification peut être évaluée en appliquant une gouttelette de la solution de gel de collagène sur une plaque de couverture ou une plaque de puits en plastique de culture tissulaire (une plaque de puits est recommandée pour simuler les côtés confinés d’un insert de culture). Après le temps de gélification, le collagène doit être solide, c’est-à-dire qu’il ne doit pas s’écouler lorsque la plaque est inclinée. Sous microscopie à contraste de phase, le collagène doit être homogène et clair. Les bulles occasionnelles de l’ensemencement de collagène sont normales mais de grandes gouttes amorphes de collagène opaque dans le gel clair indiquent un problème-probable dû au mélange insuffisant, au pH erroné, et/ou au manque de garder le collagène refroidi pendant le mélange.
Les quantités d’ensemencement cellulaire et les milieux peuvent être ajustés. Dans le protocole ci-dessus, les quantités de cellules encapsulées ont été optimisées pour un insert de 12 puits à 7,5 x10 4 fibroblastes et 7,5 x10 5 cellules endothéliales par mL de collagène avec 1,7 x 105 kératinocytes ensemencés sur le dessus de la construction cutanée. Les densités cellulaires ont été optimisées pour ce protocole VHSE sur la base des études préliminaires et des recherches précédentes portant sur la génération de réseaux vasculaires 3D dans diverses concentrations de collagène48 et la génération HSE22,80,81. Dans des systèmes similaires, les densités cellulaires endothéliales publiées sont de 1,0 x 106 cellules/mL de collagène48; les concentrations en fibroblastes vont souvent de 0,4 x10 5 cellules/mL de collagène22,28,82 à 1 x 105 cellules/mL de collagène8,58,83,84,85; et les concentrations de kératinocytes vont de 0,5 x 105 [cellules/cm2]80 à 1 x 105 [cellules/cm2]8. Les densités cellulaires peuvent être optimisées pour des cellules spécifiques et des questions de recherche. Les cultures tridimensionnelles avec des cellules contractiles, telles que les fibroblastes, peuvent se contracter conduisant à une réduction de la viabilité et à une perte de culture86,87. Des expériences préliminaires doivent être réalisées pour tester la contraction du compartiment cutané (qui peut se produire avec plus de cellules cutanées, plus de cellules cutanées contractiles, des cultures de submersion plus longues ou des matrices plus douces) et pour tester la couverture de surface épidermique. En outre, le nombre de jours dans la submersion et le taux de réduction progressive de la teneur en sérum peuvent également être personnalisés si une contraction cutanée excessive se produit ou si un taux différent de couverture des kératinocytes est requis. Par exemple, si une contraction est remarquée pendant la période de submersion cutanée ou pendant que les kératinocytes établissent une monocouche de surface, se déplacer plus rapidement dans le processus de rétrécissement du sérum et augmenter les VHSEs à ALI peut aider à prévenir une contraction supplémentaire. De même, si l’assurance de keratinocyte n’est pas idéale, changer le nombre de jours que le VHSE est submergé sans sérum peut aider à augmenter la couverture épidermique de monocouche et atténuer la contraction puisque le sérum est laissé de court. Les changements dans les densités cellulaires ou d’autres suggestions ci-dessus doivent être optimisés pour les cultures et les objectifs de recherche spécifiques.
Pour établir une stratification appropriée de l’épiderme pendant la période d’interface air-liquide (AAA), il est essentiel de vérifier et de maintenir régulièrement les niveaux de liquide dans chaque puits afin que l’ALI et l’hydratation appropriée de chaque construction soient conservées tout au long de la culture. Les niveaux de média doivent être vérifiés et suivis quotidiennement jusqu’à ce que des niveaux d’AAA cohérents soient établis. La couche épidermique doit avoir l’air hydratée, pas sèche, mais il ne doit pas y avoir de piscines de milieux sur la construction. Pendant ALI, la construction développera une couleur opaque blanc / jaune qui est normale. La couche épidermique se développera probablement de manière inégale. Généralement, les VHSEs sont inclinés en raison de l’ensemencement du collagène ou de la contraction cutanée. Il est également normal d’observer une partie épidermique plus élevée au milieu de la construction dans des constructions plus petites (taille de 24 puits) et une formation de crête autour du périmètre du VHSE dans la taille de 12 puits. La contraction des constructions13 peut modifier ces formations topographiques, et/ou ne peut pas être observée du tout.
