Name: Un modèle de rat d’infection cérébrale EcoHIV (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Découvrez comment établir un modèle d'infection cérébrale EcoHIV chez le rat pour étudier les troubles neurocognitifs associés au VIH. Cette méthode permet d'analyser les réservoirs viraux et les altérations synaptiques.

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Ce travail a été financé par les subventions des NIH HD043680, MH106392, DA013137 et NS100624.

Tous les protocoles relatifs aux animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de la Caroline du Sud (numéro d’assurance fédéral : D16-00028). Six rats F344/N mâles adultes ont été logés dans un environnement contrôlé sous un cycle 12/12 clair: sombre avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Tous les animaux ont été pris en charge en utilisant les lignes directrices établies par les National Institutes of Health dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Emballage du virus dans 293 cellules FT
<ol><li>Culture des 293 cellules FT (5×105/mL)dans des flacons enrobés de gélatine de 75 cm2 avec du DMEM plus 10% FBS11. Cultiver les cellules à 37 °C pour être 50 % confluentes à la transfection.</li>
	<li>Diluer 22,5 μL de réactif de transfection (p. ex. lipofectamine 3000) dans 750 μL de milieu (p. ex. Opti-MEM) dans un tube de micro-centrifugeuse et un vortex de 1,5 mL pendant 3 s.</li>
	<li>Diluer 20 μg d’ADN plasmidique EcoHIV dans 750 μL de milieu dans un tube micro-centrifugeuse de 1,5 mL et bien mélanger.</li>
	<li>Ajouter l’ADN dilué dans le tube du réactif de transfection dilué et mélanger doucement. Incuber pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter le mélange à 10 mL de milieu DMEM prémulé dans une fiole de 75 cm2. Incuber les cellules pendant 2 jours à 37 °C.</li>
	<li>Récolter et combiner 24 mL de milieu conditionnel à partir des deux fioles qui comprennent le lentivirus emballé.</li>
	<li>Centrifuger tout 24 mL de milieu conditionnel à 500 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Transférer le surnageant clarifié dans un tube stérile de 50 mL.</li>
	<li>Combiner 8 mL de concentrateur Lenti-x avec 24 mL de surnageant clarifié (rapport 1:3). Mélanger par inversion douce. Incuber le mélange à 4 °C pendant deux jours.</li>
	<li>Mélange centrifuge à 1 500 x g pendant 45 minutes à 4 °C. Retirez soigneusement le surnageant.</li>
	<li>Suspendre doucement la pastille avec 100 μL de PBS de 100 mM.</li>
	<li>Concentration de virus de titre avec un kit ELISA p24.</li>
</ol>2. Chirurgies stéréotaxiques du virus EcoHIV-EGFP
<ol><li>Anesthésier les rats à l’aide de 3% de sévoflurane. Passez à l’étape 2.2 lorsque les rats ne réagissent pas aux stimuli nocifs et que les réflexes sont absents.</li>
	<li>Rasez les poils de la région du cerveau et stérilisez la peau deux fois avec de l’éthanol à 70% et un gommage à base de chlorhexidine. Fixez le rat en position couchée dans l’appareil stéréotaxique.</li>
	<li>Faites une incision (5-6 cm) à travers la peau le long de la ligne médiane du cuir chevelu.</li>
	<li>Marquer deux positions de forage à 0,8 mm latérale, 1,2 mm rostral à bregma. Percez un trou (diamètre 0,4 mm) dans chaque position du crâne.</li>
	<li>Remplissez la solution de lentivirus EcoHIV titré (1,04 × 106 TU/mL) dans une seringue d’injection de 10 μL. Fixez la seringue à l’appareil stéréotaxique.</li>
	<li>Descendez l’aiguille près de la surface du trou de forage. Mesurer et déplacer 2,5 mm de profondeur.</li>
