Name: Évaluation de la dispersion du biofilm dans les plaies murines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Découvrez des protocoles pour évaluer l'efficacité des agents de dispersion de biofilms dans les infections de plaies chroniques. Ces méthodes utilisent des approches in vivo et ex vivo pour améliorer le traitement antibiotique.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (R21 AI137462-01A1), de la Ted Nash Long Life Foundation, de la Jasper L. and Jack Denton Wilson Foundation et du Département de la Défense (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Ce protocole animal a été examiné et approuvé par le Institutional Animal Care and Use Committee du Texas Tech University Health Sciences Center (numéro de protocole 07044). Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health.
1. Préparation des bactéries pour les infections de souris
REMARQUE: Ici, nous décrivons infecter les souris uniquement avec Pseudomonas aeruginosa. Cependant, d’autres espèces bactériennes peuvent être utilisées pour causer une infection. Les souches et matériaux bactériens sont détaillés dans la table des matériaux.
<ol><li>Utiliser la souche pa1 de type sauvage pseudomonas aeruginosa portant le plasmide de luminescence pQF50-lux23 pour ces expériences comme décrit précédemment7.</li>
	<li>Cultiver des souches de P. aeruginosa dans des fioles d’Erlenmeyer déconcertées, en secouant à 200 tr/min, dans un bouillon Luria-Bertani (LB) à 37 °C pendant 16 à 20 h. Ajouter une concentration finale de 100 μg/mL d’ampicilline à la culture nocturne de PAO1(pQF50-lux) pour le maintien du plasmide.</li>
	<li>Sous-culture P. aeruginosa en ajoutant 100 μL de la culture de nuit à une fiole d’Erlenmeyer contenant 10 mL de bouillon LB avec une concentration finale de 100 μg/mL d’ampicilline. Puis cultiver pendant 2-2,5 h à 37 °C avec des secousses, jusqu’à une DOde 600 nm de 0,4, puis diluer en série (1:10) trois fois pour une dose infectieuse d’environ 104 cellules.</li>
</ol>2. Préparation de l’enzyme de dispersion du biofilm
REMARQUE: Pour cette étude, nous utilisons une solution à 10% d’amylase et de cellulase à parts égales (5% de chacune), qui sera appelée « GH », pour le traitement de dispersion.
<ol><li>Utilisez une solution de GH à 10% (p / v) d’amylase (de Bacillus subtilis)et de cellulase fongique (d’Aspergillus niger)diluée dans 1x tampon phosphate salin (PBS). Utilisez pbs comme traitement de contrôle du véhicule.</li>
	<li>Réchauffer tous les traitements à 37 °C pendant 30 min pour l’activation enzymatique.</li>
</ol>3. Animaux de laboratoire et configuration préopératoire
<ol><li>Souris domestiques, 5 compagnons de litière par cage, dans des conditions contrôlées par l’environnement, avec des cycles lumière /obscurité de 12 h et un accès approprié à la nourriture et à l’eau.</li>
	<li>De préférence, utilisez des souris Webster suisses femelles, âgées de 8 à 10 semaines.</li>
	<li>Peser les souris pour déterminer la quantité appropriée d’anesthésie à administrer.</li>
	<li>Administrer l’anesthésie par l’injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de kétamine 10 mg/kg de xylazine.</li>
	<li>Appliquez soigneusement de la crème pour les yeux (p. ex. Refresh P.M.) sur l’œil à l’aide d’un coton-tige pour réduire la sécheresse.</li>
	<li>Surveiller les paramètres physiologiques, y compris la fréquence respiratoire, la coloration de la peau et la température corporelle, tout au long de la chirurgie.</li>
</ol>4. Chirurgie d’excision dorsale pleine épaisseur