La coloration et l’imagerie des VHSEs introduisent la manipulation mécanique aux VHSEs. Il est très important de planifier et de limiter la manipulation de chaque culture. Lorsque la manipulation est nécessaire, maintenir des mouvements doux lors de l’élimination des ECHSE des membranes d’insertion, lors de l’ajout de solutions de coloration ou de lavage à la surface de construction, et lors du retrait et du remplacement des VHSE dans leurs puits de stockage / d’imagerie pendant la préparation de l’imagerie. Plus précisément, les couches apicales du composant épidermique peuvent être fragiles et risquent de s’écasser des couches épidermiques basales. Les couches apicales de l’épiderme sont fragiles et passent par la desquamation même dans les tissus natifs4, mais pour une analyse précise de la structure épidermique, il est important de minimiser les dommages ou la perte. Si les couches épidermiques soulèvent la construction, elles peuvent être es imageées séparément. Les couches basales de l’épiderme sont très probablement encore attachées au derme tandis que des parties des couches apicales peuvent se détacher. Pour la visualisation de l’épiderme, une tache nucléaire est utile en observant ceci puisque les noyaux denses sont une caractéristique des couches inférieures et moyennes de l’épiderme.
L’imagerie confocale du VHSE post-fixation a été discutée dans le protocole, mais il est également possible d’imager les VHSEs dans toute la culture via la tomographie par cohérence optique à base verticale (OCT)88,89,90,91,92,93. Les VHSE sont suffisamment stables pour résister à l’imagerie sans incubation ni humidification pendant au moins deux heures sans effets notables. Comme l’OCT est sans étiquette et non invasif, il est possible de suivre l’épaisseur épidermique pendant la maturation. D’autres modalités non envahissantes de formation image peuvent probablement être employées aussi bien.
L’imagerie volumétrique des structures cutanées et épidermiques combinées peut être due provocante à l’atténuation laser plus profonde dans le VHSE. Cela peut être atténué par l’imagerie de la construction en deux orientations, du côté épidermique (Figure 1) et du côté cutané (Figure 2), permettant une bonne résolution des structures vasculaires cutanées et de l’épiderme. De plus, l’échantillon peut être effacé, ce qui permet des images volumétriques de l’ensemble de la structure avec une atténuation minimale. Plusieurs méthodes de compensation ont été essayées, cependant, la méthode de méthanol/salicylate de méthyle décrite a donné les meilleurs résultats. Les chercheurs intéressés par l’optimisation d’autres méthodes de compensation sont dirigés vers ces revues49,61,62. En cas de nettoyage, il est suggéré d’imager complètement l’échantillon avant le nettoyage, car la méthode peut endommager les fluorophores et / ou la structure. De plus, l’imagerie doit être terminée dès que possible après la clairière, car la fluorescence peut s’estomper en quelques jours.
Pour des raisons de simplicité et d’accessibilité, ce protocole a utilisé les mélanges de médias les plus simples trouvés dans la littérature précédente11,80. Bien qu’il existe de nombreux avantages à utiliser des mélanges de médias simples, les limites de ce choix sont également reconnues. D’autres groupes ont étudié les effets de composants de milieux spécifiques sur la santé épidermique et cutanée et ont constaté que d’autres additifs de milieux94,tels que les acides gras libres externes/lipides, améliorent la couche cornée de l’épiderme et améliorent la fonction barrière cutanée. Bien que nos marqueurs immunofluorescents montrent la différenciation et la stratification appropriées dans l’épiderme, selon les études menées, l’optimisation supplémentaire de médias peut être nécessaire. De plus, une analyse étendue de la nomenclature épidermique n’a pas été conduite en évaluant les VHSEs présentés ici. L’intégrité du BM est une indication importante des équivalents cutanés; divers groupes ont effectué des recherches sur la durée de culture et son effet sur les marquages BM95 ainsi que l’analyse de la présence de fibroblastes et des effets de facteur de croissance ajoutés sur l’expression BM14. Il est important de noter que l’analyse de la composante BM doit être évaluée et optimisée lors de l’utilisation de ce protocole.
Dans ce protocole est décrit une procédure pour la génération de VHSE, démontrant des résultats après 8 semaines à ALI. Les cultures VHSE ont été cultivées jusqu’à 12 semaines à ALI sans changement notable ou perte de viabilité, et il est possible qu’elles soient viables plus longtemps. D’une manière primordiale, ce protocole est facilement adaptable aux types de cellules couramment disponibles, comme démontré par le remplacement des fibroblastes cutanés par des fibroblastes de poumon IMR90. Selon les besoins du chercheur et les ressources disponibles, les types de cellules et les mélanges de milieux sur la culture peuvent être ajustés, bien que des types de cellules plus différents puissent nécessiter une optimisation des milieux. En résumé, ces procédures sont destinées à fournir des éclaircissements sur la culture des VHSEs pour l’étude de la biologie et de la maladie de la peau. Pour maximiser l’accessibilité, le protocole a été développé en utilisant cet équipement, des lignées cellulaires et des réactifs communs comme une approche minimale efficace qui peut être davantage adaptée aux besoins spécifiques des études de recherche.