	<li>Infuser 1 μL de solution virale à raison de 0,2 μL/min. Gardez l’aiguille à l’intérieur de la zone d’injection pendant 5 min. Déplacez lentement l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit à l’extérieur du crâne du rat.</li>
	<li>Suturer la peau avec un fil de soie 4-0.</li>
	<li>Stérilisez l’incision avec de l’éthanol à 70% une fois. Injecter par voie sous-cutanée du butorphénol (Dorolex, 0,1 mg/kg de poids corporel).</li>
	<li>Transférer le rat dans une chambre de récupération avec un coussin chauffant jusqu’à ce qu’il se réveille.</li>
</ol>3. Visualisation des sections du cerveau
REMARQUE: Attendez une à huit semaines après la perfusion virale EcoHIV.
<ol><li>Anesthésier le rat avec 5% de sévoflurane. Passez à l’étape 3.2 lorsque les rats ne réagissent pas aux stimuli nocifs et que les réflexes sont absents.</li>
	<li>Fixez le rat en décubitus dorsal à l’intérieur d’une hotte.</li>
	<li>Inciser la peau le long de la ligne médiane thoracique. Coupez le diaphragme et ouvrez la cavité thoracique.</li>
	<li>Insérez une aiguille de 20 G × de 25 mm dans le ventricule gauche.</li>
	<li>Ouvrez immédiatement l’oreillette droite avec des ciseaux.</li>
	<li>Perfuser 50 mL de PBS prechilled de 100 mM à raison de 5 mL/min.</li>
	<li>Perfuser 100 mL de paraformaldéhyde froid à 4 % à raison de 5 mL/min.</li>
	<li>Décapiter le rat, ouvrir le cuir chevelu et enlever le cerveau.</li>
	<li>Postfix pendant la nuit avec 4% de paraformaldéhyde.</li>
	<li>Transférer le cerveau à 40 mL de saccharose à 30% dans du PBS de 100 mM dans un tube de 50 mL jusqu’à ce que le cerveau flotte vers le bas (environ 3 jours).</li>
	<li>Snap congeler le cerveau dans le méthylbutanol pendant 2 min à - 80 °C.</li>
	<li>Fixez le tissu cérébral sur une plate-forme métallique à l’intérieur d’un cryostat à -20 °C.</li>
	<li>Couper des sections coronales de 50 μm d’épaisseur à l’aide du cryostat.</li>
	<li>Transférer les tranches de cerveau sur des lames de verre avec une brosse fine.</li>
	<li>Monter des sections dans 0,3 mL de milieu d’étouffement et couvrir avec des lamures de 22 mm 50 mm.</li>
	<li>Gardez les lames de verre dans l’obscurité à température ambiante jusqu’à ce qu’il soit sec.</li>
	<li>Imagez les neurones ciblés avec un microscope confocal à l’aide de Z-stack basé sur les limites de la région du cerveau et les caractéristiques morphologiques des neurones. NOTA : Les réglages du microscope confocal utilisés étaient les suivants : grossissement de 60 X (A/1,4, huile) et intervalle du plan Z de 0,15 μm (taille du trou d’épingle de 30 μm; rayon de trou d’épingle rétro-projeté de 167 nm) en utilisant une longueur d’onde de 488 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse%3A+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li>
<li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li>
<li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li>
<li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).</li>
<li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+neuroscience+research%3A+is+it+a+rat+race%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models%2C+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li>
<li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).</li>
<li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+vigilance+in+rats%3A+task+validation+and+effects+of+age%2C+amphetamine%2C+and+benzodiazepine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li>
<li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li>
<li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+NeuroVirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li>
</ol>