<ol><li>Évaluer le plan chirurgical de l’anesthésie par pincement des pincements aux pincements et surveillance de la fréquence respiratoire et de l’effort. Rasez la surface dorsale et appliquez une crème dépilatoire pendant 10 min (ou selon les instructions du produit), après quoi retirez doucement, en vous assurant que la peau était sèche.</li>
	<li>Pour la gestion de douleur, administrer 0,05 ml de lidocaïne par voie sous-cutanée dans le secteur à exciser, et injecter 0,02 ml de buprénorphine par voie sous-cutanée dans le broussaille du cou. Attendez 10 min pour vous assurer que la gestion de la douleur a été atteinte.</li>
	<li>Avant l’excision, désinfectez la surface dorsale à l’aide d’un écouvillon d’alcool et dessinez un cercle de 1,5 cm de diamètre vers la partie postérieure du dos. Maintenir un champ chirurgical stérile tout au long de la procédure et utilisé des instruments autoclavés et des gants stériles. Pour limiter la contamination, effectuez la chirurgie par un brûleur Bunsen allumé et utilisez des outils propres pour chaque animal.</li>
	<li>Administrer une plaie cutanée excisionnelle de pleine épaisseur au niveau du muscle panniculus avec des ciseaux chirurgicaux.</li>
	<li>Après l’excision, couvrir immédiatement les plaies avec un pansement en polyuréthane semi-perméable.</li>
	<li>Injecter environ 104 UFC de bactéries dans 100 μL de PBS sous le pansement, sur le lit de la plaie, pour établir une infection. REMARQUE: Les plaies peuvent également être infectées par plusieurs espèces de bactéries et /ou de champignons simultanément, ou en plaçant des biofilms pré-formés12,ou même des tissus de débridement extraits de patients19,sur le lit de la plaie.</li>
	<li>Après l’infection, placez les souris en cage avec des coussins chauffants et surveillez jusqu’à ce qu’elles retrouvent leur réflexe de redressement. REMARQUE: Assurez-vous que les souris n’ont pas froid car cela peut entraîner la mort.</li>
	<li>Établir des infections de plaie pour 48 h.</li>
	<li>Inspectez quotidiennement les pansements adhésifs pour les déchirures et les zones de non-adhérence et remplacez-les au besoin.</li>
</ol>5. Traitement de dispersion in vivo
REMARQUE: Ici, nous décrivons l’administration des agents de dispersion en appliquant une série de 3 solutions topiques d’irrigation des plaies (Figure 1). Cependant, le protocole peut être adapté à d’autres types d’accouchement tels que l’application de gels, de crèmes ou de pansements.
<ol><li>Placez les souris sous anesthésie isoflurane (à 3% et 1 L par minute d’oxygène) pendant l’administration des traitements.</li>
	<li>Préparer trois seringues de 1 mL, avec des aiguilles de 25 G, contenant 200 μL de traitement pour chaque souris.</li>
	<li>Injecter 200 μL de solution enzymatique ou de contrôle PBS sur la plaie en soulevant et en pinçant soigneusement la peau avec une pince, légèrement au-dessus de la plaie vers la tête de l’animal. Percez soigneusement la seringue à travers la peau soulevée et injectez lentement la solution entre le pansement et le lit de la plaie. Le pansement utilisé dans cette étude adhère souvent à la fois au lit de la plaie et au tissu environnant.<ol>
<li>Pour vous assurer que tout le lit de la plaie est recouvert d’une solution, soulevez doucement le pansement avec une pince, en l’éloignant du lit de la plaie, tout en injectant lentement la solution.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après le traitement, replacez les souris dans leurs cages pendant 30 min.</li>
	<li>Après 30 minutes d’exposition au traitement, ré-anesthésiez les souris avec de l’isoflurane et aspirez la solution avec une seringue, en vous assurant de percer dans la même zone qu’auparavant. REMARQUE: Cette solution aspirée contient des cellules bactériennes dispersées, qui peuvent être conservées pour diverses analyses en aval.</li>