La peau humaine remplit de nombreuses fonctions biologiques essentielles, notamment agir comme une barrière immunitaire / mécanique, réguler la température corporelle, participer à la rétention d’eau et aux rôles sensoriels1,2,3,4. Anatomiquement, la peau est le plus grand organe du corps humain et est composée de trois couches principales (épiderme, derme et hypoderme) et possède un système complexe de composants stromaux, vasculaires, glandulaires et du système immunitaire / nerveux en plus des cellules épidermiques. L’épiderme lui-même est composé de quatre couches de cellules qui sont continuellement renouvelées pour maintenir la fonction barrière et d’autres structures de la peau native (c.-à-d. sueur et glandes sébacées, ongles)3. La physiologie de la peau est importante dans la fonction immunitaire, la cicatrisation des plaies, la biologie du cancer et d’autres domaines, ce qui conduit les chercheurs à utiliser un large éventail de modèles, des monocultures in vitro aux modèles animaux in vivo. Les modèles animaux offrent la possibilité d’étudier toute la complexité de la physiologie de la peau, cependant, les modèles animaux couramment utilisés tels que les souris ont des différences physiologiques significatives par rapport aux humains5. Ces limites, et l’augmentation du coût des modèles animaux, ont conduit de nombreux chercheurs à se concentrer sur le développement de modèles in vitro qui reflètent plus fidèlement la physiologie de la peau humaine1,6. Parmi ceux-ci, l’un des types de modèles les plus simples est l’équivalent épidermique humain (HEE; également appelé modèles de peau de demi-épaisseur) qui sont composés uniquement de kératinocytes épidermiques sur une matrice cutanée acellulaire, mais capturent la différenciation et la stratification épidermiques observées in vivo. Sur cette base, les modèles contenant des composants cutanés et épidermiques (kératinocytes et fibroblastes) sont souvent appelés équivalents de peau humaine (HSE), modèles de peau pleine épaisseur ou constructions de peau organotypiques (OSC). En bref, ces modèles sont générés en encapsulant des cellules dermiques dans des matrices de gel et en semant des cellules épidermiques sur le dessus. La différenciation et la stratification épidermiques peuvent alors être obtenues par l’intermédiaire de milieux spécialisés et d’une exposition à l’air7. Des équivalents cutanés ont le plus souvent été générés par des techniques d’auto-assemblage utilisant des gels cutanés en collagène de type I (soit de queue de rat, soit d’origine bovine)1,8,mais des modèles similaires ont incorporé d’autres composants matriciels tels que la fibrine9,10,les fibroblastes dérivés11,12,les membranes dé-épidermisées cadavériques13, 14,15,16,les gels disponibles dans le commerce et autres1,12,13,17,18,19. Actuellement, il existe des équivalents de peau disponibles dans le commerce (comme précédemment examiné1,2). Cependant, ceux-ci sont principalement développés à des fins thérapeutiques et ne peuvent pas être facilement adaptés à des questions de recherche spécifiques.
Les HSE ont été appliquées dans des études de cicatrisation des plaies, de greffage, de toxicologie et de maladies/développements de la peau11,12, 13,16,8,20,21,22,23. Bien que la culture 3D modélise de manière plus complète les fonctions des tissus humains par rapport aux cultures 2D24,l’inclusion de divers types de cellules qui reflètent plus précisément la population in vivo permet des études de coordination cellule-cellule dans des tissus complexes24,25,26. La plupart des HSE ne comprennent que des fibroblastes cutanés et des kératinocytes épidermiques27, bien que l’environnement cutané in vivo comprenne de nombreux autres types de cellules. Des études récentes ont commencé à inclure plus de populations cellulaires; ceux-ci comprennent les cellules endothéliales dans la vascularisation10,28,29,30,31,32,33,34,les adipocytes dans le tissu sous-cutané35,36,les composants nerveux19,21,les cellules souches27,37,38,les cellules immunitaires10,39,40,41,42,et d’autres modèles spécifiques à la maladie / cancer16,40,43,44,45,46,47. La vascularisation est particulièrement importante parmi ceux-ci; alors que certains HSEs incluent des cellules vasculaires, dans l’ensemble, ils manquent encore d’éléments capillaires complets avec une connectivité à travers l’ensemble du derme10,29, stabilité in vitro étendue28,et densité appropriée des vaisseaux. De plus, les modèles HSE sont généralement évalués par sectionnement histologique post-culture qui limite l’analyse de la structure tridimensionnelle des HSE. L’analyse tridimensionnelle tient compte de l’évaluation volumétrique de la densité vasculaire48,49 aussi bien que de la variation régionale de l’épaisseur épidermique et de la différenciation.