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.

Dans ce protocole, nous avons établi un modèle d’infection par le VIH induite par EcoHIV chez les rats. Plus précisément, nous avons décrit une injection stéréotaxique bilatérale d’EcoHIV dans le cortex qui a réussi à instituer l’infection active par le VIH dans le cerveau de rat 7 jours après l’injection. De plus, nous démontrons que l’infection à EcoHIV chez le rat pourrait être un bon système biologique pour étudier les aspects clés de la MAIN. Huit semaines après l’infection par le Virus eco-HIV, les rats présentaien...

Les systèmes biologiques ont amélioré notre compréhension des troubles neurocognitifs associés au VIH-1 (HAND) et de leurs mécanismes neuronaux sous-jacents2. La détermination du système biologique le plus approprié pour une étude donnée dépend souvent de la question d’intérêt2. La limitation de la gamme de modèles animaux hôtes remet en question les études sur le développement de la maladie du VIH-1. Pour étudier la réplication virale et la pathogenèse du VIH-1, Potash et coll.3 ont créé un modèle murin d’infection active par le VIH-1, remplaçant la région codante de la glycoprotéine de l’enveloppe de surface du VIH, gp120, par la MLV gp80 écotrope, ce qui a conduit à une réplication virale réussie chez la souris4. Après des injections dans les veines de la queue chez des souris chimériques séropositives (EcoHIV), de nombreuses caractéristiques ressemblant à celles des personnes séropositives du VIH-1 (p. ex. lymphocytes et macrophages infectés, ciblés pour les réponses immunitaires antivirales, et inflammation3,5,6).
Bien que les souris et les rats soient tous deux membres des Muridés, les différences fondamentales entre les espèces peuvent influencer leur aptitude à répondre à des questions expérimentales spécifiques7. Par conséquent, l’extension du modèle d’infection EcoHIV aux rats (couramment utilisé dans les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs) serait avantageuse dans l’étude du neuroHIV. Par exemple, leur plus grande taille rend l’implantation de cathéter jugulaire pour les procédures d’auto-administration de médicaments plus pratique8. Des techniques d’auto-administration de médicaments chez le rat ont été utilisées pour évaluer la motivation dans le VIH-19. En outre, de nombreuses tâches neurocognitives / comportementales ont été initialement conçues pour les rats10. Ici, nous rapportons l’utilisation des injections stereotaxic d’EcoHIV chez les rats pour prolonger le modèle d’infection d’EcoHIV et offrir une occasion clé d’adresser de nouvelles questions liées à neuroHIV et à HAND.

<table><tbody><tr><td>293FT cellules</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Solution antibiotique-antimycosique</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Corning BioCoatGelatin 75cm&sup2 ; Fiole rectangulaire de culture cellulaire à col incliné avec capuchon ventilé</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM avec L-glutamine, 4,5 g/L de glucose et de pyruvate de sodium Life</td><td>Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Verre de couverture</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>perceuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse Eppendorf Snap-Cap Biopur Safe-Lock Tubes</td><td>Life Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Plus Antibactérien, 4-0 Polyglactin 910 Suture, 27 po. FS-2</td><td>Med Vet International</td><td>VCP422H</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Lipofectamine 3000 Réactif de transfection</td><td>Life Technologies</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Pince à iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA p24 associé aux lentivirus</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur Lenti-X</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum Réduit Technologies</td> de <td>Moyenne Durée de Vie</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>appareil stéréotaxique</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modèle 900</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154 %</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle de rat d’infection cérébrale ecohiv

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Il a été bien étudié que le modèle murin infecté par EcoHIV est d’une grande utilité dans l’étude des complications neurologiques associées au VIH. L’établissement du modèle de rat infecté par le VIH ecoHIV pour les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs serait bénéfique dans l’étude des troubles neurocognitifs associés au VIH-1 et au VIH-1 . Dans la présente étude, nous démontrons la création réussie d’un modèle de rat d’infection active par le VIH à l’aide du VIH chimérique (EcoHIV). Tout d’abord, la construction lentivirale d’EcoHIV a été emballée dans des cellules cultivées de 293 FT pendant 48 heures. Ensuite, le milieu conditionnel a été concentré et titré. Ensuite, nous avons effectué des injections stéréotaxiques bilatérales de l’EcoHIV-EGFP dans le tissu cérébral du rat F344/N. Une semaine après l’infection, des signaux de fluorescence EGFP ont été détectés dans le tissu cérébral infecté, indiquant que EcoHIV induit avec succès une infection active par le VIH chez les rats. En outre, immunostaining pour le marqueur microglial de cellules, Iba1, a été exécuté. Les résultats ont indiqué que la microglie était le type prédominant de cellules hébergeant EcoHIV. En outre, les rats d’EcoHIV ont montré des changements du traitement temporel, un mécanisme neurobehavioral fondamental potentiel de main aussi bien que le dysfonctionnement synaptique huit semaines après infection. Collectivement, la présente étude étend le modèle EcoHIV de l’infection par le VIH-1 au rat offrant un système biologique précieux pour étudier les réservoirs viraux du VIH-1 dans le cerveau ainsi que la MAIN et les comorbidités associées telles que l’abus de drogues.