	<li>Administrer les deuxième et troisième traitements d’irrigation comme le premier, en utilisant une nouvelle seringue à chaque fois.</li>
</ol>6. Imagerie et analyse de la dispersion in vivo
REMARQUE: Si une souche luminescente de bactéries est utilisée pour initier l’infection, un système d’imagerie in vivo (IVIS) peut être utilisé pour visualiser la dispersion du lit de la plaie.
<ol><li>Imager les souris immédiatement avant et après le traitement et à 10 et 20 h après le traitement(figure 2 et figure supplémentaire 1).</li>
	<li>Effectuer l’imagerie pendant que les souris sont sous anesthésie en les plaçant individuellement dans l’IVIS et en les imageant chacune pendant 5 s à une longueur d’onde de 560 nm. Enregistrez les images pour une analyse plus approfondie. REMARQUE: La longueur d’onde et le temps d’exposition optimaux dépendront du rapporteur utilisé et de l’instrument IVIS et du logiciel d’imagerie.</li>
	<li>Pour l’analyse, ouvrez les images dans le logiciel IVIS et sélectionnez la zone à analyser dans la palette d’outils.</li>
	<li>Pour tenir compte de l’arrière-plan, placez un cercle sur l’arrière-plan d’une photo, puis placez le même cercle de taille sur le lit de la plaie pour chaque souris.</li>
	<li>Pour télécharger des valeurs de mesure, sélectionnez Afficher -> mesures de la région d’intérêt (ROI) et téléchargez la table des mesures dans une feuille de calcul. Soustrayez la lecture du cercle de fond de chacune des mesures du lit de plaie pour calculer la luminescence pour chaque échantillon. Calculer le pourcentage de luminescence modifiée par : ROI pré-traitement-ROI post-traitement / ROI pré-traitement) x 100. REMARQUE: Les souris témoins et traitées doivent être analysées simultanément pour normaliser les variables qui peuvent affecter l’acquisition ou l’éclat de l’image.</li>
</ol>7. Évaluation de la dispersion par détermination de l’UFC
<ol><li>Euthanasier sans cruauté des souris par injection intrapéritonéale de 0,2 mL de sodium pentobarbital (p. ex. Fatal Plus) sous anesthésie avec 100 mg/kg de kétamine 10 mg/kg de xylazine.</li>
	<li>Récoltez le tissu du lit de la plaie en enlevant d’abord doucement le pansement avec une pince stérile, puis coupez autour du périmètre du lit de la plaie avec des ciseaux chirurgicaux stériles. Soulevez doucement une extrémité du lit de plaie avec une pince tout en utilisant des ciseaux pour couper / taquiner l’échantillon loin de la couche musculaire.</li>
	<li>Placer le tissu du lit de la plaie dans un tube d’homogénéisation de 2 mL pré-marqué et pré-pesé contenant 1 mL de PBS. Peser à nouveau les tubes après avoir inséré les échantillons, puis inverser doucement 3 à 5 fois pour rincer toute bactérie dispersée ou faiblement adhérente et éliminer le PBS. Ajouter 1 mL de PBS frais.</li>
	<li>Afin de récolter la rate, placez les souris dans une position anatomique en décubitus dorsal et fixez-les en épinglant leurs extrémités à une surface de dissection. Faire tremper la zone à disséquer avec de l’éthanol à 70% afin de désinfecter la zone et d’empêcher la fourrure de contaminer l’échantillon.</li>
	<li>Faites soigneusement une petite incision perpendiculaire à la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux dans le derme du bas-ventre, en vous assurant de tirer la peau vers le haut et loin des organes internes. Continuer l’incision intérieurement, le long de la ligne médiane, jusqu’à ce que le sternum soit atteint. Une fois que la cavité péritonéale a été exposée et que les organes internes étaient visibles, séparez doucement la rate du tissu conjonctif et placez-la dans un tube d’homogénéisation séparé.</li>