Bien que les HSE soient l’un des modèles organotypiques les plus courants, la génération de ces constructions comporte de nombreux défis techniques, notamment l’identification de la matrice extracellulaire appropriée et des densités cellulaires, les recettes des milieux, les procédures d’interface air-liquide appropriées et l’analyse post-culture. De plus, bien que les modèles HEE et HSE aient publié des protocoles, il n’existe pas de protocole détaillé intégrant la vascularisation cutanée et l’imagerie volumétrique plutôt qu’une analyse histologique. Ce travail présente un protocole accessible pour la culture d’équivalents cutanés humains vascularisés (VHSE) à partir de lignées cellulaires principalement commerciales. Ce protocole est écrit pour être facilement personnalisable, permettant une adaptation simple aux différents types de cellules et besoins de recherche. Dans l’intérêt de l’accessibilité, de la disponibilité et du coût, l’utilisation de produits et de techniques de génération simples a été prioritaire par rapport à l’utilisation de produits disponibles dans le commerce. De plus, on décrit des méthodes volumétriques simples d’imagerie et de quantification qui permettent d’évaluer la structure tridimensionnelle du VHSE. Traduire cette procédure en un protocole robuste et accessible permet aux chercheurs non spécialisés d’appliquer ces modèles importants à la médecine personnalisée, à l’ingénierie tissulaire vascularisée, au développement de greffes et à l’évaluation de médicaments.

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-100</td> <td>(Dilué à partir de stock de laboratoire)</td></tr><tr><td>4 % Paraformaldéhyde</td><td>ACROS Organics</td><td>#41678-5000, Lot # B0143461</td><td>Composé à l’aide de paraformaldéhyde solide dans PBS, pH ajusté à 6,9</td></tr><tr><td>Pince autoclavée</td><td>Outils de science fine</td><td>#11295-00</td><td>Dumont #5 Pince</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher bioréactifs</td><td>Cat # BP510-250, Lot # 190231</td><td>Rnase, Dnase, Lignée cellulaire sans protéase</td></tr><tr><td>, Endothéliale : Cellule endothéliale microvasculaire (HMEC1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>SV40 Cellule endothéliale microvasculaire immortalisée. A noter que 750 000 cellules/ml de collagène ont été utilisées.</td></tr><tr><td>Lignée cellulaire, Fibroblastes : dermique Fibroblaste humain, adulte</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>Cellules dermiques primaires. Notons que 75 000 cellules/ml de collagène ont été utilisées.</td></tr><tr><td>Lignée cellulaire, Fibroblastes : firbroblaste pulmonaire humain (IMR90)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Cellules embryonnaires primaires. Notons que 75 000 cellules/ml de collagène ont été utilisées.</td></tr><tr><td>Lignée cellulaire, kératinocytes : N/TERT-1</td><td></td><td></td><td>Immortalisé par l’expression de hTERT. N/TERT-1 a été fabriqué à l’aide d’un vecteur rétroviral conférant une résistance à l’hygromycine. Lignée cellulaire établie par Dickson et al. 2000. Peut être remplacé par ATCC PCS-200-010 ou PCS-200-011. Notez que 170 000 cellules ont été utilisées par construction ; Les cellules N/TERT1 doivent être utilisées à partir de plaques confluentes à 30 % - deux boîtes de culture tissulaire de 90 mm à 30 % confluentes donnent plus qu’assez de cellules. Les auteurs remercient le Dr Jim Rheinwald et la Dre Ellen H. van den Bogaard pour leur généreux don de lignées cellulaires N/TENT.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific ; Sorvall Legend X1R</td><td></td><td>(équipement de laboratoire standard)</td></tr><tr><td>Logiciel de calcul</td><td>MATLAB</td><td>MATLAB 2020a</td><td>MathWorks, Natick, MA.</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica TCS SPEII confocal</td><td></td><td>Balayage laser confocal. Peut être remplacé par d’autres confocaux ou la microscopie à déconvolution.</td></tr><tr><td>Verre de couverture (22 x 22)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545F</td><td>0.13-0.17 mm No.1 Epaisseur</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate super colle ou graisse silicone</td><td>Glue Masters</td><td>#THI0102</td><td>Glue Masters, THICK, Instant Glue, Cyanoacrylate ; la super colle est la</td></tr><tr><td>base de média DMEM</td> préférée <td>Corning ; Mediatech, Inc</td><td>REF # 10-013-CM ; Lot # 26119007</td><td>DMEM, 1X (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) avec 4,5 g/L de glucose, L-glutamine et pyruvate de sodium</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 50/50</td><td>Corning ; Mediatech, Inc</td><td>REF # 10-090-CV ; Lot # 21119006</td><td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco’s Mod. Of Eagle’s Medium/Ham’s F12 50/50 Mix) avec L-glutamine</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>#V1101</td><td>(réactif