Le milieu conditionné a été recueilli à partir du lentivirus des cellules 293FT infectées par EcoHIV-EGFP. Ensuite, il a été concentré et titré, puis injecté stéréotaxiquement dans le cerveau (région corticale) des rats F344/N. Sept jours après l’injection, des rats ont été sacrifiés et des images ont été prises des tranches coronales de cerveau s’étendant du bregma 5.64 millimètres au bregma -4.68 millimètres. Sur la figure 1A,il existe des signaux EcoHIV-EGFP significatifs dans tout le cer...

Nous présentons ici un protocole visant à établir un nouveau modèle d’infection active par le VIH chez les rats à l’aide du VIH chimérique (EcoHIV), qui est essentiel pour améliorer notre compréhension des réservoirs viraux du VIH-1 dans le cerveau et offrir un système pour étudier les troubles neurocognitifs associés au VIH et les comorbidités associées (c.-à-d. l’abus de drogues).

Un modèle de rat d’infection cérébrale EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

En utilisant des rats, ce protocole peut être utilisé pour établir un nouveau modèle d’infection active par le VIH à l’aide du VIH chimérique. chez les rats, l’établissement du modèle d’infection EcoHIV pour les études sur l’abus de drogues et les troubles neurocognitifs pourrait être bénéfique pour l’étude des troubles neurocognitifs associés au VIH et au VIH-1. La démonstration de la procédure sera Hailong Li, un associé de recherche de mon laboratoire.Pour l’emballage du virus en 293 lymphocytes T, ensemencez cinq fois 10 à la cinquième 293 lymphocytes T par millilitre de DMEM complétés par 10% fbs dans chacun des deux flacons de 75 centimètres carrés enduits de gélatine et incuber les cellules à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cultures atteignent 50% de confluence. Le jour de la transfection, diluer 22,5 microlitres de réactif de transfection dans 750 microlitres de milieu par fiole dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et vortex la solution pendant trois secondes. Diluer 20 microgrammes de l’ADN plasmidique chimérique EcoHIV dans 750 microlitres de milieu dans un deuxième tube microcentrifuge de 1,5 millilitre par flacon avec un mélange complet.Mélanger l’ADN dilué avec le réactif de transfection dilué avec un mélange doux et incuber la solution résultante pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter chaque suspension virale à 10 millilitres de milieu DMEM d’avant-guerre et ajouter chaque solution complétée par le virus à une fiole de 293 lymphocytes T. Après deux jours de culture cellulaire, regrouper le surnageant des fioles dans un seul tube conique de 50 millilitres pour la centrifugation et transférer le surnageant clarifié dans un nouveau tube de 50 millilitres.Ajoutez huit millilitres de concentrateur Lenti-X au surnageant clarifié et mélangez avec une inversion douce. Après une incubation de deux jours à quatre degrés Celsius, centrifuger le mélange et retirer soigneusement le surnageant, puis ressusciter doucement le granulé avec 100 microlitres de PBS 100 millimolaires et utiliser un kit ELISA P24 pour titrer la concentration de virus. Pour l’injection EcoHIV-EGFP, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, rasez les cheveux de la région du cerveau et stérilisez la peau exposée deux fois avec de l’éthanol à 70% et un gommage à base de chlorhexidine.Fixez le rat en position couchée dans un appareil stéréotaxique et faites une incision de cinq à six centimètres à travers la peau le long de la ligne médiane du cuir chevelu. Marquez une position de forage à 0,8 millimètre latéral et une position rostrale de 1,2 millimètre à bregma et percez un trou de 0,4 millimètre de diamètre à chaque position du crâne. Chargez 1,04 fois 10 jusqu’aux sixièmes unités de transduction par millilitre de solution de lentivirus EcoHIV titré dans une seringue