	<li>Peser la rate et rincer avec du PBS, comme décrit pour le tissu du lit de la plaie. REMARQUE: D’autres organes d’intérêt peuvent être récoltés de la même manière.<ol>
<li>Lors de l’incision initiale, veillez à éviter de perforer les intestins ou d’autres organes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogénéiser les échantillons dans des tubes de laminoir à billes préremplis de 2 mL à l’aide d’un homogénéisateur de paillasse à 5 m/s pendant 60 s, deux fois.</li>
	<li>Pour dénombrer l’UFC, diluer en série les échantillons et la plaque ponctuelle sur une gélose sélective. Pour la dilution en série, pipeter 100 μL de l’échantillon dans 900 μL de PBS dans un tube de 1,5 mL, un vortex et répéter 5 fois. Pipetter 10 μL de chaque dilution sur une plaque de gélose comme le montre la figure 3. NOTA : Si une quantification plus précise de l’UFC est nécessaire, étaler 100 μL de chaque dilution de l’échantillon sur des plaques de gélose distinctes.</li>
</ol>8. Évaluation ex vivo de la dispersion ( Figure4)
<ol><li>Enroulé les souris et infecter avec environ 104 PAO1 comme décrit ci-dessus, puis euthanasier 48 h après l’infection.</li>
	<li>Retirez soigneusement le pansement avec une pince, en utilisant une technique stérile et sans perturber le lit de la plaie.</li>
	<li>Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles pour couper le périmètre du lit de la plaie loin de la peau non infectée en utilisant une pince pour soulever une extrémité du lit de la plaie et des ciseaux pour exciser le tissu de la plaie infectée de la couche musculaire en dessous et des tissus non infectés environnants. Diviser les échantillons de lit de plaie en parties égales ou utiliser entier.</li>
	<li>Placer le tissu de la plaie dans des tubes homogénéisants vides et pré-pesés de 2 mL de la fabrique de perles. Pesez ensuite à nouveau les tubes après avoir ajouté l’échantillon. Calculer le poids de l’échantillon en : poids après l’ajout de l’échantillon - poids avant l’ajout de l’échantillon.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS et inverser doucement le tube 3 à 5 fois pour rincer l’échantillon et éliminer toutes les cellules planctoniques. Retirez et jetez le PBS.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de traitement GH (ou PBS comme témoin négatif) à l’échantillon et incuber pendant 2 h à 37 °C en secouant à 80 tr/min.</li>
	<li>Retirer la solution de dispersion du biofilm et la placer dans un tube séparé de 1,5 mL. Celui-ci contient les cellules dispersées.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS à l’échantillon de tissu restant et inverser doucement 3 à 5 fois pour rincer les cellules dispersées restantes. Retirez et jetez le PBS.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS au tissu restant et homogénéiser à 5 m/s pendant 60 s à l’aide d’un homogénéisateur de paillasse.</li>
	<li>Diluer en série la solution de cellules dispersées et l’échantillon de tissu homogénéisé en plaçant 100 μL d’échantillon dans 900 μL de PBS dans un tube de 1,5 mL et en répétant cinq fois pour un total de 6 dilutions.</li>
	<li>Plaque ponctuelle de 10 μL de chaque dilution sur une gélose sélective en milieu (p. ex. gélose d’isolement Pseudomonas pour P. aeruginosa)et incuber les plaques à 37 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Comptez l’UFC et calculez le « pourcentage dispersé » comme suit : (UFC dans le surnageant/ (UFC dans le surnageant+ UFC dans le tissu du biofilm)) x 100.</li>
</ol>