de laboratoire standard)</td></tr><tr><td>Sérum fœtal</td><td>bovin Fisher Scientific</td><td>Cat # FB12999102, Lot # AE29451050</td><td>Sérum de bovin fœtal de qualité recherche, Triple 0,1 um stérile filtré</td></tr><tr><td>Pince à pointe fine</td><td>Outils de science fine</td><td>#11295-00</td><td>Dumont #5 pince</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique humain (FEM)</td><td>Peprotech</td><td>Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218</td><td>Composé de 0,1 % BSA dans PBS</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Alpha Easar</td><td>Lot # 5002F2A</td><td>composé de DMSO</td></tr><tr><td>Insuline (humaine)</td><td>Peprotech</td><td>Lot # 9352621</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à contraste de lumière/de phase inversé</td><td>VWR</td><td>76317-470</td> <td>(équipement de laboratoire standard)</td></tr><tr><td>Isoprotérénol</td><td>Alfa Aesar</td><td>#AAJ6178806</td><td>chlorhydrate de DL-isoprotérénol, 98 %</td></tr> <tr><td>kératinocytes-SFM (1x) base médiale</td><td>Gibco ; Life Technologies Corporation</td><td>REF # : 10724-011 ; Lot # 2085518</td><td>Kératinocyte-SFM (1X) ; sérum libre</td></tr><tr><td>moyen Acide L-ascorbique</td><td>Fisher Chemical</td><td>Cat # A61-100, Lot # 181977, CAS # 50-81-7</td><td>Cristallin. L’acide L-ascorbique peut également être acheté sous forme de sel</td></tr><tr><td>L-glutamine (solide)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>CAT # BP379-100, LOT # 172183, CAS # 56-85-9</td><td>L-Glutamine, cristaux blancs ou poudre cristalline</td></tr><tr><td>MCDB 131 base de média</td><td>Gen Depot</td><td>CM034-050, Lot # 03062021</td><td>MCDB 131 Base moyenne, sans L-Glutamine, stérile filtré</td></tr><tr><td>Poinçons métalliques</td><td>Sona Enterprises (SE)</td><td>791LP, 12PC</td><td>Jeu de poinçons en cuir creux, acier à haute teneur en carbone, dureté : 48HRC ; (différentes tailles, y compris) : 1/8 », 5/32 », 3/16 », 7/32 », 1/4 », 9/32 », 5/16 », 3/4 », 7/16 », 1/2 », 5/8 :, 3/4 ». Cet ensemble de poinçons est utile, mais le couteau x-acto peut également fonctionner. La taille du poinçon métallique qui fonctionne bien pour le transwell VHSE à 12 puits est de 3/8 » ou 1/2</td></tr> ».<tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>CAS # 67-56-1</td> <td>(facultatif). Pour éliminer l’étape de déshydratation.</td></tr><tr><td>salicylate de méthyle</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3695-500 ; Lot # 164535 ; CAS # 119-36-8</td> <td>(facultatif). Pour le déblaiement.</td></tr><tr><td>Microtubes, 1,7 mL</td><td>Genesee Scientific Corporation ; Olympus Plastics</td><td>Chat # 24-282 ; Lot # 19467</td><td>Microtubes de 1,7 ml, transparent ; Résistant à l’ébullition, polypropulène, certifié Rnase, Dnase, ADN, inhibiteur de PCR et PBS sans endotoxines</td></tr><tr><td>, 10x Qualité Culture ou autoclavé</td><td>Produits APEX Bioresearch</td><td>Cat # 20-134, Lot # 202237</td><td>Tampon PBS, 10x Dry Pack ; ajoutez le contenu de l’emballage dans le récipient et ajoutez de l’eau à 1 litre pour produire 10x concentré.</td></tr><tr><td>PBS, 1x Qualité de culture, (-) Calcium, (-) magnésium</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Réf. # 25-508 ; Lot # 07171015</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>produits APEX Bioresearch</td> de qualité non culture <td>Chat # 20-134, lot # 202237</td><td>tampon PBS, 10x emballage sec ; ajoutez le contenu de l’emballage dans le récipient et ajoutez de l’eau à 1 litre pour produire 10x concentré. Diluer à 1x avec de l’eau.</td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco ; Life Technologies Corporation</td><td>Ref # 15140-122, Lot # 2199839</td><td>Pen Strep (10 000 unités/ml de pénicilline ; 10 000 ug/mL de streptomycine)</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, verre, petite</td><td>Corning</td><td>PYREX 316060</td> <td>(facultatif). À utiliser comme récipient de nettoyage</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri, 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Utiliser pour la préparation de PDMS.</td></tr><tr><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, lot # H04719H035</td><td>Sylgard 184 Base en élastomère de silicone, Dow Corning, Midland, MI)</td></tr><tr><td></td><td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, Lot # H047JC4003</td><td>DOWSIL 184, Agent de durcissement en élastomère de silicone</td></tr><td colspan="4">Remarque : Le PDMS est généralement vendu sous forme de kit qui comprend à la fois les composants de base et d’agent de durcissement.<tr></td></tr><tr><td>Pipettes à déplacement positif (1000 & 250 uL)</td><td>Gilson</td><td>1000 uL : HM05136, M1000. 