d’injection de 10 microlitres et fixez la seringue à l’appareil stéréotaxique.Déplacez l’aiguille près de la surface d’un trou de forage et insérez l’aiguille de 2,5 millilitres dans le trou. Infuser un microlitre de solution virale à raison de 0,2 microlitres de virus par minute. Lorsque tout le virus a été injecté, laissez l’aiguille à l’intérieur de la zone d’injection pendant cinq minutes avant de rétracter lentement l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit à l’extérieur du crâne du rat.Fermez l’incision de la peau avec une suture de fil de soie 4-0 et stérilisez la solution avec de l’éthanol à 70%, puis placez le rat dans une chambre de récupération avec un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à la réamence. Une à huit semaines après la perfusion virale, après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, fixer le rat dans une position couchée sur le décubitus dorsal à l’intérieur d’une hotte et inciser la peau le long de la ligne médiane thoracique. Coupez le diaphragme pour ouvrir la cavité thoracique et insérez une aiguille de calibre 20 par 25 millimètres dans le ventricule gauche.Ouvrez immédiatement l’oreillette droite avec des ciseaux et parcourez 50 millilitres de PBS 100 millimolaires pré-refroidis à un débit de cinq millilitres par minute. Lorsque tout le PBS a été livré, perfuser avec 100 millilitres de paraformaldéhyde froid à 4%. Lorsque tout le fixateur a été délivré, retirez le cerveau du crâne et fixez le tissu pendant la nuit dans du paraformaldéhyde frais à 4%.Le lendemain matin, placez l’échantillon dans 40 millilitres de saccharose à 30% dans du PBS 100 millimolaires dans un tube de 50 millilitres pendant environ trois jours jusqu’à ce que le cerveau se dépose au fond du tube avant de casser le tissu cérébral dans du butanol méthylique pendant deux minutes à moins 80 degrés Celsius. Après la congélation, utilisez un cryostat à moins 20 degrés Celsius et un pinceau fin pour acquérir des sections coronales de 50 microns d’épaisseur. Lorsque toutes les sections ont été obtenues, couvrez les échantillons avec 300 microlitres de milieu anti-fondu et montez-les avec 22 lamures de 50 millilitres.Lorsque le milieu a séché, imagez les sections par microscopie confocale. Sept jours après l’injection de Lentivirus, les images coronales de tranche cérébrale de rat indiquent une présence significative des signaux EcoHIV-EGFP dans tout le tissu cérébral, en particulier dans le cortex et le gyrus dentelé hippocampal. Le double étiquetage avec et les sondes Iba1 et EcoHIV-EGFP fournit des preuves solides que la microglie est le type de cellule prédominant hébergeant l’expression d’EcoHIV dans le cerveau.Huit semaines après l’infection, les animaux injectés par EcoHIV présentent une relative insensibilité à la manipulation de l’intervalle interstimulus, comme en témoigne une fonction d’intervalle relativement plus plate par rapport aux témoins salins. En outre, les rats injectés ecoHIV montrent des changements profonds dans leur morphologie dendritique d’épine comme en témoigne une fréquence relative accrue des épines dendritiques plus courtes avec des diamètres accrus de tête et de cou par rapport aux animaux témoins. La concentration et le titrage du milieu de condition avant l’injection stéréotaxique sont essentiels pour assurer des résultats cohérents et reproductibles à travers les expériences.Cette injection stéréotaxique régionale spécifique d’EcoHIV fournit une infection efficace par le VIH dans le cerveau et produit des déficits de traitement temporel chez les rats. L’utilisation d’injections stéréotaxiques de VIH chez le rat pour étendre le modèle d’infection EcoHIV offre une occasion clé de répondre à de nouvelles questions liées au neuro-VIH à portée de main.

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