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<li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infection and Immunity. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li>
<li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+optical+imaging+method+to+evaluate+postantibiotic+effects+on+biofilm+infection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Noninvasive optical imaging method to evaluate postantibiotic effects on biofilm infection in vivo.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (6), 2283-2287 (2004).</li>
<li>Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in biofilms.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 661-671 (2000).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656(2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici les protocoles qui peuvent être utilisés pour étudier l’efficacité des agents de dispersion du biofilm. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés pour être utilisés avec différents types d’agents de dispersion, d’espèces bactériennes ou d’échantillons ex vivo, y compris des échantillons de débridement clinique. Ce protocole fournit également un modèle cliniquement pertinent pour collecter et étudier les cellules bactériennes dispersées. Il a été démontré que les phénotypes des cellules ba...

L’augmentation de la résistance aux antibiotiques dans le monde entier conduit à un manque d’options antibiotiques pour traiter une variété d’infections bactériennes1. En plus de la résistance aux antibiotiques, les bactéries peuvent gagner en tolérance aux antibiotiques en adoptant un mode de vie associé au biofilm2. Un biofilm est une communauté de micro-organismes qui sont protégés par une matrice de polysaccharides, d’ADN extracellulaire, de lipides et de protéines3,collectivement appelée substance polymère extracellulaire (EPS). Alors que la crise de la résistance aux antibiotiques se poursuit, de nouvelles stratégies qui prolongent l’utilisation des antibiotiques ou renforcent leur efficacité font cruellement défaut. Les agents anti-biofilm sont une solution prometteuse4.
Parmi les différentes stratégies anti-biofilm qui ont été proposées, l’utilisation d’agents de dispersion, qui ciblent différents composants de l’EPS du biofilm, est à la pointe du développement thérapeutique5. Les hydrolases glycosides (GH) sont l’une de ces classes d’agents de dispersion. GH sont une grande classe d’enzymes qui catalysent le clivage de différentes liaisons dans les polysaccharides qui fournissent l’intégrité structurelle à l’EPS. Notre groupe, ainsi que d’autres, ont montré que gh peut dégrader efficacement les biofilms, induire la dispersion et améliorer l’efficacité antibiotique pour un certain nombre d’espèces bactériennes différentes, à la fois in vitro et in vivo6,7,8,9,10,11.
Compte fait l’intérêt croissant pour la dispersion du biofilm, il est important de mettre au point des méthodes efficaces pour évaluer l’efficacité de la dispersion. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour le traitement des infections des plaies associées au biofilm avec un agent de dispersion chez la souris, et l’évaluation de l’efficacité de la dispersion, in vivo et ex vivo. L’objectif global est de fournir des méthodes efficaces qui peuvent être utilisées avec des modèles précliniques pour mesurer la dispersion du biofilm de manière efficace et efficiente.
Un modèle murin d’infection chirurgicale d’excision a été employé dans ces études pour établir une infection biofilm-associée. Nous avons utilisé ce modèle pendant plus de 15 ans et publié nos observationsabondamment 7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. En général, il s’agit d’un modèle d’infection non létale où les bactéries restent localisées au lit de la plaie et sont associées au biofilm (bactéries observées dans des agrégats entourés d’EPS), mettant en place une infection chronique qui dure jusqu’à 3 semaines. Cependant, si les souris sont immunodéprimées (avec le diabète de type 1 par exemple), elles peuvent devenir plus susceptibles de développer une infection systémique mortelle dans ce modèle.
Dans ce rapport, nous fournissons des protocoles pour évaluer la dispersion des bactéries d’une blessure, in vivo et ex vivo. Les deux protocoles peuvent être utilisés pour examiner l’efficacité d’un agent de dispersion et ont leurs propres forces et faiblesses. Par exemple, l’évaluation de la dispersion in vivo peut fournir des renseignements importants et en temps réel sur la propagation des bactéries à d’autres parties du corps après la dispersion et sur la façon dont l’hôte réagit. D’autre part, l’évaluation de la dispersion ex vivo peut être plus souhaitable pour le dépistage de plusieurs agents, doses ou formulations, car le tissu peut être divisé en plusieurs sections qui peuvent être testées séparément, réduisant ainsi le nombre de souris requis. Lors de l’évaluation de plusieurs agents, nous mesurons généralement la dispersion d’abord in vitro comme décrit précédemment 6,9,22. Nous testons ensuite les tests ex vivo les plus efficaces et réservons les tests in vivo pour un nombre limité d’agents très prometteurs.