250 uL : T12269L</td><td>capacité de pipette M1000 (100-1000 uL) ; Capacité de pipette M250 jusqu’à 250 μL</td></tr><tr><td>Pointes/pistons à déplacement positif (1000 et 250 μL)</td><td>Gilson</td><td>1000 uL : CAT # F148180, BATCH # B01292902S ; 250 uL : CAT # F148114, BATCH # B05549718S</td><td>Capillars et pistons stérilisés</td></tr><tr><td>Pelle</td><td></td><td></td> à bout rond <td>(en option ; équipement de laboratoire standard) Pour la manipulation des VHSE avant l’imagerie</td></tr><tr><td>Suppléments pour les milieux</td> <td>kératinocytes-SFMGibco ; Life Technologies Corporation</td><td>Réf # 37000-015, Lot # 2154180</td><td>Contient EGF Humain Recombinant (Chat # 10450-013), Extrait hypophysaire bovin (Chat # 13028-014)</td></tr><tr><td>Inserts de plaque de culture tissulaire, taille 12 puits, 3 & micro ; taille des pores de</td><td>Corning ; Costar</td><td>REF # 3462 - Clair ; Lot # 14919057</td><td>Transwell ; Inserts de 12 mm de diamètre, pores de 3,0 μm, traités par culture tissulaire, membrane en polyester, plaques de polystyrène, etc.</td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire, taille 12 puits</td><td>Greiner Bio-one ; CellStar</td><td>Chat # 665 180 ; Lot # E18103QT</td><td>Plaque de culture cellulaire à 12 puits ; stérile, avec couvercle ; les produits sont stériles, exempts de Dnase, de Rnase, d’ADN humain et de pyrogènes détectables. Contenu Plaques</td></tr> de <tr><td>culture tissulaire non cytotoxiques, 60,8 cm^2 surface de croissance</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Cat # 25-202 ; No de lot : 191218-177B</td><td>Boîtes de culture tissulaire ; traitées, surface de croissance 60,8 cm^2 ; stériles, Dnase, Rnase, sans pyrogènes ; polystyrène vierge</td></tr><tr><td>Triton x 100</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>Cat # 8698.5-16, Lot # 4708R34</td><td>Agent mouillant</td></tr><tr><td>Trypsine 0,25 %</td> <td>Corning ; Mediatech, Inc</td><td>Réf # 25-053-CI</td><td>0,25 % de trypsine, 2,21 mM d’EDTA, 1x [-] bicarbonate</td></tr><tr><td>de sodium de type 1 Collagène isolé de la queue de rat</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>56054-1</td><td>Les queues de rat Sprauge-Dawley peuvent être achetées congelées auprès de Pel-Freez ou d’autres fournisseurs. Le collagène peut être isolé des tendons de la queue. Références au protocole d’isolement [Cross et al., 2010 ; Rajan et al., 2007 ; Bornstein, 1958] . Alternativement, du collagène à haute concentration en queue de rat peut être acheté auprès de fournisseurs, y compris Corning (numéro de catalogue : 354249)</td></tr><tr><td>Chambre à vide, paillasse</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-0000</td> <td>(équipement de laboratoire standard)</td></tr> <tr><td>Couteau de précision portatif</td><td>X-Acto</td><td>X3311</td> <td>(couteau X-Acto en option si acheté poinçons en acier)</td></tr></tbody></table>

génération d’équivalents de peau humaine vascularisée auto-assemblés

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Les équivalents de peau humaine (HSE) sont des constructions tissulaires qui modélisent les composants épidermiques et cutanés de la peau humaine. Ces modèles ont été utilisés pour étudier le développement de la peau, la cicatrisation des plaies et les techniques de greffe. De nombreux HSE continuent de manquer de vascularisation et sont en outre analysés par sectionnement histologique post-culture qui limite l’évaluation volumétrique de la structure. Présenté ici est un protocole simple utilisant des matériaux accessibles pour générer des équivalents vascularisés de peau humaine (VHSE) ; plus loin décrits sont des techniques volumétriques d’imagerie et de quantification de ces constructions. En bref, les VHSEs sont construits dans 12 inserts de culture de puits dans lesquels des cellules cutanées et épidermiques sont ensemencées dans le gel de collagène de type I de queue de rat. Le compartiment cutané est constitué de fibroblastes et de cellules endothéliales dispersées dans tout le gel de collagène. Le compartiment épidermique est constitué de kératinocytes (cellules épithéliales de la peau) qui se différencient à l’interface air-liquide. Il est important de faire en sorte que ces méthodes soient personnalisables en fonction des besoins du chercheur, les résultats démontrant la génération de VHSE avec deux types de cellules fibroblastiques différents : les fibroblastes cutanés humains (hDF) et les fibroblastes pulmonaires humains (IMR90s). Des VHSEs ont été développés, es imaged par la microscopie confocal, et volumétriquement analysés utilisant le logiciel de calcul à des points de temps de 4 et de 8 semaines. Un processus optimisé pour fixer, colorer, imager, et effacer VHSEs pour l’examen volumétrique est décrit. Ce modèle complet, cette imagerie et ces techniques d’analyse sont facilement personnalisables en fonction des besoins de recherche spécifiques de laboratoires individuels avec ou sans expérience préalable en ESS.

Le but de ce protocole est de décrire la génération et l’analyse volumétrique des équivalents humains vascularisés de peau utilisant des techniques accessibles et simples pour la culture à long terme. Dans la mesure du possible, la justification des étapes est décrite pour permettre aux chercheurs de personnaliser en fonction de leurs besoins en matière de recherche.

Génération d’équivalents de peau humaine vascularisée auto-assemblés

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Les détails fournis dans ce protocole, traitent de la génération équivalente de peau humaine, qui est souvent techniquement difficile. De nouveaux éléments de protocole équivalents à la peau humaine, tels que la vascularisation et l’imagerie volumétrique, sont inclus. La technique permet la construction simple d’un modèle de peau qui correspond plus étroitement aux tissus in vivo pour l’étude des maladies, du vieillissement et de la médecine personnalisée.La partie la plus difficile de ce protocole est une transition entre la submersion et l’interface air-liquide. Il faudra probablement quelques essais pour optimiser le calendrier et les niveaux de médias pour des résultats cohérents. Pour commencer, ajoutez 516 microlitres de milieux à un tube à calage froid et ajoutez immédiatement 375 microlitres de collagène froid à l’aide de la pipette à déplacement positif de 1000 microlitres.Retirez la pointe vide de la pipette et passez à la pipette à déplacement positif de 250 microlitres préparée pour mélanger. Mélanger rapidement, mais doucement pour éviter la formation excessive de bulles. En gardant la pointe dans la solution, mélanger uniformément à partir de différentes positions du tube jusqu’à ce que la solution soit de couleur homogène, ce qui prend généralement environ cinq cycles de pipette ou 10 secondes.Disperser immédiatement 125 microlitres de collagène acellulaire sur la membrane de l’insert de culture de 12 puits. Pour assurer une couverture uniforme, inclinez la plaque et utilisez la pointe de la pipette pour peindre la membrane en étalant doucement le collagène. Déplacez immédiatement la plaque de 12 puits dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pour la laisser geler pendant au moins 20 minutes.Après la période de gélification, sortez la plaque de collagène acellulaire de 12 puits de l’incubateur. Retirez le tube coiffé de 1,7 millilitre de la glace humide, puis retirez le collagène d’origine de la réfrigération et placez-le sur de la glace humide avec le couvercle ouvert. Ajouter 516 microlitres de suspension cellulaire refroidie au tube à calage froid.Utilisez la pipette de 1000 microlitres pour pipeter immédiatement 375 microlitres de solution de collagène froid directement dans la solution à l’intérieur du tube coiffé. Expulser tout le collagène de la pipette dans le tube et jeter la pointe de la pipette à déplacement positif. Passez immédiatement à la pipette de 250 microlitres et mélangez la solution de collagène Une fois mélangée, transférez 250 microlitres de solution de collagène cellulaire sur les supports de collagène acellulaires dans l’insert de culture à 12 puits, puis déplacez la plaque de 12 puits dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius.Après le temps de gel de 30 minutes, inclinez doucement la plaque pour évaluer la gélification et assurez-vous que le collagène s’est solidifié. Ajouter 500 microlitres et 1000 microlitres de mélange à la chambre supérieure et à la chambre inférieure de l’insert, respectivement. Assurez-vous que le gel de collagène est immergé, en ajoutant plus de milieux si nécessaire.Placez la plaque de puits dans l’incubateur de culture cellulaire pour une incubation de nuit. Le septième jour de submersion, utilisez une pipette manuelle pour recueillir et jeter les médias de la chambre inférieure et supérieure de chaque puits de construction. Pour recueillir les supports coincés directement sous la membrane perméable, placez la pointe de la pipette sous la membrane, en faisant tomber temporairement l’insert.Ajoutez un millilitre d’équivalent de peau humaine ou de support HSE complété par 5% FPS à la chambre inférieure de chaque puits et 200 microlitres de suspension cellulaire à la chambre supérieure de chaque puits. Ensemencer les kératinocytes directement sur la surface de construction cutanée et laissez-les se déposer pendant deux heures dans l’incubateur. Deux heures après l’ensemencement des kératinocytes, ajoutez soigneusement 300 microlitres de milieux HSE, complétés par 5% FPS à la chambre supérieure de chaque puits de construction.Après avoir chargé le support, replacez la construction dans l’incubateur. À l’aide d’une pipette manuelle, soulevez chaque construction à leur interface air-liquide, ou ALI, en