<table><tbody><tr><td>Tube de microcentrifugation de 1,5 mL</td><td>Fisher</td><td>14823434</td><td>Utiliser pour compléter les dilutions en série d’échantillons</td></tr><tr><td>25G 58 dans l’aiguille</td><td>Fisher</td><td>14823434</td><td>Se fixe à une seringue de 1 mL</td></tr><tr><td>Ampicilline Sodium Salt</td><td>Fisher</td><td>BP1760-5</td><td>Préparez une solution mère de 50 mg/mL et ajoutez 100 &micro ; L à 10 mL de bouillon LB pour la nuit et la sous-culture</td></tr><tr><td>Amylase</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100447</td><td>Préparer une solution à 5 % p/v, vortex - d’autres agents de dispersion peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Buprénorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td><td>ZooPharm</td><td>RX216118</td><td>Utiliser comme traitement de la douleur - peut utiliser d’autres options</td></tr><tr><td>Cellulase</td><td>MP Biomedicals</td><td>2150583</td><td>Ajouter 5 % p/v à la solution d’amylase à 5 % p/v, vortex, activer à 37 &deg ; C pendant 30 min - d’autres agents de dispersion peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>Walmart</td><td>287746</td><td>Utilisez une petite quantité pour masser les follicules pileux sur le dos de l’animal et allouez 10 min pour enlever les poils</td></tr><tr><td>Pinces de pansement, pointes dentelées</td><td>Fisher</td><td>12-460-536</td><td>Peut utiliser d’autres formes de pinces</td></tr><tr><td>Fioles Erlenmeyer déflecteurs 125 mL</td><td>Fisher</td><td>101406</td><td>Utiliser pour cultiver pendant la nuit et des sous-cultures de bactéries</td></tr><tr><td>FastPrep-24 Homogénéisateur de paillasse</td><td>MP Biomedicals</td><td>6VFV9</td><td>Utiliser 5 m/s pendant 60 s deux fois pour homogénéiser les tissus</td></tr><tr><td>Fatal Plus</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>0298-9373-68</td><td>Injecter 0,2 mL intrapéritanéal pour chaque souris</td></tr><tr><td>Tubes d’homogénéisation (Tube à billes 2 mL 2,4 mm Métal)</td><td>Fisher</td><td>15340151</td><td>Utilisé pour homogénéiser les échantillons pour le placage</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Diamond Back Drugs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de chlorhydrate de kétamine/chlorhydrate de xylazine C-IIIN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K4138</td><td>Utilisation comme anesthésie - d’autres options peuvent également être utilisées pour obtenir un champ chirurgical d’anesthésie</td></tr><tr><td>LB bouillon, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-2</td><td>Ajouter 25 g / L et autoclave</td></tr><tr><td>Lidocaïne 2 %</td><td>Injectable Diamond Back Drugs</td><td>2468</td><td>Injectez 0,05 mL sur le côté de la zone du lit de la plaie marquée afin qu’il soit déposé au centre de la marque. Alloter 10 min avant de couper</td></tr><tr><td>Meropenem</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1772-500MG</td><td>Préparer 5 mg/mL à ajouter à la solution de GH à appliquer localement et une solution à 15 mg/mL à injecter par voie intrapéritanale 4 h avant et 6 h après le traitement</td></tr><tr><td>Éponges de gaze de coton non stériles</td><td>Fisher</td><td>13-761-52</td><td>Utiliser pour enlever la crème dépilatoire</td></tr><tr><td>souche bactérienne PAO1 pQF50-lux</td><td>Réf [13]</td><td>N/A</td><td>PAO1 pgF50-lux a été utilisé comme souche d’intérêt pour P. aeruginosa dans les résultats représentatifs de cet article</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Fisher</td><td>PHR1772-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de phosphate Saline 10x</td><td>Fisher</td><td>BP3991</td><td>Diluer 10x à 1x avant utilisation</td></tr><tr><td>Pansement en polyuréthane</td><td>Mckesson 66024007</td><td></td><td>Coupez le bord arrondi et coupez le carré restant en 4 sections égales</td></tr><tr><td>Pseudomonas gélose d’isolement</td><td>VWR</td><td>90004-394</td><td>Ajouter 20 ml/L de glycérol et 45 g/l à l’eau, autoclave, et verser 20 mL dans des boîtes de Pétri</td></tr><tr><td>Rafraîchir l’après-midi.</td><td>Walmart</td><td></td><td>À utiliser sur les yeux pour réduire la sécheresse pendant la procédure.</td></tr><tr><td>Coussinets de préparation à l’alcool stériles</td><td>Fisher</td><td>22-363-750</td> À <td>utiliser pour nettoyer la peau immédiatement avant la blessure afin de désinfecter la zone</td></tr><tr><td>Ciseaux droits et délicats</td><td>Fisher</td><td>89515</td><td>Peut également utiliser des ciseaux incurvés</td></tr><tr><td>Souris Swiss Webster</td><td>Charles River</td><td>551NCISWWEB</td><td>D’autres souches de souris peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>Seringue Slip Tip 1 mL</td><td>Fisher</td><td>14823434</td><td>Utilisé pour administrer des médicaments et traitement enzymatique</td></tr></tbody></table>

Évaluation de la dispersion du biofilm dans les plaies murines

Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Les infections liées au biofilm sont impliquées dans un large éventail de maladies chroniques telles que les ulcères du pied diabétique non cicatrisants, la sinusite chronique, l’otite moyenne récurrente et bien d’autres. Les cellules microbiennes de ces infections sont protégées par une substance polymère extracellulaire (EPS), qui peut empêcher les antibiotiques et les cellules immunitaires hôtes d’éliminer l’infection. Pour surmonter cet obstacle, les chercheurs ont commencé à développer des agents de dispersion en tant que thérapies potentielles. Ces agents ciblent divers composants dans l’EPS du biofilm, affaiblissant la structure et initiant la dispersion des bactéries, ce qui peut théoriquement améliorer la puissance antibiotique et la clairance immunitaire. Pour déterminer l’efficacité des agents de dispersion pour les infections des plaies, nous avons développé des protocoles qui mesurent la dispersion du biofilm ex vivo et in vivo. Nous employons un modèle chirurgical d’excision de souris qui a été bien-décrit pour créer des infections chroniques biofilm-associées de blessure. Pour surveiller la dispersion in vivo,nous infectons les plaies avec des souches bactériennes qui expriment la luciférase. Une fois que les infections matures se sont établies, nous irrigueons les plaies avec une solution contenant des enzymes qui dégradent les composants de l’EPS du biofilm. Nous surveillons ensuite l’emplacement et l’intensité du signal luminescent dans les organes filtrants et filtrants pour fournir des informations sur le niveau de dispersion atteint. Pour l’analyse ex vivo de la dispersion du biofilm, le tissu de la plaie infectée est immergé dans une solution enzymatique dégradant le biofilm, après quoi la charge bactérienne restant dans le tissu, par rapport à la charge bactérienne en solution, est évaluée. Les deux protocoles ont des forces et des faiblesses et peuvent être optimisés pour aider à déterminer avec précision l’efficacité des traitements de dispersion.

Dans cette expérience, des souris femelles de Webster suisses âgées de 8 à 10 semaines ont été infectées par 10à 4 UFC de PAO1 portant le plasmide de luminescence pQF50-lux. Comme décrit ci-dessus, on a permis à une infection d’établir pendant 48 h avant d’administrer 3 x 30 traitements de minute de PBS (contrôle du véhicule) ou de GH à 10 % (traitement) pour digérer l’EPS du biofilm. Des souris ont été idés prétraitement, directement après traitement (0 h) et à 10 h et 20 h après le traitement. <strong class=...

Ici, nous décrivons des méthodes ex vivo et in vivo pour évaluer la dispersion bactérienne d’une infection de blessure chez la souris. Ce protocole peut être utilisé pour tester l’efficacité des thérapies topiques antimicrobiennes et anti-biofilm, ou pour évaluer la capacité de dispersion de différentes souches ou espèces bactériennes.

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

Les microbiologistes et les infectiologues commencent à réaliser à quel point les infections associées au biofilm sont importantes dans les maladies chroniques. Les NIH ont même déclaré que plus de 80% des infections chroniques sont dues à des biofilms bactériens. Cela a donc incité à mettre l’accent sur le biofilm et à développer des thérapies qui s’attaquent au problème du biofilm.Et beaucoup de ces thérapies sont axées sur la dispersion des cellules bactériennes qui sont dans les biofilms hors du biofilm afin qu’elles puissent être plus facilement tuées. Mais il n’y a vraiment pas beaucoup de protocoles dans la littérature actuellement qui traitent de la façon de déterminer l’efficacité d’un tel agent de dispersion. Nous pensons donc que c’est un bon protocole à utiliser.C’est un type d’infection bactérienne qui est associé au biofilm. Et nous pensons aussi qu’il peut être optimisé assez facilement pour étudier de nombreux types différents d’espèces bactériennes, et comment ils forment des biofilms et se dispersent, ainsi que différents agents de dispersion. Et nous pensons qu’il est important de fournir cela dans un format vidéo, parce que nous avons vu qu’il y a des nuances à

assessing-biofilm-dispersal-in-murine-wounds

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source: Hunt, A. M. A., et al. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp.(2017).This video demonstrates the procedure for assessing infection clearance and healing progression in a wounded diabetic mouse using bioluminescent and microscopic images.