retirant les déchets de médias de la chambre haute seulement. Essayez de vous rapprocher le plus possible de la couche épidermique sans la toucher ou l’endommager.Inclinez légèrement les plaques à différents angles pour recueillir le support, puis ajoutez environ deux millilitres d’eau stérile aux puits environnants dans la plaque pour maintenir une humidité constante. Vérifiez la plaque quelques heures plus tard pour vous assurer que les kératinocytes sont toujours à la LAI. Retirez tous les supports de la Chambre haute, en gardant une trace de la quantité de médias qui est retirée de chaque puits.Les couches épidermiques doivent avoir l’air hydratées, pas sèches, mais il ne doit pas y avoir de milieux regroupés au-dessus de la construction. Pour préparer la construction à la coloration immunofluorescente, tournez un insert à l’envers et placez-le sur son puits sur la plaque du puits. Stabiliser l’insert d’une main tout en utilisant une pince à pointe fine ou un couteau de précision pour couper environ la moitié de la circonférence de la membrane.Couper le plus près possible du boîtier en plastique. À l’aide de la pince à pointe fine, saisissez le bord du rabat de membrane coupé et décollez doucement la membrane poreuse de l’insert ainsi que la construction VHSE. Si la construction se coince sur le côté de la chambre, utilisez la pince à pointe fine ou une petite pelle pour la déplacer vers le puits.Une fois que le VHSE est dans le puits, jetez tous les morceaux restants de la membrane d’insertion et gardez le boîtier de l’insert de culture dans chaque puits pour maintenir les VHSE en position immergée pendant la coloration. Deux jours avant l’imagerie, préparer le polydiméthylsiloxane ou PDMS. Placez tout récipient de mélange propre sur une balance de pesée et tarez la balance.Ajoutez la base, puis ajoutez le réticule. Remuez vigoureusement la solution pendant au moins quatre minutes, en créant de petites bulles. Après un mélange suffisant, versez le PDMS dans une boîte de Pétri de 90 ou 100 millimètres.Dégaz le PDMS dans une chambre à vide jusqu’à ce que toutes les bulles disparaissent et que le PDMS soit clair. Relâchez le vide lentement et retirez le PDMS. Placez le plat dans un four pour le faire durcir pendant la nuit à 50 à 60 degrés Celsius, en vous assurant que le plat est assis à plat pour que PDMS durcisse uniformément.Un jour avant l’imagerie, utilisez un poinçon en acier ou un couteau de précision portatif pour poinçonner ou découper un puits circulaire de la feuille PDMS, à peu près de la même taille que la construction VHSE. Coupez une tache carrée autour du puits circulaire pour créer un seul puits PDMS. À l’aide d’un couvercle en verre d’une taille similaire à celle du PDMS, ajoutez de la colle cyanoacrylate à la surface inférieure du PDMS et étalez uniformément une pointe de pipette jetable.Centrez le verre et appuyez dessus sur le PUITS PDMS tout en laissant une fenêtre en verre transparent dans le cercle perforé. Laissez sécher la colle pendant la nuit avant de l’utiliser. La caractérisation de l’épiderme et du derme montre les marqueurs immunofluorescents appropriés pour la peau humaine dans les constructions VHSE.Cytokeratin 10 est un marqueur tôt de keratinocyte de différenciation qui marque habituellement toutes les couches suprabasal dans des équivalents de peau. L’involucrine et le filaggrin sont des marqueurs de différenciation tardifs dans les kératinocytes et marquent les couches les plus suprabasales supérieures dans les équivalents cutanés. L’effacement du VHSE a permis une imagerie simple dans un seul arrangement et a éliminé le besoin de réorienter la construction pour imager le derme et l’épiderme séparément.Les images volumétriques permettent de générer des rendus 3D pour cartographier la vascularisation tout au long de chaque construction. Les piles d’images ont été chargées dans un logiciel de calcul et un algorithme personnalisé a été utilisé pour le rendu et la quantification 3D. Le squelette a déterminé le centre définitif de chaque navire IV-marqué de collagène et les données en résultant ont été employées pour calculer le diamètre de navire aussi bien que la fraction vasculaire.Après cette procédure, des méthodes de caractérisation telles que l’analyse de barrière, la microscopie électronique à balayage, les profils lipidiques et d’autres peuvent être effectuées pour comprendre comment la vascularisation affecte spécifiquement la maturation et la stabilité épidermiques. Ce protocole permet des études tissu-pertinentes et cellule type-spécifiques dans un modèle vascularisé de peau. Il est particulièrement adapté à la recherche sur le vieillissement et la médecine personnalisée.

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