Bioluminescence Imaging to Track Bacterial Infection and Wound Healing in a Mouse Model

Cette vidéo présente l’imagerie in vivo permettant d’étudier la dynamique de recrutement des neutrophiles sur un site d’infection chez une souris transgénique immunodéprimée avec des neutrophiles exprimant la GFP. Il s’agit d’injecter des bactéries luminescentes pour provoquer une infection. Cela conduit au recrutement de neutrophiles sur le site de l’infection, dont le suivi se fait par imagerie.

Surveillance de la dynamique de recrutement des neutrophiles et de la charge bactérienne au site d’infection dans un modèle murin

Cette vidéo montre une technique permettant de générer un modèle murin d’infection de plaie cutanée. Lors de l’infection de souris – conçues pour exprimer une protéine fluorescente dans les neutrophiles – avec un Staphylococcus aureus bioluminescent génétiquement modifié – une bactérie pathogène. La charge bactérienne au site d’infection et la dynamique de recrutement des neutrophiles peuvent être étudiées à l’aide de l’imagerie de l’animal entier.

Un modèle d’infection cutanée murine pour étudier la réponse immunitaire contre un pathogène bactérien

Cette vidéo démontre le développement d’un modèle murin in vivo pour étudier la formation du biofilm de Candida albicans dans le tissu sous-cutané. L'expérience consiste à implanter des dispositifs infectés par Candida dans la région arrière de l'animal pour le développement d'un biofilm.

Candida albicans Formation d’un biofilm dans un modèle murin in vivo

Un modèle murin de la cicatrisation cutanée qui peut être utilisé pour évaluer les composés thérapeutiques dans des contextes physiologiques et physiopathologiques.

Modèle murin de la cicatrisation

Nous présentons une procédure expérimentale de développement du biofilm de Candida albicans dans un modèle sous-cutané de souris. Les biofilms fongiques ont été quantifiés en déterminant le nombre d’unités formant des colonies et par une imagerie de bioluminescence non invasive, où la quantité de lumière produite correspond au nombre de cellules viables.

Candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging

Nous décrivons ici un nouveau modèle murin diabétique utilisant des souris sans poils pour en temps réel, non invasif, surveillance des infections de plaies du biofilm de bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode peut être adaptée pour évaluer l’infection d’autres espèces de bactéries et micro-organismes génétiquement modifiés, y compris les biofilms multi-espèces et tester l’efficacité des stratégies antibiofilm.

Venez sur le côté de la lumière: In Vivo surveillance des Infections à Pseudomonas aeruginosa Biofilm dans les plaies chroniques dans un modèle murin glabres diabétique

Nous décrivons un protocole retardé d’inoculation pour produire des infections chroniques de blessure dans les souris immunocompétentes.

Un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure d’aeruginosa

Les plaies chroniques résistantes aux antibiotiques constituent une menace majeure pour le système de santé. Les infections par biofilm sont tenaces et hostiles et peuvent entraîner une fermeture fonctionnelle déficiente de la plaie. Nous rapportons un modèle porcin cliniquement pertinent de plaies chroniques de pleine épaisseur infectées par un biofilm. Ce modèle est puissant pour les études mécanistiques ainsi que pour tester des interventions.

Modèle porcin d’infection par biofilm et de plaies invisibles

Ce protocole décrit un modèle expérimental unique d’infections liées aux implants qui permet l’incubation simultanée de deux implants avec des bactéries dans des conditions identiques au sein d’une même souris. Il permet également une évaluation précise de la formation de biofilms sur les surfaces des implants à l’aide de méthodes analytiques comparatives optimisées, démontrant ainsi des techniques avancées d’évaluation des propriétés antimicrobiennes des biomatériaux.

Un modèle murin unique pour l’évaluation quantitative de la formation de biofilm sur les implants chirurgicaux dans l’abcès sous-cutané

Découvrez des protocoles pour évaluer l'efficacité des agents de dispersion de biofilms dans les infections de plaies chroniques. Ces méthodes utilisent des approches in vivo et ex vivo pour améliorer le traitement antibiotique.

Évaluation de la dispersion du biofilm dans les plaies murines

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